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如何选择合适的流式抗体
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如何选择合适的流式抗体
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3秒自动关闭窗口细胞内细胞因子的流式检测实验方法---以Th1和Th2的检测为例
Time： PM 20:43　　Author:bioer　　Hits:　
　　随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limitingdilutionanalysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。&
　　随着多标记及标记细胞技术的出现，使对细的研究推向了一个新的阶段。
　　下面主要介绍胞内细胞因子细胞技术。
&&& 　早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-&&)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
&&&　 近年来，Jung与Picker采用了莫能霉素monensin、佛波酯PMA等药物预孵，用布雷菲（尔）德菌素Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
　　胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。
二、仪器设备及耗材&
1．12&75mm有盖的Falcon管
2．37℃孵箱5%CO2（无CO2也可）&
3．混匀振荡器&
4．离心机&
5．加样枪、Tips(1ul,10ul,100ul,1000ul)&
6．FACS流式细胞仪及配套耗材&
三、所需试剂&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂
&& 依据实验需要选择特殊表面标志
&& CD45圈定所有淋巴细胞　　　　　　 CD3 圈定T淋巴细胞
&& CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群&　　　&& CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群
&& CD19/CD20圈定B淋巴细胞&　　　　&&&CD56圈定NK淋巴细胞
&& CD14圈定单核细胞
2、的荧光标记的单抗试剂
　　依据实验需要选择特殊胞内标志。检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-& 。例如，双色标记IFN&-FITC/IL-4PE 与CD3PerCP 组合是同时研究Th1与Th2型免疫反应常用选择。
　　成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用BFA等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。BD在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。&&
3、FACS溶血素&
　　用于PBMCs、培养细胞与全血制备，主要有3个作用：a、全血制备时用于溶解红细胞；b、固定外表位；c、辅助通透剂。&&&&&&&
　　FACS溶血素使用前用无离子水10倍稀释（1倍溶血素原液加9倍的无离子水），勿用PBS或其它缓冲液。而且FACS溶血素必须与FACS通透液一起使用，即使是培养细胞的检测。必须新鲜配制。&
4、FACS 通透液&&
　　BD推出FACS通透液以确保灵敏性及降低染色背景。此试剂独特之处在于它能克服皂素等其他胞内染色常用通透剂的不足。（由于皂素是植物提取物，组分不均一，常会带来胞内染色的变异）FACS通透液另一优点是它能免除某些方法为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。&
&&&&　 FACS通透液使用前用无离子水或蒸馏水10倍稀释（1倍通透液原液加9倍的无离子水），勿用PBS或其它缓冲液。必须新鲜配制。&
a& 佛波酯(Phorbol12-Myristate13Acetate，PMA)储存液(1&g/&l)&
　　打开装有PMA 的小筒，打开包装，取出1mg 包装的小瓶，打开迅速加入1ml的DMSO或无水乙醇。注意：无菌操作，PMA易挥发，有毒。然后分装到100支1.5ml的EP管中，每管10&l，取出1支待用，其余99支冻存于-70℃或-20℃冰箱。忌反复冻融。
　　每次实验用无菌无叠氮钠PBS1：100稀释储存液，取适量体积，使PMA在全血中的终浓度为20-25ng/ml。注意新鲜配制，每次实验后的剩余液体不可保存再使用。&　　　
b& 离子霉素(Ionomycin)储存液(1&g/&l)&
&&& 　打开包装内含1mg的离子霉素，加入1ml的无水乙醇，然后分装到100 支1.5ml的EP管中，每支10&l，取出1支待用，其余99支冻存于-70℃或-20℃冰箱，忌反复冻融。&
　　每次实验用无菌无叠氮钠PBS1：10稀释储存液，取适量体积，使Ionomycin在全血中的终浓度为1&g/ml。注意新鲜配制，每次实验后的剩余液体不可保存再使用。）
