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【求助】微生物发酵液如何应用HPLC来检测其发酵程度
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这个帖子发布于10年零341天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位战友，大家好，我是刚接触微生物发酵的新手，所以有一些问题要请教一下大家。我想知道在微生物发酵中，如何将发酵的程度与HPLC相连，如何通过HPLC的指标来确定发酵的程度，谢谢大家的帮忙！发帖不规范哦！还没有理解规范发帖的重要性吧，应该点开下面的链接看看哦！
不知道邀请谁？试试他们
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迷北方的狼 edited on
HPLC为高效液相色谱，在微生物发酵过程 中，通过测定高效液相色谱来测定其产生的抗生素含量，如果所测定的含量增长较快，则发酵处于对数生长期，如果含量增长较慢，则菌体自溶，处于衰亡期，也就是发酵的终点期。
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观察发酵程度可以分为对底物中碳源或者对产物含量的观测，勾画曲线判断代谢程度生物反应数学模型每本相关书上都有，对照看看就好了，不懂得来问。发酵罐与HPLC的连接分为offline和online两种offline相对简单要注意的是取样后直接放在冰盒里，减少菌种在这期间的代谢对检测的影响。发酵罐与HPLC的连接online检测需要一套FIA系统，流动注射分析系统要考虑流动速度，全程无感染可能，流动相延时时间比较复杂，如果楼主要做online可以再继续问，我可以再详细说一下。
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哦，谢谢各位战友的帮助！我现在主要做的是海洋菌株的发酵，没法通过向yinlijing2008建议的那样测定产生的抗生素含量，我们的发酵液中主要是一些次级代谢产物，我想知道的是如何把HPLC和这样的发酵液相联系呢？
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发酵过程中,由于氧气供应不足,或发酵前期碳源(如葡萄糖)含量过高导致菌体初始增长速度过快,以及发酵后期菌体自身代谢等多种原因,会产生大量的副产物---有机酸(尤其是乙酸),我想如果发酵过程中,连续的取样(如2h一次),再使用HPLC来检测出发酵液中这些有机酸的含量变化,就能在一定程度上反应出发酵的情况.
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哦，这样啊，谢谢031205战友的帮助，那么在不同的发酵阶段有机酸含量应该有什么样的变化呢，因为我初涉微生物发酵，对这方面的知识实在太欠缺，希望得到大家的帮助，谢谢！
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一般是逐步升高,直到菌体完全死亡.发酵最理想的效果就是,酸的大量产生主要由于菌体自身代谢而产生,这一般就会是在稳定期末或衰亡期,也是发酵产物不再继续升高的时候,应该停止发酵的时间;但是如果过程控制不好,可能在对数生长期就产生大量乙酸,这就会影响菌体活力,且会缩短稳定期,从而影响产量;一般认为大量产生乙酸的原因是由于菌体生长比率过大,因此在保证快速增殖的同时,也要控制菌体的生长速度,可以通过几点控制:1.接种量,一般是按照10%接种;不要太大量;2.初始碳源含量不能太高,;待菌体快速增长时在补加,补加的速度也要控制;3.溶氧要恰当;要控制到理想情况是不大可能,但是只要摸索一下条件肯定能有所改观的.另外文献上关于发酵时有机酸的产生有很多,你自己也可以查一查.
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谢谢031205 战友的帮助!
