细胞转染实验步骤 【范文十篇】
细胞转染实验步骤
范文一：转染细胞的稳定筛选
1、药物筛选前的准备
药筛前应确定药物筛选浓度，不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可。
2、药物筛选注意事项
（1）药筛的时间
加药时间一般为转染后48h。但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h
加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药。
如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。另外，随着细胞的代谢，抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。
3、克隆筛选注意事项
若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞。若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑。不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。因此，挑克隆时，应尽量多挑几个克隆，20个左右。
4、稳定克隆筛选步骤
（1）有限稀释法步骤
a) 将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可,若细胞生长很快药筛时可以在
10cm的dish中进行）用胰酶消化下来
b) 对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数） c) 计算后，用枪头吸取约200个细胞（其中有部分为死细胞）到10ml培养
液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种
d) 然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul，这样有的孔就可
能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2-3个96孔板）
e) 待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔
划叉，只有一个细胞的孔划勾，以做好标记，如果只有一个细胞的孔数
量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾，但这样克隆就可能不纯。 f) 等细胞长起来以后，从96孔板到24孔板，再到6孔板逐渐扩大培养 g) 细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克
隆是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆并大量培养
h) 首次验证成功的克隆养两周后再次验证，若仍能保持特性，表示筛出的
克隆较稳定，这样较为稳定克隆即可大量培养保种，并进行后续实验
（2）无限稀释法
a) 将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可）用胰酶消化下来
b) 对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数） c) 计算后，吸出约5000个细胞，铺到10cm的dish中，摇匀
d) 待细胞贴壁后，在显微镜下找到单个细胞，用马克笔在dish的底部做好
标记，然后放到孵箱里培养
e) 待单个细胞长成了细胞团（约10个），在显微镜下观察，如果有两个细
胞团靠得很近，则用马克笔在底部做好标记，然后在安全柜内用白枪头刮掉周围舍弃的细胞团，并不断在显微镜下观察，看周围的细胞是否已经都被刮掉。然后换培养液（将刮掉的细胞弃去）
f) 放到孵箱里培养数天（细胞团较大，约一两百个），克隆在肉眼下可见 g) 将培养液倒掉，用PBS洗两遍，再吸10ul的胰酶在标记好细胞团的地方
不停的快速吹打约1-2min，最后将枪头里细胞悬液打到24孔板内培养即为挑出的一个克隆，此过程切记不能过长，以免dish太干导致细胞死亡
h) 照7的方法每种细胞至少挑出15个克隆，培养一段时间后，消化到六孔
板中培养（处理时间根据24孔板内的细胞数量而定）
i) 细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克
隆是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆并大量培养
j) 首次验证成功的克隆养两周后再次验证，若仍能保持特性，表示筛出的
克隆较稳定，这样较为稳定克隆即可大量培养保种，并进行后续实验
范文二：【试剂与仪器】
1 ．小牛血清。
2 ．双抗溶液（链霉素 100μg+ 青霉素 100 单位）。
3 ． DMEM 培养基。
4 ．转染试剂（ LIPOFECTAMINE 2000 ）。
5 ．细胞培养基（ DMEM+10%NCS ）。
6 ． PBS 。
7 ．无血清培养基。
8 ．胰酶（ Trypsin ）。
9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机， 15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和 CCD 。
【操作步骤】
1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为 90% 。细胞铺板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2. 对于每孔细胞，使用 50μl 无血清 DMEM 培养基稀释 0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。
3. 对于每孔细胞，使用 50μl DMEM 培养基稀释 1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。 LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合。保温时间过长会降低活性。
4. 混合稀释的 DNA （由第 2 步）和稀释的 LIPOFECTAMINE 2000 （由第 3 步）。在室温保温 20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持 6 小时稳定。
5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为 0.5ml 无血清培养基。
6. 在 37℃ ， 5 ％的 CO 2 中保温 24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
7. 在细胞中加入复合物 24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
范文三：转染 B 添加义项
DNA小片段插入体细胞或细胞系的过程。若此DNA未与宿主细胞DNA整合而获表达，称“瞬时转染(transient transfection)”；若与宿主细胞DNA整合并随后者的复制而复制称“稳定转染(stable transfection)”。
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transfection ? ?
真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
transient transfection ? ?
stable transfection
标志的过程。
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用
到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
化学转染法
包括：1.DEAE-葡聚糖法，2.磷酸钙法，3.人工脂质体法。DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞
的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法，因为试剂易取得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将DNA和氯化钙混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解.人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及RNA,和蛋白质.此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和人的体内用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内，至于DNA是如何穿过核膜的，其机理目前还不十分清楚.
