关注今日：1 | 主题：387095
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【原创】WESTERN BLOT蛋白灰度分析总结
页码直达：
这个帖子发布于4年零118天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近苦于WB结果很不理想，蛋白样品的内参总是无法配平，故仔细研究了下western blot蛋白灰度分析软件，希望通过分析内参灰度来配平。在师兄的指导和自我探索下学习了些蛋白灰度分析的方法，虽然只是皮毛，希望和园友分享下，如果有错误或误解请大胆指出，你们的回复和建议是我前进的动力~~~谢谢！！PDF版见
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
freecell edited on
收起全部有料回复
并且我们做WB实验,一直先定量分析,我们一般用的BSA法定量,然后算的相应蛋白量.最后SDS-凝胶电泳,内参很齐,这样一来就省了LZ的方法，一边WB就行。这种实验方法，我们实验室最常用！LZ新手，可以考虑先定量后跑电泳，省时省力。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
多年做western的经验，要保持内参的一致性。首先做到，1、保持样品量的一致性，所以要称取样品量；2、匀浆后的蛋白样品要测浓度，上样浓度保持一致；3、可先跑完SDS胶后，胶考马斯亮蓝染色，脱色后评估条带的蛋白含量。 前面的步骤不能省略，不然后面调内参实在太痛苦。 另，蛋白样品浓度不是越高越好，不然调整一微升就差好多微克。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
图示过程：
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
好贴，学习了，谢谢楼主！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
呵呵，感谢分享！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
正要用啊，非常及时，非常感谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
很仔细。收藏了。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
正要用，呵呵，谢啦
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
留个脚印，以后用...感谢楼主
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我以前一直用Image J 感觉还行.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
并且我们做WB实验,一直先定量分析,我们一般用的BSA法定量,然后算的相应蛋白量.最后SDS-凝胶电泳,内参很齐,这样一来就省了LZ的方法，一边WB就行。这种实验方法，我们实验室最常用！LZ新手，可以考虑先定量后跑电泳，省时省力。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
wsjiangzi 并且我们做WB实验,一直先定量分析,我们一般用的BSA法定量,然后算的相应蛋白量.最后SDS-凝胶电泳,内参很齐,这样一来就省了LZ的方法，一边WB就行。这种实验方法，我们实验室最常用！LZ新手，可以考虑先定量后跑电泳，省时省力。谢谢你的回复，我之前一直用THERMO的BCA试剂盒配平蛋白，可是发现我的蛋白样品的内参（GAPDH)在相同上样量的情况下始终不能完全配平或一致（我提了两次蛋白，测了四五次BCA但内参仍不一致，如图），为此才想法通过分析灰度来使内参一致，如果大家有更好的办法请告诉我，谢谢你们的帮助~~
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
你好，我这几天正想用这个WB做定量，我想请问一下这个软件可以从网上下载吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
bacmid 你好，我这几天正想用这个WB做定量，我想请问一下这个软件可以从网上下载吗？我的这3三种软件是一位老师我给我的，其中：image J可直接从网上下载，该软件完全免费，IPP我可以发给你网盘地址（(，解压后ipwin32是主程序，提取码），quantity one不清楚~~
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
好东西，正要用，mark下，多谢楼主
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
zjy318 我的这3三种软件是一位老师我给我的，其中：image J可直接从网上下载，该软件完全免费，IPP我可以发给你网盘地址（(，解压后ipwin32是主程序，提取码），quantity one不清楚~~非常感谢，那个Image-P我把提取码输进去它说文件分享者没有分享该文件，我给你个邮箱你发给我可以吗.com
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
mark，感谢分享！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
