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高通量药物筛选的及其在中国的发展趋势综述-Molecular Devices
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基于jak/stat信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立基于jak/stat信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立
, PP. 164-167
目的建立基于jak/stat信号通路的高通量药物筛选细胞模型,筛选调节免疫系统、造血系统和抗肿瘤药物。方法构建以串连的多个stat的dna结合序列为调控序列,以荧光酶基因作为报告基因的表达载体。通过将该载体分别转入体外培养的不同细胞系中使之稳定表达,建立具有激活stat活性的药物筛选模型,并利用多个抗过敏和抗肿瘤药物样品进行检测。结果建立多株药物筛选细胞模型,筛选方法简便,操作容易,灵敏度高,结果稳定。结论本细胞株可以用于大规模高通量药物筛选。
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Live SupportAsk us anythingSPA技术在受体高通量药物筛选中的应用--《中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）》2005年硕士论文
SPA技术在受体高通量药物筛选中的应用
【摘要】：在新药筛选中,以SPA 技术为基础的高通量筛选平台在国外已得到广泛的应用。本论文的目的是将SPA 技术应用于核受体与膜受体的高通量药物筛选。论文的主要内容包括:(1)利用杆状病毒表达系统表达全长核受体PPARγ。首先用分子生物学方法将PPARγ的全长基因亚克隆进质粒pFastBac1,将重组质粒pFastBac1-PPARγ转化到大肠杆菌DH10Bac,通过筛选得到重组杆粒。将后者转染昆虫Sf-9 细胞后获得重组病毒,Sf-9 细胞感染重组病毒后表达核受体PPARγ,与[3H]BRL49653 的结合实验表明所表达的PPARγ保持了生物学活性。(2)运用PPARγ、RXRα、[3H]BRL49653,biotin-PPRE 与SPA 微球建立了基于SPA 技术的PPARγ“ABCDE”高通量筛选模型,并对16000 个化合物样品进行了筛选, 12 个化合物被发现具有良好的结合活性,其中2 个样品的IC50值低于0.5 μM。(3)运用[3H]cytisine、α4β2-nAChR 和FlashBlue 微球,建立了基于SPA 技术的膜受体α4β2-nAChR“ABC”高通量筛选模型,并对32000 个化合物样品进行了筛选, 17 个化合物被发现具有良好的结合活性,其IC50 值均小于10 μM。结论:(1)利用杆状病毒表达系统成功表达了全长核受体PPARγ。(2)在国内首次将SPA 技术应用于新药筛选领域,建立相关的核受体“ABCDE”与膜受体“ABC”的高通量筛选模型,并运用于高通量药物筛选,发现了一批具有良好结合活性的小分子化合物。(3)与传统HA 筛选方法相比,SPA 技术在质量控制、可靠性和自动化等方面都具有优势。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2005【分类号】：R965.1【目录】：
缩略词表3-4
中文摘要4-5
Abstract5-7
第一章 PPARγ在昆虫细胞中的表达及其报告基因质粒的构建14-30
1. 前言14-17
2. 材料和方法17-23
3. 实验结果23-30
第二章 PPARγSPA“ABCDE”高通量筛选模型的建立和应用30-42
1. 前言30-31
2. 材料和方法31-35
3. 实验结果35-42
第三章 SPA 技术在膜受体中的应用及与传统HA 方法的比较42-54
1. 前言42-44
2. 材料和方法44-47
3. 实验结果47-54
参考文献60-66
在学期间发表文章目录66-67
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京公网安备75号高通量药物筛选的定义解释_甲醛_中国百科网
高通量药物筛选的定义解释
    生物安全柜对于广大的科研实验人员来说是非常熟悉的常规，但对其使用维护，特别是在特定条件下的彻底熏蒸消毒却不一定很了解，由于多方面方因，大多数实验室的生物安全柜自投入使用以后，甚至多年，也没有经过必要的的维护，有的甚至已经在不正常状态仍在使用。这给实验室生物安全留下了隐患，特别是在一些特定情况下，如使用3~5年后需要更换排风高效过滤器时，安全柜发生故障需要打开维修之前，生物安全柜受到严重污染时需要进行彻底的熏蒸消毒。　　　　一般常用的熏蒸用消毒剂包括甲醛、过氧化氢、二氧化氯等，甲醛虽然成本最为低廉，但因其致癌作用已经越来越受到使用限制，而且做过甲醛熏蒸的人大多会头痛不已，因为要将整个安全柜用塑料布封闭起来、计算需要的消毒剂用量、布置生物指示剂、中和消毒剂、等待漫长的十几小时等，最担心的恐怕还是甲醛的泄漏，以及生物挑战实验的成败等安全问题。　　　　现在有一种新的方法可完全代替传统的甲醛熏蒸，既采用过氧化氢蒸汽对生物安全柜进行消毒，通常发生器通过一个喷射接口与主舱体连接，已经有部分型号的安全柜提供此接口，同时有门封板将前面的操作口进行密封。如果这两个配置都没有的话，可以使用一个临时的门封板，并且已经预装好了合适的连接接口，将其安装在前面操作口上，通过门封上的接口将过氧化氢蒸汽喷入生物安全柜内。　　　　通常蒸汽回路连接于安全柜排风过滤器的后面，当然确切的连接类型和位置取决于带消毒的生物安全柜的型号。在更换过滤器或对安全柜进行维护时，这种连接会推送过氧化氢蒸汽穿过安全柜的排风过滤器并将其彻底消毒。　　　　只对主舱体进行消毒也是可行的，可以用于准备下一个实验前杀灭舱内及工作台下面的所有微生物，避免交叉污染。这种方案相比对主过滤器消毒循环时间变短，使用的过氧化氢也更少。　　　　