包括：①显微注射②电穿孔③基因枪等，显微注射虽然费力，但是非常有效的将核酸导入细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但却不适用于需要大量转染细胞的研究。电穿孔法常用来转染如植物原生质体这样的常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关系，基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内，这种方法适用于培养的细胞核在体的细胞.
色准备实验材料。 实验原理 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。" 实验材料
293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（TransFast）
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD
(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟（37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。
(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。
1）转染试剂的准备
A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡，。
2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
5）将混合液在室温放置10—15分钟。
6)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
8）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。
第二次细胞传代
1） 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。
3） 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。
线型PEI（LinePEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI
（BranchedPEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性
也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。
GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。
范文四：细胞转染及其筛选
1. 传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘
向6cm盘中加入3ml培养基，“米”字形摇晃。当细胞生长到50%-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染
2. 配置转染体系：（6cm盘）
2.4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基。混匀后室温静置10-15min孵育。
3. 将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。
4. 将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。
5. 12小时，换液后进行显微镜拍照观察。
6. 再过6h加入G418，进行筛选（始终在6cm盘中进行），使用G418浓度：600ug/ml
G418的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。
7. 3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变，只到细胞呈单
个细胞那种，当细胞死的过多时，可考虑药物浓度减半。筛选出稳定表达的cell。
8. 挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul，在96孔板中加
入培养基150ul/孔，在加入细胞悬液10ul/孔，待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm盘增殖。
2.伴随着细胞的生长，可能最后会变成细胞簇，故可以用黄枪头把细胞菌落挑出，放入24孔板里面。
9. 单克隆鉴定：提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。
10. 先做RT-PCR筛选一部分，在做western继续筛选一部分。
所需物品：1.转染试剂（Attractene Transfection Regent）；2.96孔板；3.24孔板；4.6孔板；5.6cm盘；6.G4187. 1mlHEPES液
范文五：脂质体转染实验步骤
脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤（方法一）：
（1）：取6孔培养板，向每孔中加入2ml含（1-2） x 10^5个细胞
的培养基，37℃、18% CO2培养基40%-60%汇合时。
（2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染1个空细胞所用的
A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。
B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。
轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
（3）转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，
吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。
（5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。
（6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）：
?????????将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%
板底面积。
?????????在试管中配制DNA-脂质体复合物。
a、在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。
b、旋转1s，再加入脂质体悬液，旋转。
c、室温下放置5-10min，使DNA结合在脂质体上。
?????????弃去细胞中的旧液，用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去，向每孔
中直接加入1mlDNA-脂质体复合物，37℃培养3-5天。
?????????再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，继续培养14-24h。
?????????吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM，2ml/
孔，再培养24-48h。
?????????用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。
3、稳定的脂质体转染法：
?????????接种细胞同前述，细胞长至50%板底面积可用于转染。
?????????DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。
?????????在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培养48h。
?????????吸出DMEM，用G418选择性培养基稀释细胞，使细胞生长一定时间，
筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。
细胞转染技术总述
一、细胞转染途径
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于物理介导技术；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体 转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
电穿孔法：靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞。
优点：转染效率较高
缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）；对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞和DNA；每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。
（2）显微注射：借助显微注射器直接把DNA注入核内，使之整合入受体细胞基因组中。
优点：转染效率高，可用于瞬时转染和稳定转染
缺点：导入DNA时需要一个细胞一个细胞注射，不适合大量转染
（3）基因枪：依赖携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞内。
2、 化学介导
（1）磷酸钙共沉淀法：
磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合，氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。
优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染。
缺点：转染效率低：进入细胞的DNA只有１％－５％可以进入细胞核，其中只有不到１％的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。
脂质体转染法：
中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。
优点：适用于把ＤＮＡ转染入悬浮或贴壁培养细胞，可用于瞬时转染和稳定转染；转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍；能够把ＤＮＡ和ＲＮＡ转染到各种细胞，转染的稳定性好，可重复性高，转染时最好不加血清和抗生素。#1048715;
缺点：阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对部分细胞可能会干扰细胞的代谢。
多种阳离子物质介导：
DEAE-葡聚糖介导的转染，其原理还不清楚，可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验，转染效率与 DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系，可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间 (30分钟-1.5小时)，也可用较低浓度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小时)。
3、生物介导
病毒介导的转染：以病毒作为载体,通过病毒感染的方式将外源DNA 导入到细胞中, 其中以逆转录病毒及腺病毒转染系统最为常用。
优点：整和效率高, 可使外源基因在宿主细胞中长期表达，适用于难以转染的原代细胞。
缺点：存在潜在的安全危险性。
二、理想的细胞转染方法
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小、重复性好、安全、简单等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
三、细胞转染分类
瞬时转染：是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞
的染色体上。
稳定转染： DNA整合到宿主细胞的染色体中。
四、报告基因
是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。
常用的报告基因系统：半乳糖苷酶报告系统、素酶报告系统、蛋白报告系统（GFP）等。
五、转染方法
本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞。（别的方法可以参考生产商提供的protocol）
1、转染前1天将0.5～2×105细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。
2、准备复合物
（1） 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。
（2） 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，
轻轻浑匀，室温孵育5分。注意：必须在25分内进行。
（3） 5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。
3、吸去培养板的培养基，用PBS或无血清培养基（最好）清洗细胞2次。
4、将复合物（总体积100ul）加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。
5、将细胞放入培养箱孵育4～6h后，可以更换含血清培养液去除复合物（也可不用）。
6、24～48h后可以观察转入基因表达情况。
7、稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1：10（或更高比例）传代，1天后更换筛选培养基筛选。
8、优化：要保证细胞汇合率达90～95％（比较高）；DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般细胞1：2～3.