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发酵液能直接上HPLC吗
请教一下，要测发酵液中的某一产物，可以直接上液相吗，还是要怎么处理一下。大家是怎么做的呢
萃取 浓缩 使其容于配方合理的溶剂，选择流动相等条件同样很关键
我想问一下，HPLC的洗脱液一般用的高纯水，那制作发酵液的时候是不是也得用高纯水？
我想问一下，HPLC的流动相用水的话是高纯水，像发酵液这种样品，在制作发酵液时是不是也得用高纯水？还是只需要用色谱纯把自己需要的东西从发酵液中萃取出来就行？
我们实验室也是这么处理的，没问题。但处理的溶液别放太久，否则还会生长菌的。:)
一般谁水就行了，没必要用高纯水。
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如何取发酵液测酶活
最近在做米曲霉液体发酵产淀粉酶，测定酶活方法如下：
称取碘化钾22.0g溶于约300mL水中，加人碘11.0g，在搅拌下使其溶解，然后移入500ml容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用(每月制备一次)。
称取碘化钾20.0g溶于约300mL水中，准确加入原碘液2.00ml，全部移人500mL容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用(须当天配制)。
标准溶液的制备: 取8支试管做好标记,依次加入1g/L可溶性淀粉溶液0mL、0.5 mL、1.0mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL, 再用蒸馏水将各试管补至5 mL。得到浓度为0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL 的淀粉标准液。
取8支试管做好标记, 依次加入制作好的淀粉标准液1mL，碘稀释液5mL 混匀, 以1号试管中的溶液作为标准空白样, 在660nm 处测定淀粉标准液的吸光值。
酶活测定：
吸取4mL 可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液1mL，摇匀后于60 ℃恒温水浴中预热5min。立即加入酶液0.2mL, 计时, 摇匀，反应5min。
立即吸取反应液1mL, 加入盛有0.5mL 稀盐酸和5mL 稀碘液的试管中, 摇匀。并以0.5mL稀盐酸和5mL碘稀释液为空白, 在660nm 波长下, 测定吸光值, 制作淀粉含量的标准曲线和回归方程。根据回归方程, 计算反应后溶液中淀粉的浓度。
采用可溶性淀粉做碳源，取发酵液离心（我的米曲霉菌丝体成条状，发酵液澄清，没什么杂质，感觉离不离心区别不大），然后取上清测酶活，问题是淀粉做碳源，发酵液中有淀粉，结果导致实验组吸光值比用水代替发酵液的还要高，颜色还要深（当然我的淀粉酶活肯定也很低），是换一种碳源还是换一种测定方法？用DNS法的话用葡萄糖和麦芽糖做碳源时又怎么办？可是我要做不同碳源的优化实验啊？
& && & 还望高人指点啊？？？？？急急急急啊？？？
360截图35343.jpg
只要发酵液中还有淀粉，就会和稀碘液作用显色，取发酵液测出来的酶活就一定比实际值小啊（我测的酶活基本为零甚至可以说是负值），你的意思是等到培养基中的淀粉被利用完时测得的数值就会是准确的。
底物含量变化曲线怎么得到啊？测酶活时用的底物淀粉是可以定量的，可是加的1ml发酵液里面也有淀粉啊，那里面的淀粉无法定量啊
我上面的测定方法有没有什么问题啊？用0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照对不对啊？还是该用从（4ml水+1ml缓冲液+1ml发酵液）中取1ml+0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照啊？
还望大牛指点详细点啊？我刚刚开始做这个，师兄师姐不是做这个的，身边也没什么人带我:cry:
还有导师要我做的是α-淀粉酶，用DNS法测可以吗？那测得不是总淀粉酶的酶活吗
其实我不需要测发酵液里残留的淀粉，只想测到真实的α-淀粉酶活，我用碘法测，测OD时对照该如何设置呢？
可是灭活后的酶液+底物淀粉+缓冲液+0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照，吸光值必定比实验组的大，是不是对照组要水代替底物淀粉液啊
如果取（灭活后的酶液+底物淀粉+缓冲液）1ml+0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照，再把它设为零的话，那实验组的吸光值就是负值了（最大也是零），我看过一些文献，他们直接用0.5ml稀盐酸+5ml稀碘液做对照的（我用可溶性淀粉做碳源的，这样设不行的），现在真心没折了啊:cry:求指点啊
其实我不用测发酵液的淀粉本底吸光值，我的最终目的只要测得真实的发酵液里α-淀粉酶活就可以。