c&& StaphylococcalenterotoxinB(SEB)
&&&& 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL&，4℃储存，SEB终浓度10mg/mL细胞悬液。
　　包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。
　　加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml。&
6、阻断剂：阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内
a& Brefeldin-A（BFA），液体试剂，分装为10ul/管，冻存于-20℃冰箱。忌反复冻融。&
　　每次实验用无菌无叠氮钠PBS1：10稀释储存液, 取适量体积，使BFA在全血中的终浓度为10&g/ml。注意新鲜配制，每次实验后的剩余液体不可保存再使用。）
&&& 注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降!&&
b& Golgistop储存液处理&&&&&&&&&&&
&&& 0.7&l/106个细胞（或每6ml细胞混合液加4&l，混合液的细胞浓度为106/ml ）
c& Monensin&&
7、破膜剂：含1%皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与相应的细胞因子结合。
8、固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液。
9、PBS，1640，无水乙醇，DMSO&&&&&&&&&&&
四、常用的标本类型和处理方法
　　全血：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐使用肝素钠抗凝的真空采血管采血。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞，可能会混淆实验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
　　自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs) ：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
　　组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs) ：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中，调节细胞浓度为2&106细胞/ml。
&&& 　细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2&106细胞/mL于新鲜培养基中。
&&&　 冰冻全血与PBMCs：使用1&红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，-70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2~3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。
五、细胞培养和刺激的基本方法&
　　细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。&
　　　　　表1　细检测推荐的阳性对照活化方法
检测细胞因子&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&阳性对照刺激方法
&检测细胞因子&&
&阳性对照刺激方法
&人IFN-&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法2(4-24h)
&人Fractalkine/CX3CL1&
&人TIMP-1&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-8/CXCL8&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24h)
&人TNF-a&&&&
&方法7(6h)
&人MCP-1&/CCL2&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24h)
&人IL-1&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(6h)
&人MIP-1&/CCL3&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24 h)&
&人IL-1b&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24h)
&人MIP-1 /CCL4&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法3(24h)&&
&人IL-2&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法2(4-24h)
