荧光定量pcr原理 延伸温度 怎么没有

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荧光定量PCR常见问题解析
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你可能喜欢实时荧光定量PCR注意事项
刺客联盟0379
1.按照正确的开关机顺序操作,有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率.开机顺序:先开电脑,待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机,等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件,进行实验.关机顺序:确认实验已经结束后,首先关闭信号收集软件,然后关掉定量PCR仪主机的电源,最后关闭电脑.2.应该定期备份您的实验数据,备份频率推荐每周一次,用光盘刻录.同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据,这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDS Document.3.良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率.推荐做到以下几个方面:电源:推荐配备合适的UPS或稳压器.通风:仪器的通风应该没有阻挡.温度:推荐实验室配备空调,温度应该控制在10-30°C之间.湿度:20-80%;对于潮湿的省份,推荐实验室配备除湿机.空间:易于操作,安全.4.怎样判断定量PCR仪的样本加热块是否被污染?怎样清除污染一个办法是运行背景校正反应板,当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号,则表明该孔可能被荧光污染物.另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下,执行ROI的校正,当某个孔的信号明显高出其他孔时,则表明该孔被污染.清除样本加热块污染的步骤如下:用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中.吹打数次.将废液吸入废液杯中.重复以上步骤:乙醇三次,去离子水三次.确认反应孔中的残留液体蒸发完.
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说下我自己做的,感觉的注意事项,仅供参考1.实验设计要合理。。。。很重要2.加样时力求准确,以减小偏差3.引物设计得好4................
正确的操作步骤
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扫描下载二维码为什么我做定量PCR无CT值(信号)出现?怎么解决呢
博凌科为-为你1.反应循环数不够.一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45cycles),但高于45个循环会增加过多的背景信号.2.检测荧光信号的步骤有误.一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号.3.引物或探针降解.可通过PAGE电泳检测其完整性.4.引物或探针的设计,如探针高于引物的温度不够,造成探针未杂交上而产物已延伸的情况.5.模板量不足.对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起.6.模板降解.避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况.
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没有扩增可见于:1. 基因没有表达,所以肯定没有扩增2. 表达量很低,增加循环数,可出现3. 基因有表达,但是引物有问题,不能扩增,建议做一半PCR跑胶看结果4. PCR的试剂有问题,加做阳性对照。5. 样本反复冻融,都降解了
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