控制菌检查_中华文本库
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控制菌检查
控制菌检查是用于检查某些特定微生物，规定按一次检出结果为准，不再复试。 由于控制菌为一次性报告试验结果，故应注意方法的有效性确证（方法验证或阳性对照）、实验过程保障和结果确证，以提高检验结果的可靠性。既要避免漏检造成的假阴性结果，又要避免实验室污染造成的假阳性结果。
控制菌检查中，涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等，应在专门的阳性菌实验室进行。除另有规定外，阳性菌实验室应符合国家二级生物安全标准，阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。
目标控制菌的标准菌株：
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌培养物少许接种至10ml营养肉汤培养基内，置30-35℃培养18-24小时，取均匀培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含菌10-100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后基数确定。
验证方法：
取规定量供试液和10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，按相应的检查法进行检查。当进行薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接至增菌培养基中。
取10-100cfu试验菌加入增菌培养基中，按相应的检查法进行检查。 阴性对照
取相应的稀释液替代供试液，按相应控制菌的检查法进行检查。
阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。
验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。
（一）大肠埃希菌
大肠埃希菌即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便的污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药必须检查大肠埃希菌。 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸和靛基质试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、indole试验为阳性或阴性即可报告结果。
原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明96%的大肠埃希菌含-葡糖苷酸酶，约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%
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灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法验证
赵加强1 周荣光1,2 杨兆祥1 王金3 袁正东2 1 昆明制药集团股份有限公司，云南昆明650100； 2 昆明医科大学，云南昆明 昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650224【摘要】目的：建立灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010版要求，采用常规法对代表性的细菌、霉菌、酵母菌进行回收率测定，并对控制菌检查法进行方法学验证。结果：采用常规法，5种试验菌的回收率均大于70%。结论：可采用常规法对灯盏花乙素苷元进行微生物限度检查。教育期刊网 关键词 灯盏花乙素苷元；微生物限度检查；方法学验证【中图分类号】R927 11【文献标志码】 A【文章编号】15)01-0032-02灯盏花乙素苷元又名野黄芩素，是灯盏花乙素在人体内的代谢产物，具有抗血栓、抑制血小板聚集、增加脑血管血流量等药理活性，其生物活性是灯盏花乙素的5倍以上［1］。灯盏花乙素苷元天然存在于灯盏花等植物中，但含量极低，不到万分之一。我们以灯盏花素（主要成分为灯盏花乙素）为原料，采用人工半合成方法实现了灯盏花乙素苷元的批量生产［2］。本文旨在按照中国药典的要求［3］，建立灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法。1仪器与材料1 1仪器HTY-2000A集菌仪（杭州高得医疗器械有限公司）；开放式集菌器（北京牛牛基因技术有限公司）；303-6B隔水式恒温培养箱（南通科学仪器厂）；霉菌培养箱（上海跃进医疗器械有限公）。1 2供试样品灯盏花乙素苷元（批号：、120827，昆明制药集团股份有限公司药物研究院）。1 3培养基改良马丁液体培养基（批号：120327）、改良马丁琼脂培养基（批号：120319）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：120207）、营养肉汤培养基（批号：120122）、营养琼脂培养基（批号：111225）、胆盐乳糖培养基（批号：120415）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基（批号120622）均由北京三药科技开发公司提供。1 4菌种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ［CMCC(B)63501］、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ［CMCC(B)26003］、大肠埃希菌Escherichia coli ［CMCC(F)44102］、白色念珠菌Candida albicans ［CMCC(F)98001］、黑曲霉Aspergillus niger ［CMCC(F)98003］均由中国药品生物制品检定所提供。