&人RANTES/CCL5&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-4&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠IL-2&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-5&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠IL-4&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&单核细胞：方法3(6-12h)
&T细胞：方法6
&小鼠IL-5&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-10&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠IL-6&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&人IL-12&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠IFNg&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&方法9or 方法12
&人IL-15&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&小鼠TNF-a&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
　　为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6h，需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&表2　细胞因子活化方法
&只使用转染细胞检测
&人的PBMCs使用PMA(10ng/ml) 和Ionomycin(1uM) 刺激4-24h.
&人的PBMC 使用LPS(0.5-1ug/ml) 刺激24h.&
&人的PBMCs或者纯化的CD4+细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10ng/ml）和IL-4（10ng/ml）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA(10ng/ml) 和Ionomycin (1uM)刺激6h&&&
&CD4+T细胞使用PHA(10ng/ml) 刺激4days
&T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1&(Lorre,etal.,1994,ClinImmuno Immunopath70:1)
&使用PMA(50ng/ml) 和Ionomycin(500ng/ml)刺激
&PBMCs细胞使用重组人IFNg (10ng/ml) 刺激2h，然后使用IFNg (10ng/ml)+LPS(1ug/ml) 刺激22h或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2ug/ml)+PMA(5ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml) 刺激6h&&&&
&CD4+T细胞在包被小鼠CD3(25ug/ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10ng/ml）和IL-4（50ng/ml）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5ng/ml)、Ionomycin(500ng/ml)和monensin刺激6h。
&小鼠ip巨噬细胞使用Mouseip1ug/mlLPS 刺激24h
&小鼠脾细胞使用PMA(5ng/ml)和Ionomycin(500ng/ml)刺激6h
六、实验样品组的激活与染色：（以Th1 和 Th2 的检测为例）
&&& CD3-PerCP&&&&&&&&&&&&CD69-PE&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& CD4-PerCP-Cy5.5&
&&& CD8-APC&&&&&&&&&&&&&& IFN-r-FITC/IL-4-PE&&&&&&&&&& IgG2a-FITC/IgG1-PE&&
&（一）分组与对照&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&空白对照组
激活对照组
阻断对照组
实验检测组
全血+1640（各500ul）
1、实验检测组：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&& 取1支有盖的Falcon管，取全血或PBMCs（细胞数在 0.5-1&106）500&l，加入500&l RPMI1640进行稀释一倍，管中加入下述刺激剂，混匀。(顺序是1640+刺激物+血)& 最后在全血中的终浓度：PMA：20ng/ml；离子霉素：1&g/ml；BFA：10&g/ml。
2、空白对照组：检测未做人工干预时细胞状况。500ul混匀全血+500ul的1640，与刺激血共孵育，37℃4h。&
3、激活对照组：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否。如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。&&
