HEK293/AD293细胞培养问题(细胞培养,传代) - 细胞实验 - 生物秀
标题: HEK293/AD293细胞培养问题(细胞培养,传代)
摘要: [HEK293 AD293细胞培养问题(细胞培养,传代)] 最近一直在养HEK293 AD293细胞，刚接手的细胞还可以，比较饱满。传代一次之后，细胞明显变瘦，拉长丝，一直也长不满。请教高手，这是怎么回事？急呀！注：同样养的293T没有这个问题。 关键词:[细胞培养 传代]……
最近一直在养HEK293/AD293细胞，刚接手的细胞还可以，比较饱满。传代一次之后，细胞明显变瘦，拉长丝，一直也长不满。请教高手，这是怎么回事？急呀！注：同样养的293T没有这个问题。
回复同问，刚复苏的HEK293FT细胞，第一次传代后长势很好，1传3能第二天长满；但继续传代时，细胞生长较缓慢，感觉总也长不满，形态上也不那么好看了，急求高手指点！附上细胞图片：图一 第一次传代后3h细胞形态（因未换液，上面有一层圆形未贴壁细胞） 回复图二 第二次传代后20h细胞图片 怎么看怎么怪啊…… 回复弃掉吧，细胞状态太差了，难以救回来了。回复图二 第二次传代后20h细胞图片 怎么看怎么怪啊……我们养的细胞 最近也是这问题 搞不大明白不晓得是不是传代的时候消化不好 细胞聚团造成的……回复可是我第二次传代时，消化下来的细胞是一颗一颗的，并未成团……我的培养条件和传代过程如下：DMEM+5%GIBCO FBS+5%四季青 FBS+1% NEAA 37℃ 5%CO2消化时，水洗一遍后吸去；0.25%胰酶+0.2%EDTA加入后30-40s细胞飘起，立即加入中和培养基，吹打60-100下后1000rpm离心5min；生长培养基重悬，分装。另外，借人气求状态好的293FT/293T细胞图片，谢谢大家了！回复可是我第二次传代时，消化下来的细胞是一颗一颗的，并未成团……我的培养条件和传代过程如下：DMEM+5%GIBCO FBS+5%四季青 FBS+1% NEAA 37℃ 5%CO2消化时，水洗一遍后吸去；0.25%胰酶+0.2%EDTA加入后30-40s细胞飘起，立即加入中和培养基，吹打60-100下后1000rpm离心5min；生长培养基重悬，分装。另外，借人气求状态好的293FT/293T细胞图片，谢谢大家了！兄弟，你太强大了，细胞都吹60-100下，细胞都让你吹死了！消化的时候，一般先用PBS或D-Hank’s液洗涤细胞面一次，然后加入胰酶，消化几十秒（看你细胞好不好消化），细胞未掉之前，弃去胰酶（细胞瓶会残留一点），继续消化（室温或者温箱）至出现细胞间隙（眼观或镜检），细胞松动（手拍细胞瓶可见），加入营养液（可以中和剩余的一点胰酶）吹打10来次，或者更少次数。加入所需营养液体积，分瓶即可。还有，为何加两种？回复嗯，吹打太多次数了。我每次在胰酶消化后加培养基，只都轻轻的吹几次（<5）,而且保证不要起泡，离心后吹打也是，不要有泡泡出来，一切要轻哦。回复谢谢大家~决定下次吹打次数减少点试试……
相关热词：
..........
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-关注今日：3 | 主题：484934
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】细胞培养（细胞突然死亡）
页码直达：
这个帖子发布于5年零270天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我培养细胞进行药物筛选，培养的细胞是A549，Hela,293T,HCT-116,在培养的过程中，细胞形态等都正常，有一天，发现培养箱发出一种臭味，没太注意（改天细胞正常），第二天对细胞进行传代，一天后发现细胞未贴壁，死亡，而这期间同一培养箱未传代的细胞生长速度缓慢，能帮忙解释一下原因吗？急求!!!!!!!!!