2实验方法2 1菌液制备分别接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于32～35℃培养24 h，用0 9%的无菌氯化钠溶液以10倍稀释法稀释至10-5～10-7，制成每1ml含菌数为50～100 cfu的菌悬液备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于24～26℃培养48 h，用0.9%的无菌氯化钠溶液以10倍稀释法稀释至10-4～10-6，制成每1 ml含菌数为50～100 cfu的菌悬液备用。 取黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，于24～26℃培养7 d，用5ml 0 9%的无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，取洗脱液以10倍稀释法稀释至10-4～10-6，制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。2 2供试液制备取供试样品10g于灭菌容器中，加入pH7 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，混匀，得1∶10的供试液备用。2 3菌落计数方法及验证2 3 1菌落计数方法采用常规法对细菌、霉菌及酵母菌进行菌落计数，通过回收率测定进行方法学验证［3］。2 3 2回收率测定试验组：取1∶10供试液1ml、含50~100cfu试验菌的菌液1ml加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。在加有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液的平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于32～35℃培养48 h，观察记录菌落数；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于24～26℃培养72 h，观察记录菌落数。菌液组：取含50~100cfu试验菌的菌液1ml加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。在加有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液的平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于32～35℃培养48 h，观察记录菌落数；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于24～26℃培养72 h，观察记录菌落数。供试品对照组：取1∶10供试液1ml加入平皿中，共制备10个平皿。在5个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于32～35℃培养48 h，观察记录菌落数；在另外5个平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于24～26℃培养72 h，观察记录菌落数。回收率计算方法：试验组的菌回收率（%）=（试验组菌落数平均值-供试品对照组菌落数平均值）/菌液组菌落数平均值×100%。2 4控制菌（大肠埃希菌）检查方法及验证2 4 1控制菌检查方法采用常规法对控制菌大肠埃希菌进行检查。2 4 2控制菌检查方法的验证试验组：取1∶10供试液10ml，含50~100 cfu大肠埃希菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。阳性对照组：取含50~100cfu大肠埃希菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。阴性菌对照组：取1∶10供试液10ml，含50~100 cfu金黄色葡萄球菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。供试品对照组：取1∶10供试液10ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。检查方法：分别取上述试验组、阳性对照组、阴性菌对照组和供试品对照组的培养物0 2 ml接种至装有5ml MUG培养基的试管内，32～35℃培养24h，在366nm紫外线下观察，若管内培养物出现荧光，为MUG荧光阳性；否则，为MUG荧光阴性。观察后滴加靛基质试液，若液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；若液面颜色无变化，为靛基质阴性。3结果由表1可见，采用常规法验证，枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均大于70%，说明灯盏花乙素苷元对上述5种菌株无明显抑制作用。由表2可知，灯盏花乙素苷元的控制菌检查可按常规法进行。4讨论灯盏花乙素苷元为人工半合成，不同生产工艺下得到的灯盏花乙素苷元产品，其所含杂质或溶剂残留成分往往不尽相同，其抑菌行为或抑菌作用的强弱程度也往往不同。因此，当灯盏花乙素苷元生产工艺或方法发生变动时，应对产品的微生物限度检查方法进行重新验证。微生物限度检查是药品质量检查的重要内容。在人工合成药物的研制过程中，一些研究机构或研究人员往往只注重产品本身的化学成分质量研究，而忽视或根本不进行产品的微生物限度检查或方法学研究，这是不科学、不合理的。按照《中国药典》的要求，应对用于非规定灭菌制剂的合成原料药进行微生物限度检查及方法学验证，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。灯盏花乙素苷元对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌5种菌株无明显抑制作用，可采用常规法对其进行微生物限度检查。教育期刊网 参考文献［1］车庆明，潘丽怡，陈颖，等．灯盏花乙素苷元的药动学研究［J］．中国药学杂志，)：.［2］周荣光，晏泽宇，赵加强，等．野黄芩素的制备、纯化与结构表征［J］．光谱实验室，)：.［3］国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）［S］．北京：中国医药科技出版社，2010，附录：108-110.(收稿日期：)