感觉不错，支持一个
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我习惯用photoshop做灰度分析，拿学位，得写论文吧，得做ppt吧，不会photoshop真是不行的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园版主
没用这些方法，我直接制造个数据就行了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
zjy318 我的这3三种软件是一位老师我给我的，其中：image J可直接从网上下载，该软件完全免费，IPP我可以发给你网盘地址（(，解压后ipwin32是主程序，提取码），quantity one不清楚~~我也是输进去之后显示“没有分享”，不知能否发到我邮箱里一份，谢谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
mARK下！！！学习了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
很有用，谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼主您好！我现在毕业急需这个软件，找了好久都找不到，麻烦给我也发一份好吗？非常感激！！！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
kerea 我也是输进去之后显示“没有分享”，不知能否发到我邮箱里一份，谢谢！遇到同样的问题，邮箱是，希望楼主也发我一份，谢谢。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
等一会慢慢看
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
拜托楼主，给我发一份软件呗，邮箱是
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼主能不能也发我一份，毕业在即老板要求要用这个分析，邮箱，万分感谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼主，也给我发一份 IPP的软件吧（），115网盘不能提取呀！感激不尽！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
IPP下载链接：
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
THX！再笨也会了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
非常详细，谢谢了！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
非常有帮助，非常感谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼主好人，为楼主赞一个
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园关注今日：26 | 主题：524266
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】投稿时 western blot结果的统计问题
页码直达：
这个帖子发布于9年零160天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
投稿时为使结果更明嘹，每张western blot结果都配一张定量结果柱状图，但审稿人要求加上标准误，并要求注明各结果间有无统计学差异。我有两个问题： 1、需要计算平均值和标准差(误)、并做统计学分析吗？实际上我们一般的做法是：重复几次实验后，选最能反映实验结果的图，只是一般定量(一般即可说明问题)，并不做统计学分析。看了很多文献，western blot图片定量的就不多，同时有平均值加标准误并展示统计学分析结果的更是少。2、如确实需要，不同处理值组之间有无差异用AVONA方法可以吗？请高手指点。
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
收起全部有料回复
jhb8342建议你再好好看看人民卫生出版社出版的《卫生统计学》第五版。先学习一下定义：标准误：样本“均数”的标准差，反映了样本“均数”间的离散程度。标准差：方差的算术根，描述数据分布的离散程度。如果数据不符合正态分布，或者不近似正态分布，两个都无法使用的，而不是你说的那一套。此时，统计检验也要用非参数检验，而不是t或者ANOVA。从定义看，标准误看的是“均数”的离散程度，而你实验得到的是数据的离散程度。给你举个例子（也是上面提到部编教材里的例子）：欲了解某地五年级儿童的IQ，第一次研究随机抽取200名，得到均数108.2，第二次研究抽取200名，得到105.8，第三次抽取200名，得到107.6。如果研究总体情况，那就是（108.2+105.8+107.6）/3，这个时候要用标准误。因为这个研究设计到的是“均数”的离散程度。组成最终均数的也是均数回到楼主的问题上来，组成均数的是一个个原始数值，而不是均数，研究的是数值的离散程度而不是均数的离散程度。国外虽然有这本生物统计学书，但搞实验生物学的人不是必须要学习的。而且也有很多人学了并不理解。你所说的“国际上通用的表示平均数的方式就是 M +- SE. ”也是你的理解吧，有机会找几个研究生物统计的聊聊，看看他们会不会支持你。国内外很多文献都是SE SD乱用，所以我才说搞生物的人很多不懂统计。多读几篇文献，你甚至会发现严重偏态分布的数据也有人用t检验。甚至有些人故意用SE，因为可以显得数据漂亮，实验做的好
