孢子丝菌分子生物学DNA多态性分型研究--《中国第六届海峡两岸菌物学学术研讨会论文集》2004年
孢子丝菌分子生物学DNA多态性分型研究
【摘要】：目的:研究孢子丝菌DNA分型,并探讨DNA分型技术在临床菌钟鉴定以及流行病学中的应用。方法:本实验采用氯化苯法提取DNA,以NS_5、NS_6为引物用随机扩增DNA多态性(DAPD)方法对临床分离的30株孢子丝菌进行DNA分型。结果:30株孢子丝菌的DNA带型不完全相同,具有一定的遗传变异性。30株临床分离的孢子丝菌可进一步分为4型,不同部位取材的菌株间及临床型不同的患者的菌株间DNA型基本相同。结论:随机扩增DNA多态性研究发现孢子丝菌具有一定的种内差异,该方法可将临床分离的孢子丝菌分为4型,本研究对病原学诊断探讨感染来源,传播途径等流行病学研究奠定了基础。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R346【正文快照】：
我们对孢子丝菌随机扩增DNA多态性分型研究,将对该菌的分类、鉴定、分子流行病学、发病机理的探讨具有重要意义.现将研究结果报告如下:l材料和方法1.1 材 料1.1.1试验菌种 标准菌株:由北京大学真菌研究中心提供. 试验菌株:在病人皮损患处采集. 引物:采用RAPD法。使用一对引物
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分子生物学实验
分子生物学技术是科学研究的有力工具，是现代生物学发展的主要动力之一，是当今前沿领域不可或缺的组成。分子生物学技术被普遍应用，但操作要求精度高、过程十分枯燥，结果相对不确定，极大地耗费了科研人员的精力及时间。赫贝生物费时三年打造完整的分子生物学平台，提供专业的分子生物学外包服务，包括基因克隆、载体改造、RNA干扰、实时荧光定量PCR、免疫共沉淀、双荧光素酶基因报告、凝胶迁移实验、Western Blot、Northern Blot、SNP分型检测、甲基化检测、各类罕见样本的DNA、RNA与蛋白抽提及优化、基因芯片数据分析等，涵盖了从DNA到RNA到蛋白质的整个分子生物学研究过程。&荧光定量PCR（周期：2-3周）&实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。&Northern Blot印迹杂交检测（周期：2-4周）&Northern blot印迹杂交是DNA/RNA的杂交，它是一项用于检测特异性RNA的技术，RNA混合物首先按照它们的大小和相对分子量通过变性琼脂糖凝胶电泳加以分离，凝胶分离后的RNA通过southern印迹转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与标记的探针进行杂交反应，通过杂交结果分析可以对转录表达进行定量或定性。赫贝Northern Blot服务，基于地高辛探针标记，相对于同位素和生物素探针，具有无污染、信噪比适中，背景低等优点，公司Norther Blot服务平台对外开放以来，陆续解决了RNA抽提、样品处理、探针设计与标记等技术难题，实验水平大幅提高，实验成功率也趋于稳定，过去的一年中，赫贝生物帮助客户检测了动物细胞、组织、植物组织、血液样本，成功帮助客户发表多篇文章。&SNP分型技术服务（周期：2-4周）&单核苷酸多态性single nucleotide polymorphism(SNP),个体间基因组DNA序列同一位置单个核苷酸变异(替代、插入或缺失)所引起的多态性。 不同物种、个体基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。这种差别的基因座，DNA序列等可作为基因组作图的标志。人基因组上平均约每1000个核苷酸即可能出现1个单核苷酸多态性的变化，其中有些单核苷酸多态性可能与疾病有关，但也可能大多数与疾病无关。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。&EMSA&凝胶/电泳迁移率实验（周期：2-4周）&EMSA实验的原理是基于DNA结合蛋白与DNA的特异性结合，依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗体等参照物，通过电泳迁移率的变化来进行定性和定量分析，赫贝提供的EMSA实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay 凝胶/电泳迁移率实验）基于生物素标记探针与对应的DNA结合蛋白的特异性结合，设计合理、科学的实验方案，为客户提供验证性的EMSA，竞争性的EMSA以及超迁移EMSA(Super-shift EMSA）实验服务。