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RNA提取实验操作步骤注意事项及问题指南
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恒温振荡器具有的功能及应用领域
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重庆地区HCV基因亚型分布状态的初步研究
作者：张帆，王小红，王宇明，熊瑜琳，陈嵩，谭朝霞
【关键词】& 丙型肝炎病毒
&&& Distribution status of hepatitis C virus subtypes in Chongqing: A preliminary study
　　ZHANG Fan, WANG XiaoHong, WANG YuMing,& XIONG YuLin, TAN ZhaoXia
　　Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China
　　【Abstract】 AIM:& To investigate the distribution status of hepatitis C virus subtypes in Chongqing region. METHODS: Serum specimens investigated in this study were obtained from 77 patients whose antiHCV and HCV RNA were positive. A reverse transcriptase PCR (RT PCR) assay using conserved primers deduced from the coreenvelope 1 (CE1) region of the hepatitis C virus (HCV) genome was employed to amplify a 474 nucleotidelong fragment. Phylogenetic analysis of the CE1 sequences was obtained by direct sequencing of the RTPCR products and alignment with published HCV subtypes of GenBank. RESULTS: All the electrophoretic fragments of HCV genotyping were positive. Subtypes of all the samples were determined by nucleotide sequencing followed by composition of a phylogenetic tree. It was demonstrated that there were five different subtypes of HCV in Chongqing region, i.e. 1b, 29 cases (38%), 2a, 10 cases (13%), 3a, 12 cases (16%), 3b, 11 cases (14%), 6a, 15 cases (19%). Two previously reported subtypes, 1a and 2b, were not found. CONCLUSION: The diversity of HCV subtypes in Chongqing region appears，including 1b，2a，3a，3b，6a. HCV subtype 1b is most common ，with the certain proportions of subtypes 2a, 3a, 3b and 6a.
　　【Keywords】 Hepatitis C G S P Chongqing
　　【摘要】 目的： 探讨重庆地区HCV流行的基因亚型分布状态. 方法：77份抗HCV抗体和HCV RNA均阳性的血清标本，分别提取HCV RNA，通过逆转录巢式PCR（RT nestedPCR）扩增C基因的羧基端至E1基因的氨基端长度为474 bp的片段，测定其核苷酸序列，与GenBank中已知的HCV序列进行系谱分析，确定HCV基因亚型. 结果： 77份HCV感染者血清标本通过RTnested PCR检测均获得阳性条带，该方法特异性和敏感性均较好. 序列与系谱分析显示1b 29例，占38%，2a 10例，占13%，3a 12例，占16%，3b 11例，占14%，6a 15例，占19%，未见1a和2b型. 结论： 重庆地区HCV流行的基因亚型有1b，2a，3a，3b，6a五种，1b为流行的主要基因亚型. 2a，3a，3b和6 a型均占相当比例，初步说明重庆地区HCV流行的基因亚型呈现多样性.
　　【关键词】 丙型肝炎病毒；基因分型；亚型；系谱分析；重庆
　　丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）是丙型肝炎的致病体，丙型肝炎是世界范围内的重要传染病之一. 由于HCV 的病毒动力学转换速度极快，每一个体每天可产生1×1012病毒体，同时其RNA聚合酶缺乏校正功能，HCV基因呈现高度的变异性，呈现不同的基因型、亚型、准种和不同毒株. 据研究报道［1］，不同地区HCV的流行株是不同的，可能与HCV的来源、人种、传播途径不同有关，不同的基因型对流行病学、疫苗研制、临床抗病毒治疗、预后等方面有着明显影响. 我们采用基因分型的金标准法对重庆地区77例HCV感染者进行了基因分型，以了解重庆地区HCV流行的基因型分布状态，为HCV的体外模型构建、疫苗研制策略及抗病毒治疗提供依据.