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
yxyxiaoli edited on
培养箱发臭首先考虑是气体质量不过关。有时候一瓶气用到后面，会有带异味的杂质(往往会影响细胞生长)释放出来，当然有时候碰到黑心商人或者马大哈灌气师傅，都会出现气体质量问题。可以把进气管道拔了，搜集一些气体，确认是不是这个问题。还有就是有污染了，仔细看看你的细胞、水盆，甚至箱子夹层、进气管道，有没有发现长菌。还有就是对箱子消毒的各种措施，有没有放过量或者忘记了清理。你仔细检查一下，养细胞，只要有异常，肯定有种种痕迹留下的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
可以肯定气体质量应该没问题，因为同一罐气体3天后气味儿就没了，细胞死了，很多都无从查起，同时培养的细胞，当时应为没长满没传代，第二天没问题。可以肯定这几天培养箱未消毒，如果污染在培养箱内，为什么同一种细胞有的细胞出问题，有的没问题细胞交叉污染会导致培养箱发臭吗
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
那可能是你那几瓶细胞操作的时候污染了。就算同一天进行的同样操作，如果污染的话，发作也可以不同时间的，也有的甚至不会污染。如果怀疑交叉污染的话，那些细胞肯定不能用了，不纯了。p.s.应该不会发臭。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
yxyxiaoli 我培养细胞进行药物筛选，培养的细胞是A549，Hela,293T,HCT-116,在培养的过程中，细胞形态等都正常，有一天，发现培养箱发出一种臭味，没太注意（改天细胞正常），第二天对细胞进行传代，一天后发现细胞未贴壁，死亡，而这期间同一培养箱未传代的细胞生长速度缓慢，能帮忙解释一下原因吗？急求!!!!!!!!!怪味不是绝对原因，可能还是你的细胞长得太好了，错过了最佳传代时机，因为你发生的这个情况是多品种细胞传代同时死亡。如果培养基也不相同，那么就更加说明是你的工作习惯没有适应细胞的生长习惯。细胞计数？有木有。【不了解培养基和细胞生长代谢的比例关系】细胞近几次传代浓度较高?有木有。【随意性较大，对细胞数没有判断概念】细胞传代时间是否固定？有木有。【不解释了，解释就是掩饰】
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
细胞最近 传代浓度确实较高，为了保证细胞能长满，我一般是1:3传代，每天传一次，传代时没计数，传代时间比较固定，培养既有不同的。如果真是这些原因，怎样确定细胞最佳传代周期，我想了解一下细胞的倍增时间，在那些网站上能找到
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
yxyxiaoli 细胞最近 传代浓度确实较高，为了保证细胞能长满，我一般是1:3传代，每天传一次，传代时没计数，传代时间比较固定，培养既有不同的。如果真是这些原因，怎样确定细胞最佳传代周期，我想了解一下细胞的倍增时间，在那些网站上能找到这个需要经验的积累，每一个细胞都有其各自的特点，需要你们耐心细致的工作去仔细的发现。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园& [求助]293T细胞培养求助
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
[求助]293T细胞培养求助
信誉分 100
可用分 1671
阅读权限 255
注册 状态 离线
[求助]293T细胞培养求助
我的293T，养着养着越来越不好了，不知怎么回事。我用10％进口新牛血清（PAA公司产品）DMEM，未加抗生素，刚要来时还行，不太知道什么时候传代，有人说70－80％就得传，还有人说要长满了再传，但有时长不满，长多了就会成层长，看着乱七八糟，成摞，看不清细胞个数和形态，一般这样好像就老了，再养就不好了。还有就是传代时我把握不好，我用0.125％胰酶消化，基本是润一下就倒掉，原来还放孵箱里1分钟，现在倒掉胰酶就加培养基吹细胞，细胞倒是很容易吹下来，一片一片的掉，但成团，吹不开，后来我多吹一会，吹的用力一点，培养基里都是泡沫了，就吹开了。结果细胞贴壁后，就有很多细胞碎屑，杂质，黑点，看着特别脏。细胞内部的黑点也特别多，瓶中的黑点也很多。生长速度减慢，不怎么长。越传越不好。冻存后，很难复苏，好的时候也就贴50％，这次复苏几乎没几个贴的，我就这一瓶了，别人也不养了。要不到。所以还在努力把这个养好。对了，我原来用新的塑料瓶养，后来用处理过的塑料瓶，后来用玻璃瓶养。用新瓶状态挺好（相对），用处理得前一阵还行，现在经常大片大片的脱，用玻璃瓶，细胞多的时候先试了一瓶，还行，后来就不行了。
那位养293T的高手帮帮忙，我就要毕业了，还停在这里，万分着急，先谢谢了。
信誉分 100
可用分 4621
阅读权限 255
注册 状态 离线
你的胰酶浓度低了一点，我用的是0.25%，且含0.02%的EDTA，这样的话，吹打细胞后，细胞容易分散，不会成团；消化的时间也不用太长，一分钟以内即可。吹打次数不要太多，10次以内就可以了。再就是你的培养液，每次用之前，一定要升温至37度，不然对细胞损伤较大。
信誉分 100
可用分 4726
阅读权限 255
注册 状态 离线
293T的贴壁性不是很好（如果需要的话可以用多聚赖氨酸包被一下），消化时间也比较短。
信誉分 100
可用分 6906
阅读权限 255
注册 状态 离线
我养293前段时间也出现和你同样的问题,不过现在好了.前面说你胰酶浓度低了一点，我用的是也是0.25%.最重要的就是293一定不要长到超过90%在传代.它长的太老了,马上就会出现你所说的那种脱落和不帖壁的情况了.所以一定要在80%时就传代.因为293不耐受挤压,一受挤压它的形态就会发生改变.