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
不知道你看的文献是中文还是外文的，反正我看到的文献大部分是要根据条带的灰度定量的。1. 如果你从多次实验中挑一张，那么人为左右实验结果的可能性就很大。所以一般要从重复实验的照片中，随机挑选3-5张（出现条带太浅或者背景太深的一般我都扔了），扫描，软件分析灰度，需要检测蛋白的灰度比内参灰度，归一化处理后，就可以得到一个平均值和标准差。如果只是对蛋白定性，或者看看有没有活化剪切条带出现，那当然不用做定量了。如果条带的深浅天壤之别，那也不需要定量了。2. 先用spss看看方差齐性，然后根据方差齐性，选择ANOVA里面的合适test进行检验
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
不知道你看的文献是中文还是外文的，反正我看到的文献大部分是要根据条带的灰度定量的。1. 如果你从多次实验中挑一张，那么人为左右实验结果的可能性就很大。所以一般要从重复实验的照片中，随机挑选3-5张（出现条带太浅或者背景太深的一般我都扔了），扫描，软件分析灰度，需要检测蛋白的灰度比内参灰度，归一化处理后，就可以得到一个平均值和标准差。如果只是对蛋白定性，或者看看有没有活化剪切条带出现，那当然不用做定量了。如果条带的深浅天壤之别，那也不需要定量了。2. 先用spss看看方差齐性，然后根据方差齐性，选择ANOVA里面的合适test进行检验
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
sykes 不知道你看的文献是中文还是外文的，反正我看到的文献大部分是要根据条带的灰度定量的。1. 如果你从多次实验中挑一张，那么人为左右实验结果的可能性就很大。所以一般要从重复实验的照片中，随机挑选3-5张（出现条带太浅或者背景太深的一般我都扔了），扫描，软件分析灰度，需要检测蛋白的灰度比内参灰度，归一化处理后，就可以得到一个平均值和标准差。如果只是对蛋白定性，或者看看有没有活化剪切条带出现，那当然不用做定量了。如果条带的深浅天壤之别，那也不需要定量了。2. 先用spss看看方差齐性，然后根据方差齐性，选择ANOVA里面的合适test进行检验感谢您的回复。可能我没讲清楚，我们的通常作法是：根据变化趋势挑选能反映结果的照片(一张)进行了扫描分析灰度、定量，用柱状图给出目的蛋白与内参的比值(当然没有标准差)。如您所说的方法应该更科学些，但我的疑问是今后确实需要全部都算出均值和标准差吗？看了千篇以上英文文献，大部分是不定量的(其中有些可能是因为条带深浅差别显著而不需要吧)。另外，柱状图给出的值是均值和标准差还是标准误？(已在园子里搜索，但除了搞清了概念外，无明确答案)
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
应该是用标准差，因为搞生物的人很多不懂统计，所以有用标准误的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
还有一个问题，给出变化的相对比值、如设定药物作用前目的蛋白和内参的比值为1、作用后变为0.5，而不列出计算结果的绝对值如药物作用前 两者比值为80%、作用后变为40%
似乎更好吧？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
sykes 应该是用标准差，因为搞生物的人很多不懂统计，所以有用标准误的。似乎不是这样的吧!怎么能说搞生物的人很多不懂统计呢?国外有一本很好的教材&&生物统计学导论&& (An Introduction to Biostatistics),搞生物的人都应该要学习的!关于标准差和标准误,个人认为使用标准误是更为准确的.当我们做试验时,如果做的次数足够多,试验结果应该是呈正态分布的,而且根据这足够多的数据我们可以算出总体的平均数,方差等.然而在实际操作中,我们不可能做足够多次,但是我们基于的假设仍然是我们试验结果呈正态分布从而进行统计分析.那么在这种情况下,我们无法得知总体的参数(主要是平均数,方差),我们将自己几次试验看作一个来源于上述总体的一个样本,将这个样本的平均数和方差近似的认为是总体的平均数和方差,由此在进行统计分析的时候,关键的统计数由
t. Z就是标准的正态分布,而t就是所谓的Student's t分布,而我们采用SPSS进行统计分析的时候大多采用后者.由于t值是根据标准误计算而来,所以目前,国际上通用的表示平均数的方式就是 M +- SE.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