　　取500ul混匀全血+500ul的1640，加PMA+Ionomycin（PMA和Ionomycin的用量同实验检测组）。但是不加莫能霉素或BFA（抑制分泌试剂如BFA）会影响CD69表达，需去除以进行表面标志检测。
4、阻断对照组（未刺激对照）：&
&&& 　检测做人工刺激，但加入 Golgistop（或 BFA）时细胞分泌因子状况。500ul混匀全血+500ul的1640，加入Golgistop（或BFA）与刺激血共孵育[用量同实验组]，37℃4小时。
　　激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。
　　正确的系统对照可以减小误差。&&&
&&& 　有些实验室此时将细胞外的抗体与刺激剂同时加入（抗体加入量根据各实验室及不同实验而定），实验效果也很好，但注意培养时要避光。将所有刺激剂（及抗体）加好后（包括各对照组），混匀，松盖，37℃5%CO2（或避光）孵育4-6h（有的实验室采取过夜孵育，或孵育4-6h后放入4℃（或避光）保存，第二日再进行下面的操作。&
（二）激活检测&&&
1、各组按照下表进行染色，检测标本激活情况。试剂用量请依照说明书。&&
&空白对照组
&激活对照组
& 阻断对照组&&&&&&
&实验检测组
&同型对照管
&IgG1-PE&&&&&
&CD3-PerCP&
&CD3-PerCP
&实验检测管
&CD69-PE&&&&&&&&
&CD69-PE（胞内）
&CD69-PE（胞内）
&CD3-PerCP
&CD3-PerCP&&&&&&&&&
&CD3-PerCP&
&CD3-PerCP
&2、染色过程
&（1）胞外染色&
　　按照上述表格将抗体（胞内抗体除外）加入到相应的管中，分组加入不同的刺激好的标本，200&l/管。避光20 min。&&&
&（2）裂解红细胞&
　　每管加入10倍稀释后的溶血素2ml，室温避光10 min。取出，1200转，离心5 min，弃上清。（因刺激后的血较难溶血，可适当延长溶血时间，溶血后的溶液有浑浊，且离心后会有红色的沉淀产生。）&
&（3）破膜&
　　各管加入 0.5ml 10倍稀释后的通透剂，室温避光10 min。加入 2ml的PBS，1500转（500g），离心5 min。弃上清。
&（4）胞内染色&
　　实验检测组管中和阻断对照组管中加入胞内染色的抗体（CD69PE）。混匀，室温避光30 min。加入2ml的PBS，1500转（500g），离心 5 min，弃上清。每管加入500ul的PBS，待上机。&
&（5）检测并鉴定&&
　　激活对照阳性率大于90%为标本激活的基本标志。如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。&&
　　实验检测组通过胞内CD69染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于90%而胞内CD69未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。&
&& 　用CD3-PerCP 来进行圈门并设置域值，检测CD69的阳性水平。
&& A、空白对照组（不加PMA，离子霉素和BFA）&
&& B、激活对照组（只加 PMA 和离子霉素）
&& C、阻断对照组（只加BFA）&
&& D、实验检测组（加PMA，离子霉素和BFA）&
&&& 　若激活情况不理想，建议寻找原因并重新进行实验。请勿进行以下实验。
（三）胞内细胞因子分泌检测
1、各组按照下表进行染色，检测标本激活情况。&&
　　根据机器状况，常用为三色法和四色法。&&
（1）三色法：&&
&阻断对照组&&&
&试验检测组
&同型对照管
&IgG2a-FITC/ IgG 1-PE（内）
&IgG2a-FITC/ IgG 1-PE （内）
&CD4-PerCP-Cy5.5&&&&&
&CD4-PerCP-Cy5.5&
&实验检测管&&
&IFN-r-FITC/IL-4-PE （内）&&
&IFN-r-FITC/IL-4-PE&&& （内）
&CD4-PerCP-Cy5.5&&&&
&CD4-PerCP-Cy5.5
　　如果用CD4做表面标记，由于PMA刺激后淋巴细胞表面的CD4结合位点在胞外会特异性减少（多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调），所以培养时间不能太长，4-6h为宜，否则CD4下调影响分析。在机器条件允许的情况下，建议使用四色法。
（2）四色法：&&&&
&阻断对照组&&
&实验检测组
&同型对照管
&IgG2a-FITC/ IgG 1-PE（内）
&IgG2a-FITC/ IgG 1-PE（内）
&CD3-PerCP&&
&CD3-PerCP
&实验检测管&
&IFN-r-FITC/IL-4-PE（内）&
&IFN-r-FITC/IL-4-PE（内）
&CD3-PerCP&&&&&&&&&&&&&&&&&
&CD3-PerCP
&2、染色过程
（1）胞外染色&
　　按照上述表格将抗体（胞内抗体除外）加入到相应的管中，分组加入不同的刺激好的标本，200&l/管。避光20 min。&&&
&（2）裂解红细胞&
　　每管加入10倍稀释后的溶血素2ml，室温避光10 min。取出，1200转，离心5 min，弃上清。（因刺激后的血较难溶血，可适当延长溶血时间，溶血后的溶液有浑浊，且离心后会有红色的沉淀产生。）&