&核酸提取与纯化技术服务（周期：2-3周）&从细胞中提取基因组DNA和总RNA后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。赫贝可以从多种材料中提取基因组DNA和总RNA，由于不同种类的材料中提取的基因组DNA和总RNA量不同，甚至是新鲜程度不同的同一种材料，差异也比较大。&质粒抽提技术服务（周期：2-3周）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&质粒DNA质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒作为低等生物体内的最小遗传单位，具有分子量小、复制速度快等诸多优点，是分子生物学实验中不可缺少的工具载体。赫贝按照客户需求，可以提供多种类型的质粒DNA抽提服务，制备的质粒DNA没有RNA的污染，内毒素可低于50EU/mg，蛋白质小于3ug/mg质粒DNA，基因组DNA小于10ng/mg质粒DNA，OD260/OD280介于1.85-1.90之间，满足您的不同实验需要。&载体构建（周期：3-4周）&载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。但由于影响因素较多，对研究者经验要求较高，因而往往费时费力。赫贝依托自身强有力的技术服务平台，可为客户提供高效、快捷的载体构建服务。可构建的载体包括：原核表达载体、真核表达载体、shRNA/microRNA载体、病毒载体等。&RT-PCR反转录服务&（周期：2-4周）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&在进行目的蛋白的表达、构建表达载体等实验时，通常需要获得一段目的基因。我们可以根据您提供的已知参考序列（NCBI上已发表)，以基因组DNA或总RNA为模板，获取您所需要的某个区域的一段基因。&定点突变服务 （周期：2-4周）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&定点突变是分子生物学研究的核心技术，能够促进多个领域的研究，包括基因调控元件、DNA-蛋白相关作用、蛋白结构/功能关系、酶活中心及新型蛋白的研究。赫贝的定点突变服务运用了先进的基因合成技术和高保真聚合酶，能够提供点突变、缺失和插入等服务。&Western Blot（周期：2-3周）&蛋白质印迹（Western Blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品的某种蛋白表达情况的方法。该方法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术。常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。&双荧光素酶报告基因服务（周期：6-10周）&报告基因系统（Reporter Assay System）是现代分子生物学研究领域中分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具,它具有便捷、可靠、灵敏度高和适用于大规模检测等优点。同时，报告基因检测系统在功能基因组学研究、真核基因表达调控研究和相关药物或蛋白筛选工作中，有广泛的应用。报告基因的特点：全序列已测定或已被克隆；表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；其表达产物能进行定量测定。赫贝采用荧光素酶（Luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）作为报告基因，研发出分别以哺乳动物真核载体和慢病毒载体为基础的报告基因载体系列。&染色质免疫共沉淀（CHIP）（周期：5-6周）&染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。赫贝凭借先进的染色质免疫共沉淀技术平台，可为客户提供高质量的实验服务&DNA甲基化检测（周期3-4周）&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&DNA甲基化研究是表观遗传学的重要内容，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导基因的重新活化和表达。这种DNA修饰的方式在脊椎动物的胚胎发育过程中起着重要的调控作用，参与多种疾病包括各种肿瘤的发病机理，是目前表观遗传学研究的热点。