　　1对象和方法
　　1.1对象
　　来自西南医院感染病科502门诊和住院患者53例，来自中医科001住院患者24例. 其中，男51例，女26例，年龄12~72岁，平均（34.4±21.6）岁. 所有患者丙型肝炎抗体检测阳性和HCV RNA定量检测均高于1×106copies/L，范围（5.651×106～3.909×1010）copies/L. 所有标本均于患者进行抗病毒治疗前收集，12 h内分离血清，-80℃贮存.
　　1.2主要试剂和仪器丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法，英科新创(厦门)科技有限公司），HCV核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（深圳市匹基生物工程股份有限公司），QIAamp viral RNA mini kit（Qiagen公司），MMLV Reverse Transcriptase、Taq DNA polymerase、Blue/Orange 6×loading Dye（Promega公司），dNTP（Bebco公司），RNaseout Ribonuclease Inhibitor（Recombinant）（Invitrogen公司），DEPC treated water（上海生工生物技术有限公司），GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus, readytouse（Fermentas公司）. 离心机采用日本Hitachi公司的日立55P72低温超高速离心机，去离子水采用美国Millipore公司的MilliQ plus超纯水仪制造，PCR反应采用美国MJ RESEARCH公司的PTC225 Peltier Thermal Cycler热循环仪，成像采用美国BioRad 公司的Gel Doc2000凝胶成像仪. 实验所需的全部耗材均用美国Axygen公司生产的去DNA酶和去RNA酶处理的耗材.
　　1.3方法
　　1.3.1引物设计以GeneBank中所有HCV全长序列为参照序列，参照文献［2］设计了4条引物，设计原则采用引物序列位于HCV所有基因型的相对保守区，尽量减少引物对某种基因型扩增的偏倚. 引物序列及位置见Tab 1，引物由上海生工生物技术有限公司合成. 扩增产物长度为474 bp，扩增序列位于C基因的羧基端至E1基因的氨基端（831nt1304nt）.表1HCV基因分型引物的序列和位置（略）
　　1.3.2HCV RNA抽提采用QIAamp viral RNA mini kit，按说明书操作. 在1.5 mL离心管中加入140 μL血清标本，然后加入560 μL裂解缓冲液 Buffer AVL（含Carrier RNA），振荡器上充分混匀，室温放置10 min，加560 μL乙醇，充分混匀，分两次将上述混合物加入到离心柱QIAamp spin column内，8000 g离心1 min，加入500 μL 洗脱缓冲液Buffer AW1，8000 g离心1 min，加500 μL 洗脱缓冲液Buffer AW2，13000 g离心3 min，置QIAamp spin column到新的1.5 mL离心管（预先加入1.5 μL RNaseout）上，加55 μL Buffer AVE，室温放置1 min，8000 g离心1 min 45 s，收集RNA，立即置于冰上，备用.
　　1.3.3逆转录巢式PCR扩增（RT nestedPCR）RT与第一轮PCR反应在同一试管中进行，反应体系为50 μL，含10×缓冲液5 μL，CE1ESP和CE1EAP各0.4 μmol/L，dNTP 0.2 m mol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，MMLV 1333.6 nKat，RNaseout 166.7 nKat，Taq酶25.0nKat，模板RNA 10μL，逆转录反应条件为42?C 50 min，然后直接进行PCR反应，94℃ 20 s, 58℃ 20 s 72℃ 30 s, 30个循环，最后72℃ 7 min. 取第一轮RTPCR扩增产物2 μL，进行第二轮PCR反应，反应体系为50 μL，含10×缓冲液5 μL，CE1ISP和CE1IAP各0.2 μmol/L，dNTP 0.2 m mol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，Taq酶25.0 nKat，反应条件同第一轮PCR的反应条件. PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳分析.
　　1.3.4PCR产物纯化和序列测定扩增的PCR产物由上海生工生物技术有限公司和上海博亚生物技术有限公司完成纯化和序列测定. 序列测定采用ABI公司的3700测序仪自动测序，测序引物为CE1ISP.