还有就是293在室温下也很容易大片脱落,所以最好是先开空调,等温度降下后在拿出观察.
另外,你应该及时多冻存保种,一出现你现在这种状况时细胞状态就已经不好了,就应该丢弃重新解冻新的.再者293传到30多代形态就会自然发生改变了,已经不能做为实验用了
还有就是在它还没贴壁前就是有部分已经开始贴壁时最好不要动它,等12h后它完全贴壁再观察
这只是我个人的经验,希望相互学习,祝你好运!
信誉分 100
可用分 3298
阅读权限 255
注册 状态 离线
建议你吹打的时候用10毫升的吸管轻轻吹打
因为这种大管子的管口比较大
不会损伤细胞
吹打的时候最好不要起泡沫
还有培养基里还是加上双抗吧
细胞状态不好
也可能是污染
祝你顺利！
信誉分 100
可用分 3228
阅读权限 255
注册 状态 离线
或许是你吹得太猛，将细胞吹破了。我觉得消化时要注意：我做时一般用百分之0.25的胰酶将细胞浸润一下后倒掉，放几分钟后倾斜方瓶能看见细胞流动时即可加入培养液，再用吸管轻轻吹打即可。
信誉分 100
可用分 6976
阅读权限 255
注册 状态 离线
我用(37度,PH7.4)0.05%的胰酶0.02%EDTA消化,在镜下观查细胞,当细胞略微收缩,倒掉酶液,在放37度孵箱孵育4-5分,用手轻拍瓶底当发现有细胞顺残余的酶液流下时,中止,再吹打细胞即可.
信誉分 102
可用分 6856
阅读权限 255
注册 状态 离线
楼主所描述的情况我遇到过。
“结果细胞贴壁后，就有很多细胞碎屑，杂质，黑点，看着特别脏”与我当时所观察到的现象很相近。你所说的杂质、黑点其实就是细胞碎片。
导致这种现象的原因，后来我分析可能是因为由于我前面操作的不合理（比如传代的时机不恰当，等到细胞长得很老了再传），结果导致细胞整体的活力下降，老化。这种结果是长时间积累下来的。因此，我个人认为，细胞养成这样不太好挽救了。建议楼主不要在这种细胞上耽误时间，重新复苏新的细胞是比较明智的选择。
如果楼主将这个问题解决了，别忘了告诉我一声。
祝好运：）
信誉分 100
可用分 3511
阅读权限 255
注册 状态 离线
细胞不要长的太密，80％时就要传代。另外细胞太脏时传代时可以将细胞低速离心一下，将其中的细胞碎屑离心下来，那样细胞会干净一些。另外，试试换成其它牌子的血清养养看，曾经用过PAA的血清，好像每批的质量都不一样，细胞也是长得很难看，后来换用Hyclong的血清后，就好多了关注今日：3 | 主题：484934
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
新手求助 293T细胞的培养
页码直达：
最近从同学那借过来的293T细胞，她给我的时候应该是瓶底面积的50%~60%，但是感觉细胞状态不好，就放了2天，然后，看的时候细胞几乎都飘起来了，只有一小片没有飘起来，于是将这一小片消化了，重新放到另一个新的培养瓶里了。我用的10%FBS（四季青）+1640培养的，几乎没怎么长，同学说，是低血清培养，后来换成8%的FBS，长好了一点，但是昨天配8%的培养基时，忘了混匀，换液后加的几乎全是1640，今天一看细胞更少了。我看园子里，说要用高糖的DMEM培养，必须用高糖的DMEM培养吗？我看园子说的还是用10%FBS培养，那为什么我的要用低血清培养呢？谢谢！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
293T长得很快，所以低血清没问题，5%FBS也能养起来；细胞贴壁不牢，比较考验细胞操作，处理时尽量轻柔。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
Ucell 293T长得很快，所以低血清没问题，5%FBS也能养起来；细胞贴壁不牢，比较考验细胞操作，处理时尽量轻柔。谢谢！细胞贴壁不牢我知道，因为一直在养293F细胞，之前还养过293A细胞。我在纳闷为什么我的293T养不好？必须要用高糖DMEM?