&（3）破膜&
　　各管加入 0.5ml 10倍稀释后的通透剂，室温避光10 min。加入 2ml的PBS，1500转（500g），离心5 min。弃上清。
&（4）胞内染色&
　　实验检测组管中和阻断对照组管中加入胞内染色的抗体（IgG2a-FITC/IgG 1-PE或IFN-r-FITC/IL-4-PE）。混匀，室温避光30 min。加入2ml的PBS，1500转（500g），离心 5 min，弃上清。每管加入500ul的PBS，待上机。（若短时间内无法上机，请加入适当的固定剂，并4℃避光保存）&&
&（5）检测并鉴定&&&&&&&&&&&&
&&&& 上机检测：CellQuest 软件。&
&&&& 应用BD FACS 流式细胞仪分析。&
&&&& 使用CaliBRITE 标准微球，调节流式细胞仪PMT 电压、荧光补偿、灵敏度。&
&&&& 用CellQuest 获取，用荧光或FSC设阈值，一般门内收集10 万细胞。&
&&&& 设门圈定FL3+细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用CellQuest，Attractors分析数据。&
三色细胞因子检测图：
1、阻断对照组（只加BFA），细胞因子分泌情况&
&&&&&&&&&&
2、实验检测组（加PMA，离子霉素和BFA），细胞因子分泌情况&
&&&&&&&&&&&&&&&&&
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【求助】流式细胞抗体浓度选择
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这个帖子发布于4年零312天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
小弟刚接触流式细胞仪，我想测人全血细胞表面抗原TLR4的表达，抗体选用的是abcam的荧光标记单克隆抗体100ug，用量是 2-5?g for 106 cells。我用0.5ml检测，裂解完红细胞，里面还有血小板等，细胞数目很大，需要抗体太多，实验经费有限，现想请教各位大侠，通过什么方法可以节约抗体？
不知道邀请谁？试试他们
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以前有的站友就求助过这一个问题。这是我以前给出的答案：有的公司，例如BD，会给出推荐的使用量，可以先做个tiration看看那个最合适。一般公司标明的量都会过多，我的经验是很多抗体只用三分之一到二分之一的的推荐量就可以了。对已一些高表达的标志性抗原，例如CD4，CD8，CD44等，用五分之一都可以了。原帖链接如下
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一般不用考虑血小板问题，protocol中的细胞数一般为有核细胞,常规可从减半用
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流式细胞只考虑有核细胞吗？但我测的TLR4在血小板上也有表达， 也会消耗抗体，请问大侠怎么办？
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还有上面的大侠，小弟请问ebioscience公司的抗体怎么样？
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流式不用把你所有的细胞都用了，你可以只用一部分细胞染色上流式，只要流式圈门最后得到的细胞量能够符合你的要求就够了。我一般只收门内10000个细胞，如果染色比例比较低的话就收2个。所以就常规的每个样100000个细胞总量来说就够了。另外流式抗体多数可以稀释很多倍使用，你可以做个梯度摸一下看看，如果是分群的实验就很好说话，只要能够清楚的把门给圈出来就好了。其实里面调调电压就完全能够弥补抗体用量相对少的问题，因为敏感性好的抗体不在乎。我原来多数用的是BD和ebioscience的抗体，都是10分之1的推荐抗体浓度使用的，不过不同的抗体还不一样，你还得自己试。如果你检测的东西是个不分群只看量多少，如峰位置平移的实验可以考虑改用western，反正你细胞多也够用，在流式上FSC-SSC圈门出来收回细胞就能做了，还能大体分出白细胞亚群，都不用抗体，浪费点PBS而已。另外血小板很小，在FSC-SSC上你只要圈出来的细胞不是很小就能避免，不用怕。一般在阈值里面就已经将这个大小的细胞给略去了，你都看不到。至于说TLR4表达，最多表达的还是白细胞，血小板的总量也没那么大，所以也不用怕，尽管做就是了。
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丁香园准中级站友
zhouzhou 流式不用把你所有的细胞都用了，你可以只用一部分细胞染色上流式，只要流式圈门最后得到的细胞量能够符合你的要求就够了。我一般...说得很对。楼主或许可以用低速离心去除血小板，抗体用量你要自己做Titration来确定。
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谢谢各位大侠，我在想想，谢谢！
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细胞表面抗原的流式检测
细胞表面分子抗原的流式荧光检测是最常用的细胞分析方法之一。美国eBioscience公司为小鼠、人和大鼠CD分子和其它膜分子提供了近乎完全的荧光标记抗体和纯化抗体，成为实验者研究工作的完美解决方案。