既然差值不变，那我把这个差值带入上面我作的标准曲线，求得的是5min内淀粉酶消耗的底物淀粉浓度吗？进而可以求得1ml发酵液里α-淀粉酶活吗？
这样可以求得淀粉酶的酶活，但要先定义酶活的单位。
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微生物发酵过程的问题
本人目前在做微生物发酵过程中的代谢研究
基于之前做实验的处理步骤，我感觉有些疑惑，希望大家不吝赐教，非常感谢！
问题是这样的，在进行发酵液的采集之后，对发酵液中的成分进行分析的时候，是不是必须经过灭菌这个前处理步骤，我目前都是采用这个方法，但是我担心在灭菌后发酵液中的成分是否会出现变化？
还有如果不进行灭菌处理，进行有机提取后分析是不是会更准确？
这个我考虑过，因为灭菌后我会进行菌丝体过滤，同时在发酵液中存在水溶性不好的物质，所以我考虑到这个问题就没有敢进行离心。对了还有一个问题想补充问一下，如果是进行发酵液中糖分的分析，比如测定含量的话灭菌的时候是不是需要考虑糖不被破坏的问题，设置灭菌时间为113°
恩，呵呵，我进液相用的聚偏氟乙烯膜是0.45μm的，好像不能达到完全除菌的效果，有0.22μm规格的么？还有就是关于糖含量分析的，用液相检测好像会比较麻烦，具体我不清楚好像是需要进行衍生化以后才可以检测，所以我还是单独进行糖分检测比较靠谱，呵呵
有0.22um规格的膜，可以用于不能灭菌的物质的除菌。灭菌处理不是必要的，而且灭菌可能破坏发酵液中的生理活性物质。
恩，我查了是有的，其实我灭菌的目的就是为了终止反应，其实应该换种方法，刚在文献中搜寻到了，也非常感谢你！
恩，我也确实觉得不好，所以提出来让大家一起交流一下，呵呵，谢谢你的回答~
向著名写手求教，能详细讲讲么？
我用的是一种霉菌，关于主要是什么代谢物我不清楚所以需要研究，但是添加的底物是异黄酮类物质，这个很有必要讲么？因为主要是发酵液的处理方法很疑惑，如果是分情况来看的话，那我这个是应该如何处理呢？非常感谢
你是用霉菌催化转化 这个异黄酮类物质A，检测生成什么代谢物吗？
如果是这样，就拿 发酵液上清 和 胞内 提取物（一般是溶于有机溶剂的）分别做，因为不知道是胞内还是胞外的产物啊。
你的目的是什么？？？？？？？？？？？
你不说。我只能瞎猜。
恩，是的，做胞内胞外是我方案里的一个实验内容，那就直接过滤菌体后用有机溶剂萃取处理后，使用0.22μm的滤膜过滤进液相，是把？代谢物我不清楚是什么，需要分离后打谱分析。
目的是为了研究该种菌在对这一类化合物的代谢机制
对了，师兄，在做胞内提取物的时候是采用生活细胞进行破碎后离心取上清么？
你查到的是什么方法可以说下么
113度灭菌对糖的影响应该不是很大，但是我觉得最好的还是不采取加热这样的措施！
这个温度我知道，哎~
这个提取物首先界定是 你的异黄酮类的衍生物或其他，
而不是ATP、NADPH或柠檬酸。
这样大家才知道你不是测定胞内代谢物（代谢组学相关），
而只是想弄明白异黄酮类物质的催化转化过程中都有哪些 中间体。
胞内此类中间体其实可以直接用氯仿常温抽提菌丝体。
如果你的条件更好的话，最好是按以下的抽滤方法进行，速度要比离心还快。
1.发酵液，例如50ml 或更多，抽滤，滤液做胞外分析用。
2.菌丝体也是抽滤获得，速度比离心更快的。
3.将菌丝体刮下来，置于干净的研钵中，倒入适量液氮，研磨。
4.破碎的菌丝体用甲醇（方便上HPLC）常温抽提，实在不行，也可以用氯仿抽提。
总之，胞内的物质可能溶于甲醇，也可能溶解很少，只能用氯仿了。
抽提过程就是：常温往复震荡，一般几个小时到一晚上，都可！
5.抽提液一般置于室温，问题不大。但注意不要泄露有机溶剂。
6.抽提液在静置一晚上后，几乎可以直接上HPLC柱，这是因为你只用取最澄清的500-1000 uL足够分析用了。
或者用0.22的耐有机溶剂的过滤器再过滤下，就可以。
7.如果代谢物浓度过低，就加大菌丝体量啊！如果还是少，那就只能选择取 n毫升抽提液去旋转蒸发或者真空抽干了。
还有一个事情想问一下师兄，震荡抽提的时候可以换成是使用超声抽提么？超声抽提的效率应该更高，但是我不清楚这种方法是不是更有利于抽提，非常期待师兄的回答~
有机溶剂抽提，超声时会起很多气跑。
你试试，行就可以。
楼主，你好，想请问一下你搜寻到的终止反应的方法是什么？谢谢！
是直接沸水浴5-10分钟，作为终止反应的方法，你可以试试
哦，好的，谢谢！我试试:victory:
谢谢你，收益颇多啊
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石油醚溶解样品后，能直接做HPLC吗？
如题，，就是石油醚溶解了样品以后，跑hplc，流动相是甲醇和水，但是甲醇和石油醚不互溶，可以吗？
再就是我的东西的是未知，所以我又单独跑了一下石油醚，来确定溶剂峰，但是石油醚跑出来有五个峰，怎么办？怎么确定溶剂峰？
你说的样品就是指的我的石油醚吧？你意思是 峰面积增大就是统计溶剂峰？但是甲醇和石油醚不互溶啊，怎么往石油醚里加甲醇呢？
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