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网友评论《灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法验证》
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微生物限度检查法
范文一：微生物限度检查检验 方法验证方案
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建立微生物限度检查方法验证， 以确保采用的方法适合该样品的微生物限度 检查。
概述 微生物限度检查：细菌、霉菌及酵母菌和控制菌。
验证原理 通过比较试验组中试验菌的恢复生长结果来评价整个验证方法的准确 性、有效性和重现性
验证组织及人员组成 验证人员组成与职责 人员 组长 组员 蒋晨婷 质量部 验证操作、数据分析、报告编制 庄雅萍 严嘉莉 部门 质量部 质量部 职责 审批验证方案及报告、组织协调培训 方案制订、验证操作、数据分析、报告编制
人员培训： 中国药典（2010 年版） MEBO SOP 6.4-11《高压蒸汽灭菌锅使用标准操作规程》 MEBO SOP 6.4-15《超净台标准操作规程》 MEBO SOP 6.4-16《烘箱标准操作规程》 MEBO SOP 6.4-19《培养箱标准操作规程》 MEBO SOP 6.4-21《生物安全柜标准操作规程》 MEBO SOP 6.4-13《电子天平标准操作规程》 MEBO SMP 7.6-01《菌种管理制度》
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《高压蒸汽灭菌锅使用标准操作规程》 《超净台标准操作规程》 《烘箱标准操作规程》 《培养箱标准操作规程》 《生物安全柜标准操作规程》 《电子天平标准操作规程》 《菌种管理制度》
MEBO SOP 6.4-11 MEBO SOP 6.4-15 MEBO SOP 6.4-16 MEBO SOP 6.4-19 MEBO SOP 6.4-21 MEBO SOP 6.4-13 MEBO SMP 7.6-01
验证用的测试仪器： 仪器名称 立式压力蒸汽灭菌器 超净工作台 电热恒温鼓风干燥箱 培养箱 培养箱 型号 LS-B50L VL-5 DHG- RC030000TVBB 制造厂商 上海市计量测试研究院 造鑫企业有限公司 上海一恒科技有限公司 REVCO 上海阳光实验仪器有限公司
验证实施 验证时间安排 时间 2011 年 10 月 19 日～ 2011 年 10 月 21 日 2011 年 11 月 23 日～ 2011 年 11 月 28 日 2011 年 11 月 28～ 2011 年 30 日 项目 确定验证方案：验证方案 的编制、审批、确定 验证实施：验证前确认、 准备工作和验证操作工作 验证总结及后续措施：数 据分析、汇总，验证报告 编制、审批，落实纠正预 防措施 部门 质量部 生产部 质量部 责任人员 庄雅萍 严嘉莉 沈剑洪 严嘉莉 庄雅萍 质量部 严嘉莉 蒋晨婷
验证操作 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证
6.2.1.1 菌种 检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代 （从菌种保存中心获得的冷冻干
燥菌种为 0 代） ，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物 学特性。 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococc
us aureus）[CMCC(B)26003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus 白色念珠菌（Candida subtilis）[CMCC(B)63501]
albicans）[CMCC(F)98001]
黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)9.1.2 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养 肉汤培养基或营养琼脂培养基中，30～35℃培养 18～24 小时；接种白色 念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23～ 28℃培养 24～48 小时，上述培养物用 0.9％无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50～100cfu 的菌悬液。 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼 脂斜面培养基中，培养 5～7 天，加入 3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过 滤菌丝的无菌毛细吸管）到无菌试管内，用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50～100cfu 的孢子悬液。 6.2.1.3 验证 验证试验至少应进行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次回 收率。 1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液 1ml 和 50～100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取定量试验可能 用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入 50～ 100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定取菌数。 2）菌液组 测定所加的试验菌数。 3）供试品对照组