所有的生物安全柜都有或多或少的气体泄漏，为了确保过程的安全，过氧化氢发生器可以保持一个不大的负压状态，保证在灭菌过程中过氧化氢蒸汽不会从舱体泄漏到实验室。这个功能是在消毒前通过在门封板上安装连接一个小型压力控制管来获得。　　　　下图所示为典型的生物安全柜消毒配置方法。　　　　对于三级生物安全柜可以将蒸汽通过安装好的传送舱口，通过小型供风高效过滤器喷射进舱内，由排气管连接返回的蒸汽形成闭合回路，将供气和排气过滤器一并消毒。　　　　Bioquell甚至提供更为完整的解决方案，其Mircoflow系列的高级别生物安全或微生物实验用二级生物安全柜，根据BS5726/EN12469标准设计制造，并通过应用微生物学研究中心CAMR的独立验证，提供操作者和样品最高级别的保护，在软硬件系统整合连接BioquellClarus系列过氧化氢蒸汽发生器，包括引入气体进入操作舱体并从排气高效过滤器的下游排出，充分灭菌工作舱及排气HEPA过滤器。　　　　HPV技术简介　　　　过氧化氢蒸汽（HPV）消毒技术正迅速成为制药、生物技术和医疗卫生行业生物净化方法的选择，对与高压锅相同的生物指示剂-嗜热脂肪芽孢杆菌达到6-log的杀灭率。在试运行或停工期间可采用广泛的消毒产品和服务对设施进行生物净化。　　　　Bioquell采用专利的Clarus双循环技术合并PLC程控将灭菌循环的效果最佳化，当过氧化氢在房间或舱体的表面形成微冷凝时达到生物消毒，这个阶段可以在显微镜下看到一个肉眼不可见的亚微米级的过氧化氢薄层，科学研究证实这个低温、无残留的过程已经在蒸汽发生阶段开始杀灭微生物。微冷凝的形成确保形成了微生物杀灭的最佳条件，当达到凝露点时，减少一个对数级别（1-log）微生物的时间（D值）最短。从灭菌动力学曲线可以看到微生物的数量陡降，伴随着微冷凝的形成，生物指示剂数量曲线从舒缓变得急剧下降。　　　　在某些产业一个生物性洁净的环境是非常重要的，Bioquell的HPV技术相比其他消毒方法具有明显的优点。传统的消毒方法和消毒剂如甲醛熏蒸不仅冗长而且也非常危险，甲醛已经被世界卫生组织分类作为对人类致癌的物质，甲醛消毒在房间中通常推荐12小时接触时间，接下来是一个漫长的排气和通风过程（大约24小时）。相比之下,过氧化氢在房间的消毒循环可低至2小时，对于整个约8000m3的设施可以在短至24小时内完成。　　　　Bioquell的过氧化氢蒸汽（HPV）消毒过程是快速、无残留和安全的，生成产物只有水和氧气。HPV相比其他消毒剂也具有广泛的材料适应性，意味着对建筑物造成损坏的风险更小,可作为设施的固定装置和设备。　　　　在生命科学和食品行业，HPV消毒过程是一个非常好的消毒方法，被主要监管机构所接受。如需要可提供一个完整的材料兼容性指南。对于影响生命科学、食品等行业的多种微生物，HPV消毒技术已经被证实具有广谱灭菌作用，如需要也可提供一个完整的消毒效果指南。　　　　Bioquell的消毒设备和服务可以为用户选择提供多种解决方案,事实上Bioquell过氧化氢蒸汽发生器就像一台既可以自动也可以手动操作的高档单反相机，当您熟练掌握使用方法以后，可以自行开发更多不同的应用，为您的投资创造更大的价值。
收录时间:日 02:35:44 来源:中国制药机械设备网 作者:匿名
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淘豆网网友近日为您收集整理了关于高通量药物筛选的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：高通量药物筛选一,概念高通量筛选(Highthroughputscreening,HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行试验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据,以计算机对实验数据进行分析处理,同一时间对数以千万样品检测,并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。二.高通量筛选技术体系的组成1.化合物样品库化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。其中,人工合成又可常规化学合成和组合化学合成两种方法。2.自动化的操作系统自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具,简洁明了的图示代表机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分,根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。3.高灵敏度的检测系统检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。4.数据库管理系统数据库管理系统承担4个方面的功能:样品库的管理功能;生物活性信息的管理功能;对高通量药物筛选的服务功能;药物设计与药物发现功能。三.高通量筛选模型常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平,观察的是药物与分子靶点的相互作用,能够直接认识药物的基本作用机制。1.分子水平的药物筛选模型:受体筛选模型;酶筛选模型;离子通道筛选模型1.1受体筛选模型:指受体与放射性配体结合模型。以受体为作用靶的筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。1.2酶筛选模型:观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点,酶的反应底物,产物都可以作为检测指标,并由此确定反应速度。典型的酶筛选包括1)适当缓冲液中孵化;(2)控制反应速度,如:温度,缓冲液的pH值和酶的浓度等;(3)单时间点数器,需测量产物的增加和底物的减少。1.3离子通道筛选模型:(1)贝类动物***的高通量筛选,其作用靶为Na+通道上的蛤蚌***结合位点,用放射性配体进行竞争性结合试验考察受试样品。