&病毒包装& （周期：6-8周）&赫贝提供多种高滴度高纯度的重组病毒包装研发外包服务，包括DNA整合型慢病毒和非整合型慢病毒（Lentivirus）、各种血清型的腺相关病毒（AAV）2/1,2/2,2/3,2/4,2/5,2/6,2/7,2/8,2/9）和腺病毒(Adenovirus)等。&赫贝重组病毒研发外包中心提供病毒载体构建、扩增及纯化服务，包括了从实验设计到载体包装、生产、纯化、质量检定、分装等的一系列服务。建立了培养瓶（皿）、滚瓶、细胞发酵罐等培养细胞和扩增病毒的方法和工艺；建立了超滤和离子交换柱层析等多种纯化工艺方法；建立了系统的病毒载体质量控制和检定方法和流程。能够为基础研究、临床前研究和早期临床研究提供高滴度、高纯度的病毒载体。&其他服务项目1、引物设计服务2、基因合成服务3、菌种鉴定服务4、5'-RACE & 3'-RACE&cDNA末端快速扩增服务5、TA克隆服务6、突变文库构建服务&服务内容：动物模型复制:建有SPF级、清洁级动物实验室，可独立开展包括大小鼠、裸鼠、豚鼠、兔、比格犬、羊、小型猪等常见实验动物在内的动物造模（模型复制、活体成像、缺血再灌注、大鼠子宫内膜异位症模型、小型猪结石性脓肾模型、大鼠慢性肾衰模型、大鼠大部分肾切除慢性肾衰模型等）及相关实验（MRI、X光检测等），现已熟练掌握100余种不同类型动物模型的造模方法。组织病理学检查:HE染色、特殊染色、免疫组化、免疫荧光、TUNEL、原位杂交、透射电镜、扫描电镜等细胞生物学服务:原代细胞培养培养、细胞株、细胞转染、transwell、流式细胞仪检测、树突状细胞、干细胞培养、磁珠分选分子生物学检测:CRISPR/Cas9基因敲除技术服务、荧光定量PCR、激光共聚焦检测、病毒载体构建及包装、SNP分型技术服务、EMSA 凝胶/电泳迁移率实验服务、载体构建、定点突变服务、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因服务、WesternBlot、DNA甲基化检测等。
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&&&&&&实验教学大纲&&&分子生物学实验A（343006）教学大纲
分子生物学实验A（343006）教学大纲
发布时间： 16:17:26&点击次数:520
01．教学单位名称：生命科学学院02．实验中心名称：吉林大学国家级生物实验教学示范中心03．课程名称：分子生物学实验A04．课程代码：34300605．课程类别：学科基础课06．课程性质：必修07．课程学时：&6408．课程学分：&209．面向专业：生物科学、生物技术、唐敖庆班10．实验课程的教学任务、要求和教学目的10.1&教学任务本课程让学生运用已学过的知识验证一些结论、结果和现象，及综合运用已学过的理论知识设计实验或进行综合性的实验，巩固和加深对分子生物学课程中基本理论知识的理解，使学生对分子生物学方法的应用和意义有具体而全面的理解，训练学生理论知识的运用能力、实验操作技能、仪器仪表的使用能力、实验数据的处理和分析能力。10.2&教学要求要求学生在实验前认真听教师讲解，认真预习，掌握实验的基本原理、主要操作步骤和注意事项;实验中操作正确，观察细致，记录认真，能及时发现、分析和解决实验中出现的问题；实验后整理实验用品，正确书写实验报告，对实验结果进行分析讨论，按时参加课后总结与讨论从而将理论与实际联系起来，全面提高学生的综合素质。10.3&教学目的通过本课程的教学，使学生掌握现代分子生物学研究的基本知识、理论、方法、技术和技能。通过质粒载体与目的基因双酶切，琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶回收，质粒载体与目的基因的连接，感受态细胞的CaCl2法制备，重组DNA的转化，重组子的筛选和质粒DNA的抽提以及PCR法鉴定阳性克隆等实验过程，使学生掌握基因工程的核心内容、基本过程与实验技术，训练并培养学生的实际动手能力及发现、分析和解决问题的能力。利用分子生物学实验理论、技术与方法（含查资料获得的新知识），自己独立设计实验方案并完成填报设计实验申请书的全过程，培养学生查阅文献、手册、工具书和其它信息源的能力及各种文献整理的能力。从而促进学生对生命科学探索的兴趣和爱好、创新思维和科研素养的培养及综合素质的提高，为今后的毕业论文设计和从事专业相关领域工作奠定良好的基础。11．学生应掌握的实验技术及实验能力掌握DNA双酶切、连接，琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶回收、CaCl2法制备感受态细胞、重组DNA的转化和质粒抽提以及PCR法鉴定阳性克隆等实验技术和方法；掌握核酸芯片设计与制作、微阵列芯片检测与数据分析等实验技术与方法；DNA和RNA提取技术；PCR－RFLP法鉴定基因型技术；Southern印记杂交技术；动物转基因技术的实验原理；核酸探针制备技术。