细胞表面抗原流式检测的一般步骤
一、实验材料
检测管（如：FalconCat.No.2008）或96微孔板（FalconCat.No.3910）
一抗（标记或纯化）
Anti-CD16/32抗体用于封闭Fc片段造成的非特异结合干扰（可选）
荧光二抗（间接标记染色）
缓冲液：eBioscienceFCStainingBuffer（Cat.No.00-4222）或PBS（PH7.4）
设备：移液器、离心机、冰盒或冰箱、流式细胞仪
二、注意事项
1.抗体在使用之前迅速离心几秒，使所有的液体都集中到管底。
2.尽量避免直标抗体之间的聚集。
3.抗体应避光4℃保存，避免冻结。
4.&样本的固定保存或较长时间放置可能会影响细胞表面分子和抗体之间的结合，故建议尽可能使用新鲜样品。
三、操作方法
A．小鼠淋巴组织细胞表面抗原的流式检测步骤
（一）样品制备
1.&&取出小鼠淋巴组织块，迅速浸泡在10ml的StainingBuffer中，并用注射器的活塞研磨或使用两块预冷的载玻片研压成单细胞。
2.&&把悬液转移到50ml的锥形管中静置片刻，使细胞团块和碎片沉降到管底，并通过尼龙网(如FalconCat.No.2350)过滤成单细胞悬液。
3.&4℃下300-400g离心4-5分钟，弃去上清液。
4.&如果该样品为脾脏细胞，加入一定量的RBClysis裂解红细胞，或者用分离液分离出淋巴细胞。若为其它样品，略去此步骤。
5.&&加入50mlstainingBuffer重悬细胞后计数，根据需要用台盼蓝(TrypanBlue)进行细胞活性检测。
6.&&离心细胞液并弃去上清；用适量的StainingBuffer重悬细胞为2×107个/ml。若采用直接标记的一抗，则加入CD16/32抗体（0.5-1ug/106细胞）冰上孵育5-10分钟。
（二）细胞荧光染色步骤
1.在每个流式检测管或板式微孔中加入50ul的稀释后的一抗（抗体用StainingBuffer稀释成合适的浓度）；在空白管/孔或同型对照管/孔中加入50ulStainingBuffer。若进行抗体最佳浓度测试，建议范围2-0.03ug/106细胞。
2.&在各管/孔中分别加入50ul细胞悬液（约106细胞），并轻轻混匀。
3.&避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分钟。
（注：有些抗体可能需要更长的孵育时间，建议实验者进行预试验摸索）
4.&孵育完成后，加入StainingBuffer（每流式检测管中加2ml，而每微孔中加200ul）
5.&4℃下300-400g离心5分钟，并弃去上清。
6.&重复洗涤过程3次。
7.&重悬细胞后上流式仪检测。
a)&若使用的一抗是荧光直接标记抗体，用500ulStainingBuffer重悬细胞后上机检测。
b)&若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入50-100ul稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素（用StainingBuffer稀
释成合适的浓度）后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-30分钟。洗涤细胞两次（参考第4步和第5步方法）。之后500ulStainingBuffer
重悬细胞，并上机检测。
8.试验结果分析。
&（注：若要对多个细胞表面抗原进行多色标记，则同时加入荧光标记抗体后按以上操作步骤进行孵育和细胞洗涤；操作尽量保持在避光和4℃左右的温度下进行。）
B．人外周血细胞表面抗原的流式检测步骤
1.&在每个流式检测管或板式微孔中加入50ul的荧光标记或生物素标稀释后的一抗（抗体用
StainingBuffer稀释成合适的浓度）；在空白管/孔或同型对照管/孔中加入50ulStainingBuffer。（eBioscience
公司tests规格抗体为即用型抗体，每个检测管中加入20ul该类抗体）
2.&每管分别加入100ul全血，并轻轻混匀。
3.&室温避光孵育15-30分钟。
（注：有些结合能力较低的抗体可能需要更长的孵育时间，建议实验者进行预试验摸索）
4.&每管分别加入2mlRBClysisBuffer（之前预热恢复至室温），混合均匀。
5.&室温避光孵育10分钟，此孵育时间不要超过15分钟。
6.&室温300-400g离心5分钟，并弃去上清。
7.&用2mlStainingBuffer洗涤细胞一次。
8.&重悬细胞后上流式仪检测。
a)&若使用的一抗是荧光直接标记抗体，用500ulStainingBuffer或2%的多聚甲醛固定液重悬细胞后上机检测。
b)&若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入50-100ul稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素（用StainingBuffer稀
释成合适的浓度）后于室温避光孵育15-30分钟。洗涤细胞1-2次（参考第7步方法）。之后500ulStainingBuffer或2%的多聚甲醛固
定液重悬细胞，并上机检测。
8.试验结果分析。
&（注：若要对多个细胞表面抗原进行多色标记，则同时加入荧光标记抗体后按以上操作步骤进行孵育和细胞洗涤；操作尽量保持在避光条件下进行。）
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