jhb8342建议你再好好看看人民卫生出版社出版的《卫生统计学》第五版。先学习一下定义：标准误：样本“均数”的标准差，反映了样本“均数”间的离散程度。标准差：方差的算术根，描述数据分布的离散程度。如果数据不符合正态分布，或者不近似正态分布，两个都无法使用的，而不是你说的那一套。此时，统计检验也要用非参数检验，而不是t或者ANOVA。从定义看，标准误看的是“均数”的离散程度，而你实验得到的是数据的离散程度。给你举个例子（也是上面提到部编教材里的例子）：欲了解某地五年级儿童的IQ，第一次研究随机抽取200名，得到均数108.2，第二次研究抽取200名，得到105.8，第三次抽取200名，得到107.6。如果研究总体情况，那就是（108.2+105.8+107.6）/3，这个时候要用标准误。因为这个研究设计到的是“均数”的离散程度。组成最终均数的也是均数回到楼主的问题上来，组成均数的是一个个原始数值，而不是均数，研究的是数值的离散程度而不是均数的离散程度。国外虽然有这本生物统计学书，但搞实验生物学的人不是必须要学习的。而且也有很多人学了并不理解。你所说的“国际上通用的表示平均数的方式就是 M +- SE. ”也是你的理解吧，有机会找几个研究生物统计的聊聊，看看他们会不会支持你。国内外很多文献都是SE SD乱用，所以我才说搞生物的人很多不懂统计。多读几篇文献，你甚至会发现严重偏态分布的数据也有人用t检验。甚至有些人故意用SE，因为可以显得数据漂亮，实验做的好
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
多谢大家的指点!还有结果表示应是：均值Mean加减 SEM(standard error of mean)、SE(standard error)还是SD(standard deviate)?看了文献，三个都有。多谢!
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
cox2wj edited on
能被reviwers接受的统计学方法就是对的.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
jaam 能被reviwers接受的统计学方法就是对的.此话不假，但难道真的只能从上述三种表述中选一种，碰运气了吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
嗯，真是高手如云啊。不过，最近看了几篇BRC上的文章，确实是SD和SEM在一篇文章中混用的呢。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
标记一下，学习了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
sykes jhb8342建议你再好好看看人民卫生出版社出版的《卫生统计学》第五版。先学习一下定义：标准误：样本“均数”的标准差，反映了样本“均数”间的离散程度。标准差：方差的算术根，描述数据分布的离散程度。如果数据不符合正态分布，或者不近似正态分布，两个都无法使用的，而不是你说的那一套。此时，统计检验也要用非参数检验，而不是t或者ANOVA。从定义看，标准误看的是“均数”的离散程度，而你实验得到的是数据的离散程度。给你举个例子（也是上面提到部编教材里的例子）：欲了解某地五年级儿童的IQ，第一次研究随机抽取200名，得到均数108.2，第二次研究抽取200名，得到105.8，第三次抽取200名，得到107.6。如果研究总体情况，那就是（108.2+105.8+107.6）/3，这个时候要用标准误。因为这个研究设计到的是“均数”的离散程度。组成最终均数的也是均数回到楼主的问题上来，组成均数的是一个个原始数值，而不是均数，研究的是数值的离散程度而不是均数的离散程度。国外虽然有这本生物统计学书，但搞实验生物学的人不是必须要学习的。而且也有很多人学了并不理解。你所说的“国际上通用的表示平均数的方式就是 M +- SE. ”也是你的理解吧，有机会找几个研究生物统计的聊聊，看看他们会不会支持你。国内外很多文献都是SE SD乱用，所以我才说搞生物的人很多不懂统计。多读几篇文献，你甚至会发现严重偏态分布的数据也有人用t检验。甚至有些人故意用SE，因为可以显得数据漂亮，实验做的好 很好
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园准中级站友
很好, 学习了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
不是很懂，继续学习
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园分享给朋友：把视频贴到Blog或BBS&&通用代码: <input id="link4" type="text" class="form_input form_input_s" value="" />复 制flash地址: 复 制html代码: <input type="text" class="form_input form_input_s" id="link3" value="" />复 制分享视频到站外获取收益&&手机扫码分享视频二维码2小时内有效western blot之数据分析下载至电脑扫码用手机看用或微信扫码在手机上继续观看二维码2小时内有效western blot之数据分析扫码用手机继续看用或微信扫码在手机上继续观看二维码2小时内有效，扫码后可分享给好友没有优酷APP？立即下载请根据您的设备选择下载版本
药品服务许可证(京)-经营-
节目制作经营许可证京字670号
请使用者仔细阅读优酷、、
Copyright(C)2016 优酷
不良信息举报电话:Western blot经验大盘点，有这一篇就够了
Western blot经验大盘点，有这一篇就够了