12．开设实验项目开设实验项目一览表实验项目编号实验项目名称实验类型实验性质实验学时每组人数首次开出年月重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建综合性必做422200803头发中抽提DNA并用PCR－RFLP法鉴定CYP2C9基因型综合性选做202200403蛋白质印迹分析综合性选做42200603DNA探针的制备和标记综合性选做162200403Southern印迹法综合性选做162200403&RNA&的&Northern&杂交综合性选做162200603真核生物cDNA文库的构建和分析综合性选做202200603电穿孔法转染哺乳动物细胞综合性选做162200603聚合酶链式反应-单链构象多态性检测（PCR-SSCP）综合性选做162200603PLPR启动子表达载体表达目的基因综合性选做202200603微生物基因组学分析综合性选做162200603荧光定量&PCR法鉴定CYP2C9基因型综合性选做162201409荧光定量PCR检测液体发酵杂菌污染综合性选做162201409琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段验证性选做41200903PCR扩增目的DNA片段验证性选做41200903蓝白斑筛选验证性选做41200903感受态细胞的制备验证性选做41200903毕赤酵母的cDNA文库的构建及分析设计性选做21200603人胰岛素基因在大肠杆菌中的克隆表达设计性选做21200603中国人群CYP2E1基因的主要多态性类别与抗结核药物代谢的关系设计性选做21200603注：设计性实验中学生可任选其一。重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建。主要内容包括限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ双酶切pUC18质粒和IL-18目的基因，琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收两个基因片段，在T4-DNA&ligase&作用下将两个回收片段连接，获得重组pUC&18-IL-18；CaCl2法制备E.coli&JM109感受态细胞，转化pUC&18-IL-18，用PCR法鉴定重组阳性克隆。头发中抽提DNA并用PCR－RFLP法鉴定CYP2C9基因型。主要内容包括从头发中抽提DNA，并用PCR扩增目的DNA片段，电泳检测后，进行限制性内切酶酶切，检测酶切位点，用PCR－RFLP法鉴定CYP2C9基因型。蛋白质印迹分析。主要内容包括主要内容包括将目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，目的蛋白质转移到纤维素膜上，考马斯亮蓝染色后观察、染色结果分析。DNA探针的制备和标记。主要内容包括利用大肠杆菌DNA聚合酶的3’外切核酸酶活性从5’末端切除核酸，同时在&DNA聚合酶的5’聚合酶活性的催化下将dNTP添加到切口的3’末端，5’末端核苷酸的去除与3’末端核苷酸的加入同时进行，导致切口随着DNA链移动由具有荧光素标记的核苷酸置换了原来的核苷酸，可合成具有荧光素标记的DNA探针。Southern印迹法。主要内容包括将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。RNA&的&Northern&杂交。主要内容包括RNA分离；将RNA固定到支持物上；固相RNA与探针分子杂交；对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。真核生物cDNA文库的构建和分析。主要内容包括以生物细胞的总&mRNA&为模板，用逆转录酶合成互补的双链&cDNA，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是&cDNA&文库。电穿孔法转染哺乳动物细胞。主要内容包括将盛有细胞和&DNA混合液的特制小容器置于电脉冲仪的正负电极之间，在&0&℃下加高压(2.0～4.0kV)电脉冲&10分钟后，将处理的细胞转移到新鲜培养基中生长&2天，再行筛选。聚合酶链式反应-单链构象多态性检测（PCR-SSCP）。主要内容包括以总RNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增出特异性好的产物，在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，染色后观察电泳结果。PLPR启动子表达载体表达目的基因。