取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时， 应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为 每 1ml 供试液含 50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方 法测定其菌数。 5）结果判断 在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的 平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于 70％。若试验 组的回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值 占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于 70％，照该供试液制备方法 和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组 的菌回收率低于 70％，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过 滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重 新进行方法验证 6.2.2 控制菌检查方法的验证 验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验 证的菌株， 验证大肠
菌群检查法时， 应采用大肠埃希菌作为验证菌株。 验 证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。 6.2.6.1 菌种 检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干 燥菌种为 0 代） 并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学 ， 特性。 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas 6.2.2.2 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养 aeruginosa）[CMCC(B)10104]
肉汤培养基或营养琼脂培养基中， 30～35℃培养 18～24 小时。 0.9％ 用 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数 10～100cfu 的菌悬液. 6.2.2.3 验证方法 1）试验组 取规定供试液及 10～100cfu 试验菌加入增菌培养基中， 依相应控制菌检 查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗， 试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜 接入增菌培养基中。 2）阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验 组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金 黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的 阴性对照采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。 3）结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液 制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验中未检出试 验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等 方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法的验 证。 6.3 若通过验证，证明检验方法适宜，但存在不足或有可改进之处，质量部 应在验证报告中提出相关纠正与预防措施。并对措施进行落实。 6.4 若验证结果表明检验方法不适宜，应针摸索新的检验方法，并再次对其 进行验证，至验证结果显示检验方法适宜，方可使用其检验方法进行微 生物限度检查。 6.5 质量部参与并监督验证全过程。
7 记录表格 7.1 试验样品 样品 1
名称 批号 确认人： 7.2 日期：
产品试验组微生物生长情况：批号： 产品试验组计数结果（cfu/皿） 菌种名称 1 2 平均值
大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 检验人： 7.3 日期： 复核人： 日期：
供试品对照组微生物生长检查情况：批号： 供试品对照组计数结果（cfu/皿） 菌种名称 1 2 平均值
大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲
霉 检验人： 日期： 复核人： 日期：
稀释剂对照组微生物生长检查情况：批号： 稀释剂对照组计数结果（cfu/皿） 菌种名称 1