范文六：RNAi or siRNA Transfection
以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA Transfection
DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3
转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105
cells/well，中板后随即转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection
*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
范文七：使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染HEK-293T细胞系
慢病毒生产的优化实验步骤
在转染实验前18~24小时，将HEK-293T细胞按照5.0× 105细胞/孔的密度接种到6孔板中，每孔中含有2ml完全生长培养基（60~80%的细胞汇集度）。细胞培养过夜。
经优化的转染结
果。转染质粒：
pGIPZ- eGFP 将X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，DNA和稀释培养基（如
Opti-MEM(R) I Reduced Serum Medium或无血清培养基）孵育到室温
（+15至+25℃）。使用前将转染试剂轻柔混匀。
范文八：一、中性粒细胞初步分选
试剂与耗材：人淋巴细胞分离液、RP1640、15ml离心管4支，棉球，止血带、碘伏、采血针，5mlEDTA抗凝采血管2支。1ml 枪及枪头。
分离步骤：
1. 所有试剂恢复至室温；
2. EDTA抗凝采血管收集人外周血10
3. 分别将5ml外周血加入5ml人淋巴细胞分离液中（15ml离心管中进行）；注意动作轻柔缓缓加入；
4. 500g离心，30-35分钟，室温；
5. 离心后收集低带中性粒细胞，分两层，第一层为单核细胞，第二层为中性粒细胞；（若离心后分层不明显则多离心5-10分钟）
6. 将RP1640用纯水稀释为50%RP1640用于重悬中性粒细胞，恢复细胞活性。（5-10分钟）
7. 400g离心10分钟，去上清，收集中性粒细胞，重悬于RP1640中，细胞计数。
二、中性粒细胞磁珠分选
试剂耗材及设备：磁力分选器，磁柱，CD15磁珠试剂盒，磁珠分选缓冲液50ml，RP1640，1ml 枪及枪头，20微升枪与枪头，15ml离心管4支，细胞计数板。 步骤：
1. 制冰，保证磁力分选器可以放入冰盒内操作，在4-8℃内进行分选；
2. 配液磁珠分选缓冲液（50ml PBS液中含2mmol/L EDTA，0.5%BSA，PH=7.2）；
3. 将上步初步分选的中性粒细胞悬液300g离心10分钟，去上清；
4. 细胞重悬于磁珠分选缓冲液中，107细胞重悬于80微升缓冲液中；（如细胞数多按倍数增加）
5. 107细胞中加入20微升CD15磁珠；充分混匀放入2-8℃避光孵育15分钟；
6. 用1-2ml缓冲液洗涤细胞/107细胞，300g离心10分钟，去上清；
7. 重悬细胞于缓冲液中，108细胞重悬于500微升缓冲液中；
8. 将磁力分选器置于冰盒中，用3ml缓冲液冲洗磁柱；
9. 将含有中性粒细胞的缓冲液加入磁柱中；
10. 用缓冲液冲洗磁柱，每次3ml，冲洗3次；
11. 除去磁场，把磁柱放置于15ml离心管上，用5ml缓冲液加压快速冲洗磁柱；
12. 离心管中收集的便是中性粒细胞； 13. 300g离心去上清，重悬细胞于10ml细胞培养液中，细胞计数。
三、细胞活力检测
1、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。
2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。
3、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。（终浓度0.04%）
4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%
四、细胞分组铺板给药
试剂耗材及设备：六孔板2个，1ml 枪及枪头，20微升枪与枪头，15ml离心管4支，细胞计数板。
10ml外周血大概可分出1×107个细胞；
分为10组：
④PI、AV双染组
⑤PI、AV、CD15三染组
⑥LPS1μg/ml组
⑦LPS+Nec-1 50μg/ml组
⑧LPS+Nec-1 5μg/ml组 ⑨Nec-1 50μg/ml组 ⑩Nec-1
5μg/ml组。
3.铺板，每孔1ml细胞悬液，给药，空白组给予DMSO。（LPS浓度选择1μg/ml，因为此浓度刺激中性粒细胞后出现凋亡率较低，坏死率较高。Nec-1浓度作用于神经细胞为7μg/ml-50μg/ml）
五、细胞凋亡率检测
耗材试剂：1ml 枪及枪头，20微升枪与枪头，1.5ml离心管15个，凋亡检测试剂盒，CD15抗体。