作者：解螺旋.子非鱼转载需授权注来源：解螺旋，医生科研助手Western blot(蛋白印迹)作为科研研究中最为平常的实验，却蕴含了很多知识，可谓是小实验里却有大文章。尽管绝大多数研究僧在接触该实验时都会被虐的体无完肤，却也在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少经验。正所谓前人种树，后人乘凉，现在小鱼就把各位前辈做WB的各种经验总结起来，希望对大家能有所帮助。&WB的基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。依其原理，可分为两种方法：A、直接法和B、间接法。两种的方法的优缺点比较：WB的一般流程：&1蛋白的提取好的蛋白是WB成功的一半经验总结：1：合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。2：尽量除去核酸，多糖，脂类等干扰分子3：提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。4：蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。5：蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。&2电泳凝胶浓度与蛋白分离范围经验总结：1：上样时：根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。2：胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。3：为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参（一般指由管家基因编码表达的蛋白）。4：为了确保western blot结果的准确性和特异性，设置合适正确的对照是必不可少，一般需要设置的对照如下——阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性；内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。&3转膜（western blot成败的关键）用于western blot的杂交膜主要有两种：NC膜和PVDF膜，可依据目的蛋白与膜的结合能力及膜的孔径来挑选不同的转移膜。两个膜之间的比较：转膜方法：分为两种湿转法和半干法经验总结：1：胶在负极，膜靠近正极；滤纸不要大过膜，防止短路；2：夹好膜和凝胶后，确定在凝胶、膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。3：注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。4：转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常 会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。5：对于湿转法：一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的&50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。4免疫印迹经验总结：1：常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液（生物试剂公司提供）。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5%BSA会比5%牛奶的效果好。2：选择抗体时，一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。5WB结果定量分析WB做完后，有时需要对结果进行定量。然而最备受推崇的定量分析软件Quantiy One软件因其高昂的售价令很多人望而却步，但除了该软件外还有一个比较简单的图像处理软件ImageJ可以很方便的进行灰度和密度分析。ImageJ的软件界面1.ImageJ对WB条带进行灰度分析1）File|Open打开WB结果图片2）图片类型设置：Image|Type|8bit3）去除图片背景：Process|Subtract& Background在Subtract Background窗口按照以下条件进行设置：4）设置定量参数：Analyze |SetMeasurements,点击Area，Mean Gray Value及Integrated Density5）设置单位: Analyze|SetScale,在“unit of length”的方框里输入“pixels”6）将图片转换成亮带，Edit|Invert7）选择Freehand Selection,尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值8）复制数据IntDen进行分析&2.&Image J 对WB条带进行密度分析1）步骤同前，File|Open打开WB结果图片2）如果条带不正，需修正Image transform rotate调节angle值，直到条带水平为止3）选中矩形选项，圈中第一个条带，AnalyzeGels Select Firstlane（快捷键Ctrl
1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，Analyze Gels Select Second Lane（快捷键Ctrl 2）,最后Analyze GelPlotlanes选中直线工具，将开口的波峰关闭选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值即为相对密度。&6WB疑难杂症&
发表评论：
TA的最新馆藏[转]&