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大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 检验人： 日期： 复核人： 日期：
7.5 菌液组微生物生长检查情况：批号： 菌液组计数结果（cfu/皿） 菌种名称 1 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 检验人： 日期： 复核人： 日期： 2 平均值
7.6 稀释剂对照组菌回收率计算 菌种名称 批号 菌落计数（cfu/皿） 稀释剂对照组 菌液组 回收率
大肠埃希菌 平均值
金黄色葡萄球 菌 平均值
枯草芽孢杆菌 平均值
白色念珠菌 平均值
黑曲霉 平均值 表中：回收率=供试品对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×100%； 回收率应均不低于 70％ 检验人： 日期： 复核人： 日期：
7.7 试验组菌回收率计算 菌落计数（cfu/皿） 菌种名称 批号 试验组 供试品 对照组 菌液组 回收率
大肠埃希菌 平均值
金黄色葡萄球 菌 平均值
枯草芽孢杆菌 平均值
白色念珠菌 平均值
黑曲霉 平均值 表中：回收率=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）÷菌 液组的平均菌落数×100%；回收率应均不低于 70％ 检验人： 日期： 复核人： 日期：
7.8 结果说明 经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 黑曲霉的回收率分别为： 稀释剂回收率为： %、
7.9 结论 以上验证结果证明，本品 微生物限度检查。 （适合/不适合）采用上述方法进行
漏项和偏差评估：
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对验证结果的评估应包括： （1）验证试验是否有遗漏？ （2）验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经 过批准？ （3）验证记录是否完整？ （4）验证试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理？ 是否需要进一步补充试验？处理过程均应记录备案。 （5）改进的建议（如有） 。
范文二：摘要：目的：探讨抗菌药物微生物限度的检查方法。方法：通过薄膜过滤这种方法检查三种不同的抗菌素对应的生物限度情况，获得如下考察指标：检出的活菌率和回收率，验证薄膜过滤法。结果：平皿法与薄膜过滤法的细菌检出数、大肠埃希氏菌回收率、金黄色葡萄球菌回收率及白色念珠菌回收率相比差异均具有显著性（P　　关键词：抗菌药物；微生物；限度检查；方法 　　【中图分类号】R94 【文献标识码】A 【文章编号】（7-01 　　抗菌药富含抑菌成分，如果能够借助正确科学的方法将抑菌成分消除，就可以很好的将检出微生物的几率予以提高。薄膜过滤这种方法在2010年版的药典里面得到了很好的补充，而且生物限度检测的各种方法里面，薄膜法越来越完善[1]，本文通过实验比较的方法，对常规方法以及薄膜法在检查抗菌药物对应的微生物限度的情况对应的回收率以及检出率这两个指标。具体描述如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料：（1）仪器。对过滤器进行无菌检查，无菌检查的设备还包括了高压灭菌器和细菌培养箱（温度介于三十度到三十五度之间），并且对型离心机以及天平进行分析。（2）菌种，主要有如下三种：葡萄球菌（为金黄色）、念珠菌（为白色）以及大肠埃希氏菌。（3）试剂共有如下六种：氯化钠与蛋白胨，以及四种培养基（沙氏、营养琼脂、BL增菌与玫瑰红钠琼脂）。（4）三种胶囊样品，分别为诺氟沙星、阿莫西林以及头孢氨苄。 　　1.2 制备：（1）制作并且准备冲洗剂。制作NaCl溶液（浓度0.9%）和蛋白胨NaCl溶液（浓度0.1%）作为缓冲液，温度为121摄氏度，进行30分钟的高压灭菌处理。（2）制作并且准备菌液。将新鲜的培养物葡萄球菌（金黄色的）以及大肠埃希菌接种到营养肉汤这种培养基之上，在30到35度的条件下，培养18到24个小时，而后放置于浓度为0.9%的无菌NaCl溶液，和标准的比浊液进行比对，基本上相同，选为原液。选取一定的原液并且进行对比稀释，在细菌数大约介于50到100cfu.mL-1的时候以备使用。将新鲜的培养物白色念珠菌接种到经过改良了的马丁培养基里面， 在23到28度的条件下，培养24到48个小时，而后放置于浓度为0.9%的无菌NaCl溶液，和标准的比浊液进行比对，基本上相同，选为原液。选取一定的原液并且进行对比稀释，在细菌数大约介于50到100cfu.mL-1的时候以备使用。（3）对供试液予以认真的制备.选取10克样品放入100毫升的0.9%的无菌NaCl溶液里面，作为供试液，在这个过程中，如果存在不溶颗粒，可进行5分钟的离心，转速保持在每分钟500r即可，将上层液取出备用。 　　1.3 验证方法：（1）菌落计数方法：结合菌数报告，选取稀释级符合要求的供试液一毫升放入到无菌平皿里面，将温度低于四十五摄氏度的培养基（可以是营养琼枝，也可以是瑰红钠琼脂）注入，培养基的量介于十五毫升到二十毫升，经过均匀的混合，等到凝固之后，进行倒置，予以培养。对每个类型不一样的稀释级细菌进行平板的制备，制备的数量至少要有两个。 （2）薄膜过滤方法：滤膜对应的孔径应该小于等于0.45μm，一般情况下，直径是50毫米，对应的滤膜要能够充分的截留相关微生物，用前，灭菌处理氯气以及滤膜。取一定供试液进行滤膜过滤，而后用冲洗液对滤膜进行冲洗，冲洗滤膜，每张用量100毫升，总量要在1000毫升以下。 　　1.4 统计学处理：采用SPSS 13.0统计软件。采用x 2检验。差异有显著性为P　　2 结果 　　2.1 平皿法与薄膜过滤法细菌检出数的情况对比：平皿法与薄膜过滤法的细菌检出数相比差异具有显著性（P　　表1 平皿法与薄膜过滤法细菌检出数的情况对比（个/g） 　　2.2 平皿法与薄膜过滤法的大肠埃希氏菌的回收率情况对比：平皿法与薄膜过滤法的大肠埃希氏菌的回收率相比差异具有显著性（P　　表2 平皿法与薄膜过滤法的大肠埃希氏菌的回收率情况对比（个/g） 　　3 讨论 　　比较上表的试验结果可以发现平皿法和薄膜过滤法相比，前者明显比较低。