1． 细胞培养一段时间后（3、6、12、24、36小时），离心（2000rpm 离心5min）收集细胞；
2． 用PBS 洗涤细胞二次（2000rpm 离心5min）收集1~5×105 细胞；
3． 加入500μL 的Binding Buffer 悬浮细胞；
4． 加入5μL AV 混匀后，加入5 μL PI，混匀；
5． 室温、避光、反应5～15min；
6． 上机检测，分析结果。
范文九：冻存细胞的实验步骤： 1、 从恒温箱里取出装有 HL60 细胞的培养瓶，拿到超净台里，放在酒精灯火焰上消毒。之 后，打开盖子，再次在酒精灯火焰上消毒，然后，把培养瓶里的培养液倒入离心管里。 2、 离心：去另一支离心管，加入等量的蒸馏水，两个离心管对着放入离心仪里。把时间指 针调到 10.然后，缓慢地将转速指针调到 1. 3、 吸走上清液，注入冻存液：取出带有细胞的离心管，放在火焰上消毒，用吸管吸走上清 液，加入 2mL 冻存液、打散。 4、 分装：用吸管平均分装到两个冻存管里。 5、 冻存细胞： 先放在温度适中的冰箱里 30 分钟， 再移入温度较低的冰箱中 30 分钟， 最后， 放到温度为-80 度的冰箱中。
范文十：细胞培养相关实验
1、复苏细胞步骤：
从-80℃冰箱或者-196℃液氮罐中取出细胞（握手心），快速放在37℃水浴箱（提前预热至37℃）轻轻摇晃至变成溶液。吸取细胞溶液至培养瓶，加入4ml 含10%胎牛血清（FBS）的培养液（DMEM/1640），放37℃、5%CO2敷箱中孵育。 快溶的理由：复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。一般细胞复苏第二天给细胞换液。
2、细胞换液的步骤：
准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1） 从孵育箱取出培养瓶，直接倒去细胞培养液；
2） 用枪从离心管中吸取4ml 含10%FBS的DMEM/RPMI 1640，加入培养瓶中；
3） 酒精喷洒消毒后放入37℃敷箱孵育。
一般2天左右更换细胞培养液，刚复苏的细胞第二天更换培养液。
3、细胞传代的步骤：
准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、FBS，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1）直接倒去培养瓶内的培养液；
2）加入PBS 2ml清洗培养瓶内细胞2次；
3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；
4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；
5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；
6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，后倒去上清液；
7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞；
8）细胞分装传代100～500ul/瓶培养，可按1:（2～4）传代，后加入4～5ml含10%FBS培养液，放入37℃ 5%CO2敷箱中孵育。
4、细胞冻存的步骤：
1）离心后的细胞加入冻存液（DMSO：FBS：DMEM=1:3:6）吹打成单细胞悬液，加入冻存管1ml/管，A、放4℃30分钟，-20℃30分钟，-80℃过夜或者-196℃液氮罐永久保存；或者B、放装有异丙醇的冻存盒直接放-80℃冰箱冻存。 细胞慢冻的理由：当细胞冷到0度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞器逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
二甲基亚砜（DMSO）的作用：是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温(-200℃)保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。深低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。
5、防止细胞污染的一些操作：
1、使用前，操作台用75%的酒精擦拭2次，确保台面干净整洁；
2、操作台使用前用紫外线消毒20～30分钟，不易过长（把除了试剂外的所有用具紫外线消毒）；
3、所有的试剂在放入操作台前必须用75%的酒精喷洒消毒；
4、所有试剂打开的盖子朝下，避免手套接触盖子后被细菌污染；
5、所有的试剂用完马上把盖子盖上，不要长时间暴露在外；
6、所有的试剂使用完毕后瓶口用封口膜贴住防止污染；
7、台面如果有液体，要用消毒干净的纱布擦干净，避免污染瓶盖；
8、如果培养瓶>1月，最好更换瓶子，因瓶内有促细胞贴壁生长的成分；
9、枪头高压消毒后一般用2周左右，超过1月必须重新高压消毒。