　　1.3.5系谱分析所得序列在分析前将引物序列去除. 采用BioEdit 5.0.9（Tom Hall；）软件进行序列装配及分析. 运用ClustalX version 1.83［3］ 进行序列排列. 采用DNADIST，NEIGHBOR，SEQBOOT和CONSENSE程序的运算法则推论系谱树，以NibleTree version 2.5（ NimbleTree）执行运算，以Tree View呈现系谱树. 系谱分析的参照序列GeneBank accession numbers： 1a M62321，1b D90208，1c D14853，2a D00944，2b D10988，2c D50409，2k ABa D17763，3b D49374，4a Y11604，5a Y13184，6a Y12083，6b D84262，7a D84263，8a D84264，9a D84265，10a D63821，11a D63822.
　　2.1RTnested PCR扩增77份血清标本经RTnested PCR扩增，凝胶电泳显示，在预期的位置474 bp处均获阳性条带，且未见非特异性扩增条带（Fig 1）. 每次实验均设有正常血清阴性对照以监测PCR污染的可能性. 阴性对照均未见阳性条带. 所有阳性的PCR产物均进行序列测定.
　　2.2HCV感染患者基因型的确定77例患者基因分型的系谱树（Fig 2）显示，77份标本HCV序列分别聚集于1b，2a，3a，3b及6a进化枝上，表明其与相应的进化枝具有相同的起源，由此获得1b 29例，占38%，2a 10例，占13%，3a 12例，占16%，3b 11例，占14%，6a 15例，占19%. 此外，系谱图还显示77份血清标本的序列相互间存在一定差异，进一步排除了标本处理及PCR过程中污染的可能性.
　　HCV属单股正链RNA病毒，其基因组具有明显的异质性，根据其核苷酸（nucleotide, nt）序列的差异，分为6个主要的基因型（30%~50% nt差异），50多个亚型（10%~30% nt差异）及不同的HCV分离株（5%~15% nt 差异）［4］. 不同基因型HCV 感染在地区分布、预后转归及对干扰素（IFN）治疗的反应性等方面存在一定差异. 因此, HCV 基因分型具有重要的临床和流行病学意义.
　　HCV基因分型方法已发展到数十种之多，其中最可靠的方法是序列分析法，即通过PCR扩增有代表性的基因片段，进行核苷酸序列测定，通过系谱分析，确定基因型，为HCV分型中的“金标准”［5］. 目前常用的其他HCV分型方法主要包括：型特异性探针杂交法、型特异性引物扩增法、限制性片段长度多态性分型法（restriction fragment length polymorphism, RFLP）、DNA酶免疫分型法(DEIA)及异源双链迁移分析法（HMA），这些基因分型方法均存在一定的局限性，如不能将目前确定的HCV 亚型全部分开,敏感性较低等. 本研究采用HCV分型的“金标准”法，结果显示该法的敏感性和特异性均较高， HCV RNA拷贝数低至5.651×106 copies/L的血清标本均获得阳性结果，系谱分析显示无一例污染序列. 本试验中所有标本均能用此法分出不同的亚型，说明该方法没有偏倚. 对HCV基因分型来说，采用PCR产物直接测序，只能得到优势株的序列，但是就临床来说，对于HCV患者的诊治是具有指导意义的. 该方法的局限性在于不能检测混合基因型感染，但如果获得的序列图谱在某些位点出现兼并碱基，也可提示存在混合感染的可能.