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
这个主要看细胞来源，如果来源处是高糖DMEM，保险起见就保持一致，更换培养基类型肯定有风险。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我是用高糖养的，长的很快
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
同楼上一样，用的dmem 很好养
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我曾经遇到过293T一直长不好，最后发现是培养箱CO2浓度不对。调好之后，再就一直都长得很好了。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
亲，你们co2浓度出现什么问题，是不稳定还是低于5%？我们最近293T细胞状态也一直不好，喜欢聚堆长，即使空隙也这样，而且变得瘦小，不像原来那么分散且饱满，而且包浆中很多粗大黑色颗粒，没有死细胞但是细胞间隙会有粗颗粒出现类似细胞裂解碎片，各位谁有遇到这种情况的帮忙答疑一下，多谢~
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
高糖DMEM比较好养，难在容易漂起来。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
Ucell 这个主要看细胞来源，如果来源处是高糖DMEM，保险起见就保持一致，更换培养基类型肯定有风险。哦。谢谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
懒羊羊要当学霸 高糖DMEM比较好养，难在容易漂起来。谢谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
shinian 我曾经遇到过293T一直长不好，最后发现是培养箱CO2浓度不对。调好之后，再就一直都长得很好了。哦。谢谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
这个细胞比较好养的，我们用的高糖DMEM，如果细胞少就用小dish吧，刚开始融合度不够细胞不好长起来，如果还老动它，经常换液会影响它贴壁，就很容易死，不过等细胞长起来应该就没啥，不过这个细胞状态好的话可以一两天不用管它
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
293不需要消化，滴管吹一吹就下来了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
快乐女孩h 293不需要消化，滴管吹一吹就下来了哦。谢谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
293T我们用高糖的DMEM养，状态很好，生长很快，一般1:4传代，两天就满了，消化细胞的时候要用低浓度的胰酶
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
感觉这个细胞超级好养的啊。。。我用的是高糖DMEM+10%左右FBS，个人感觉要问你同学条件，别轻易更换培养基和条件，而且小心支原体污染。。支原体感染就是不贴壁长不好。。。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
天道酬勤tdcq 293T我们用高糖的DMEM养，状态很好，生长很快，一般1:4传代，两天就满了，消化细胞的时候要用低浓度的胰酶哦，谢谢！低浓度的胰酶是多少？我们用的是买来的,应该是0.25%的胰酶（含EDTA）
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
阿警Aries 感觉这个细胞超级好养的啊。。。我用的是高糖DMEM+10%左右FBS，个人感觉要问你同学条件，别轻易更换培养基和条件，而且小心支原体污染。。支原体感染就是不贴壁长不好。。。哦。谢谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我消化这个细胞的时候，一般将胰酶稀释两倍或者3倍，主要目的是胰酶浓度降低，消化速度减慢，更好控制操作，用0.25的，可能很快细胞就脱落了，不太好控制，如果操作熟练，直接用0.25的也没问题
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
天道酬勤tdcq 我消化这个细胞的时候，一般将胰酶稀释两倍或者3倍，主要目的是胰酶浓度降低，消化速度减慢，更好控制操作，用0.25的，可能很快细胞就脱落了，不太好控制，如果操作熟练，直接用0.25的也没问题哦。非常感谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园