主要内容包括将IL基因以5'端EcoRI和3'端BamHI酶切位点插入pBV220载体多克隆位点中，转化到大肠杆菌JMl09内，便能通过温度的变换控制CI蛋白的活性，继而调节启动子的活性，使IL基因连同其5'端上游带SD序列转录成mRNA并转录终止于rrnB位点。微生物基因组学分析。主要内容包括在核酸芯片上固定不同细菌的探针，通过PCR扩增待测细菌的特定基因，并对PCR产物进行荧光标记，标记后的PCR产物与基因芯片进行杂交；用微阵列芯片CCD扫描仪对基因芯片进行扫描和数据分析，明确芯片上检测出的基因，进而推测出待测细菌类型。荧光定量&PCR法鉴定CYP2C9基因型。主要内容包括从口腔抽提DNA并进行检测，并用采用PCR法扩增CYP2C9DNA片段，电泳检测后，最后采用Real-time&PCR法进行突变位点的检测，鉴定CYP2C9基因型。荧光定量PCR检测液体发酵杂菌污染。主要内容包括对微生物进行液体发酵培养，取发酵液并对微生物进行分离。提取微生物DNA并进行荧光定量PCR。根据反应曲线判定染菌程度。琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。主要内容包括配制琼脂糖凝胶，利用水平电泳对不同分子量DNA片段进行分离。PCR扩增目的DNA片段。主要内容包括PCR使用技术。蓝白斑筛选。主要内容包括含有重组DNA的大肠杆菌的涂布与培养、重组克隆的筛选，重组率的计算。感受态细胞的制备。主要内容包括大肠杆菌液体培养与化学处理。毕赤酵母的cDNA文库的构建及分析。主要内容包括mRNA的提纯;cDNA第一条链的合成;cDNA第二条链的合成;双链cDNA的修饰;双链cDNA的分子克隆;cDNA文库的扩增;cDNA文库鉴定评价。人胰岛素基因在大肠杆菌中的克隆表达。主要内容包括限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ双酶切pUC18质粒和人胰岛素目的基因，琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收两个基因片段，在T4-DNA&ligase&作用下将两个回收片段连接，获得重组pUC&18-胰岛素；CaCl2法制备E.coli&JM109感受态细胞，转化pUC&18-IL-18，用PCR法鉴定重组阳性克隆。中国人群CYP2E1基因的主要多态性类别与抗结核药物代谢的关系。主要内容包括提取不同人群基因组DNA；对基因组DNA进行荧光定量PCR扩增；通过分析Ct值和Tm值确定基因多态性。13．实验教材或指导书或主要参考资料1）滕利荣等，生物学基础实验教程Ⅱ（第三版），科学出版社，2008年2）周俊宜等，分子生物学基本技能与策略，科学出版社，2003年3）魏群等，分子生物学实验指导，高等教育出版社，1999年4）J.萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，科学出版社，2005年5）郝福英等，分子生物学实验技术，北京大学出版社，2003年6）梁国栋等，最新分子生物学实验技术，科学出版社，2007年14．考核要求、考核方式及成绩评定标准14.1&考核要求：以培养学生的科学态度、科学思维和实验操作能力为前提，注重训练学生的独立动手能力、思考能力，发现问题、分析问题和解决问题的能力，实验设计能力及创新能力，教师应及时、客观、公正、如实评价每名学生实验情况及评阅试卷、实验报告和设计实验。14.2&考核方式：采取考核与考试相结合的方式综合评定实验成绩，按百分制方式计分。14.3&成绩评定标准：根据生物基础实验教学中心制定的《学生实验成绩考评方法》进行评定。实验习惯成绩，10%；预习考试成绩，10%；实验操作成绩，40%；实验报告成绩，20%；设计实验成绩，20%。15．执笔人崔银秋&教授林&&凤&教授姜大志&副教授汤海峰&工程师16．制定日期17．审核人周&&慧&教授崔银秋&教授18．审核日期19．学院审定程序说明2013年10月10日接到学校通知后成立《生命科学学院实践教学大纲（2013版）》修订专项工作组并进行前期筹备工作。2013年10月14日至2013年10月16日各门课程梯队召开《生命科学学院实践教学大纲（2013版）》修订工作会议，分配修订任务。2013年10月21日前各门课程梯队提交《生命科学学院实践教学大纲（2013版）》修订稿。2013年10月25日生命科学学院教学委员会召开第一次会议审议《生命科学学院实践教学大纲（2013版）》修订稿并提出整改意见。2013年10月26日至10月28日各门课程梯队按照“整改意见”进行整改。2013年10月30日生命科学学院教学委员会召开第二次会议审定通过《生命科学学院实践教学大纲（2013版）》。20．学院审定日期