　　文献报道，HCV的基因型分布呈现明显的地域差异，如1a在美国、巴西和欧洲西北部占优势，1b型在远东、欧洲东西部和日本多见，2a和2b型多分布于亚洲和欧洲，4型多见于埃及［6］. 在我国HCV 1b和2a基因型较为常见，其中以1b型为主；某些地区有1a、2b和3b型报道；6型主要见于香港和澳门地区，在南方边境省份也可见此基因型［7］. 在我们的研究中，重庆地区主要流行的基因型为1b占38%，基因型 2a，3a，3b，6a各占了相似比例，没有发现1a与2b型. 与2002年刘斌［8］采用RFLP方法进行的重庆地区69例HCV血清的基因分型结果有所差异. 刘报导的主要基因型是1ｂ和2a，分别占36.24%和31.88%，其它基因型还有1a、2b、3a，另有9例未分型. 本实验结果显示重庆地区HCV流行的基因型较复杂，除了优势株外，其它基因型也较常见，可能和该地区吸毒人数增加及人口流动性增大、造成与其它地域的HCV基因型别相互交叉感染有关. 此外，在抗病毒治疗中，HCV基因分型也是作为预测治疗反应、确定疗程的重要依据. 不同基因型HCV感染者对干扰素的治疗敏感性有差异［9］. 基因型1，尤其是1b 亚型对干扰素治疗有抗性, 预后反应相对较差，治疗疗程应延长，非1型感染预后相对良好，治疗疗程可缩短，从而可减轻患者的经济负担.
　　综上，我们采用基因分型的“金标准”方法，初步研究了重庆地区的HCV基因型的分布状态，表明了重庆地区HCV流行的基因型主要为1b，同时存在2a，3a，3b，6a型，说明该地区基因型复杂，有必要在临床推广HCV基因分型的常规检测. 同时为今后HCV的体外模型构建（如1b型HCV复制子的构建）、疫苗研制策略及抗病毒治疗提供了依据.
　　【参考文献】
　　［1］ Tatsunori N, Ling L, Pengbo L, et al. Viral gene sequences reveal the variable history of hepatitis C virus infection among countries ［J］. J Infect Dis, ):.
　　［2］ Dale MN, Wang XH, Shruti HM, et al. Hepatitis C Virus (HCV) Core Antigen Assay To Detect Ongoing HCV Infection in Thai Injection Drug Users ［J］. J Clin Microbiol, ):.
　　［3］ Hall TA. BioEdit: A userfriendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT& ［J］. Nucl Acids Symp, -98.
　　［4］ Simmonds P. Viral heterogeneity of the hepatitis C virus［J］. J Hepatol, ):54 -60.　　［5］ Pawlotsky JM. Molecular diagnosis of viral hepatitis ［J］.Gastroenterology, ):.
　　［6］ Nizar N. Zein. Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes ［J］. Clin Microbiol Rev, ): 223 -235.
　　［7］ ［未写出作者］. 丙型肝炎防治指南［J］. 中华传染病杂志, ):194-198.&&&&&&&& 　　［ No authors listed ］ . Precaution and Treatment Gideline of Hepatitis C ［J］. Chin J of Infect Dis, ):194-198.
　　［8］ 刘斌,王宇明,谭朝霞. 重庆地区69例丙型肝炎病毒感染基因分型研究 ［J］. 重庆医学, ): 174-175.&& 　　Liu B, Wang YM, Tan ZX. Genotyping of 69 HCV infectious serum in Chongqing area［J］.& Chongqing Medical Joural, ): 174-175.
　　［9］ Doris BS,Teresa W, David LT, et al . Diagnosis, Management, and Treatment of Hepatitis C ［J］. Hepatology, ): .
　　基金项目：国家自然科学基金项目()
　　通讯作者：王小红. Tel. (023)Email.
　　作者简介：张帆(1977),女(汉族),四川省成都市人. 住院医师,硕士研究生(导师 王宇明，王小红). Tel. (023)Email.　　　(第三军医大学西南医院全军感染病研究所，重庆& 400038)
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若如初见°500
如果提RNA有基因组污染不是用不用剧烈震荡能解决问题的,得把提的RNA用DnaseI消化.根据我的经验,DNA污染与Trizol的种类和你的材料性质有关,一般提的RNA都要经过DnaseI消化以确保除净DNA.至于RT-PCR的引物你如果不会设就找个师兄师姐代设一下吧,没什么难度,主要注意点你可以上网查查.
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