(2)用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道β3亚单位与α1β亚单位相互作用的小分子,寻找新型钙通道拮抗剂。2.细胞水平药物筛选模型观察被筛样品对细胞的作用,但不能反映药物作用的具体途径和靶标,仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括:内皮细胞激活;细胞凋亡;抗肿瘤活性;转录调控检测;信号转导通路;细菌蛋白分泌;细菌生长。高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有以下几个优点:反应体积小;自动化;灵敏快速检测;高度特异性。但是,高通量筛选作为药物筛选的方法,并不是一种万能的手段,特别是在中药研究方面,其局限性也是十分明显的。首先,高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型,因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用;其次,用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的,要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型,也是不现实的。但我们应该相信,随着对高通量筛选研究的不断深入,随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的发现以及筛选模型的新颖性和实用性的统一,高通量筛选技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。高通量筛选技术采用的先进检测方法光学测定技术。近年来,美、英两国研究人员在高通量筛选检测中,努力进行了光学测定方法的研究,建立了大量的非同位素标记测定法,如用分光光度检测法筛选蛋白酪氨酸激酶抑制剂、组织纤溶酶原激活剂等,均获得成功。放射性检测技术。美国学者GanieSM在高通量药物筛选研究中,应用放射性测定法,特别是亲和闪烁(SPA)检测方法,使在96孔板上进行的样本量实验得到发展。该方法灵敏度高,特异性强,促进了高通量药物筛选的实现,但存在环境污染问题。荧光检测技术。美国学者GiulianokA研究认为,采用FLIPR(fluorometricimagingreadet)荧光检测法,可在短时间内同时测定荧光的强度和变化,对测定细胞内钙离子流及测定细胞内pH和细胞内钠离子流等,是非常理想的一种高效检测方法。多功能微板检测系统。由西安交通大学药学院研制的1536孔板高通量多功能微板检测系统,是目前国际上先进的高通量检测系统,它可使筛选量进一步提高,现已在该院投入使用。1.基本原理高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系,它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行实验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验数据,以计算机对实验获得的数据进行分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。1.1化合物样品库高通量筛选是一种利用已有的化合物进行的体外随机筛选。因此通过高通量药物筛选发现先导化合物(pounds)的有效性取决于化合物样品库中化合物的数量及其质量。化合物样品的数量是指不同样品的数量。化合物样品的质量主要由化合物结构的多样性决定的。许多活性反应基团(reactivegroups)使初筛的假阳性大量增加,剔除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。采用常规化学合成的纯化合物一直是国外制药企业建立化合物样品库的主要来源。它们通过长年积累的化合物建立化合物样品库,通过购买和化合物交流使化合物样品库的数量和质量大幅度提高。binatorialchemistry)的出现为大量增加化合物的数量提供另外一种来源。组合化学的基本原理是采用适当的化学方法,在特定的分子母核上加入不同的基团,在同样条件下,产生大量的新化合物。这种方法在化合物的结构改造和优化方面已经表现出强大的优势。但是,由于该方法是基于母核结构的改造,因此产生的大量化合物在结构多样性方面尚有极大的不足。解决组合化学产物结构多样性的问题,已经成为化学研究人员的研究课题。从天然产物中分离出来的化合物,母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的,它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。因此,增加样品库中具结构多样性的天然化合物及其衍生物是提高样品库质量的一个重要途径。跨国制药企业为了增加高通量筛选的阳性率,已经或正在寻求助买我国的天然产物单体。1.2自动操作系统高通量药物筛选每天要对数千化台物样品进行检测,工作枯燥、步骤单一,人工操作容易疲劳、出错。自动化操作系统采用微孔板作为反应容器,具有固定的分布模式(format);不同的微孔板通过条形码加以标记。自动化操作系统通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作,并将操作结果及相关数据存贮在计算机内,使筛选结果准确,实验过程快速。自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具,简洁明了的图示代表机器的动作。编程过程简洁明了,可操作性强。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组成都分,根据需要可配置加样、冲洗、温解、1播放器加载中，请稍候...
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