也就是说平皿菌落计数这种法不能够对抑菌成分予以彻底的降解，故而细菌对应的生长就受到了影响，对应的回收率以及检出率就被降低了。而薄膜过滤这种方法对抑菌成分予以了很好的降解，对应的抑菌能力就被降低了，故而无论是检出率，还是回收率都比前者要高，运用这种方法对检查抗菌药物对应的微生物限度来讲，可靠性非常的高[2]。 　　实验告诉我们，进行薄膜过滤的时候，一定要添加供试液到滤罐，其含有冲洗液，而后予以减压抽滤，后次冲洗应该建立在前次已经完成抽干的基础之上，这样抑菌成分才能够被彻底的冲洗干净[3]。注入供试液的时候，首先要混匀并且振摇，这样实验误差才可能最小化。 　　参考文献 　　[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社， 　　[2] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社， 　　[3] 刘鹏，马仕洪.加替沙星微生物限度检查方法的建立[J].药物分析杂志，2007，（6）：881-884
范文三：摘要：本文从四个方面介绍2005版微生物限度检查法增修订内容，重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证，提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证，以增加试验方法的完整性、保证检验结果的可靠性。 　　关键词：微生物限度检查法方法学验证 　　【中图分类号】R-3【文献标识码】B【文章编号】（5-01 　　微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查，与2000版相比，2005版微生物限度检查法在以下几方面进行了增修订。 　　1标准的制订原则 　　2000版微生物限度法标准细菌数、酵母菌数和霉菌数按剂型制订，控制菌按给药途径制订。由于同一剂型有不同的给药途径，且随着新剂型的不断出现，按剂型制订标准具有局限性。2005版均按给药途径制订，解决了这一局限性，不会因剂型的改变而带来执行标准的混乱。 　　2标准的分类 　　分为三大类，即制剂通则项下规定；口服给药制剂；局部给药制剂，其中化学药部分（二部）包括：①制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；②口服给药制剂、局部给药制剂：眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂。中药部分（一部）包括：①制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；②口服给药制剂：不含药材原粉的制剂；含药材原粉的制剂；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂；③局部给药制剂：用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂；用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂；眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂。 　　3微生物限度检查方法的增修订 　　3.1明确了环境检测执行的标准和方法，洁净度要求及洁净度定期检查。 　　3.2检验量。随机抽取不少于检验量（两个以上最小包装单位）的3倍；贵重、微量样品检验量可酌减；要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml。 　　3.3供试液制备。表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物生长和存活无影响；供试液从制备至加入检验用培养基不得过1小时；供试液体积为100ml；非水溶性供试品：增加“十四烷酸异丙酯法”；结肠溶制剂的供试品：用pH为7.6无菌磷酸盐缓冲液溶解；具抑菌活性的供试品：增加方法的可操作性。 　　3.4灭菌。培养基及稀释剂采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。 　　3.5稀释剂。增加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液、pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液。 　　3.6细菌、霉菌及酵母菌计数。 　　3.7控制菌检查：新增大肠菌群检查法、梭菌检查法。 　　4微生物限度检查法的验证 　　微生物限度检查法验证的目的是确认所采用的方法是否适合于供试品的微生物限度检查。验证的内容包括准确性（回收率）、专属性。验证的类型分为前验证（建立微生物限度检查法时的验证）和再验证（修订检验方法后、供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时、定期的方法验证），根据检查方法的不同，又分为细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的验证。 　　4.1细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率、验证菌株为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌，菌种要求不得超过5代，菌液制备为50-100cfu/ml，验证方法分试验组、菌液组、稀释剂对照组、供试品对照组。 　　4.2控制菌检查法的验证。试验菌株按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。大肠菌群检查用大肠埃希菌；梭菌检查用生孢梭菌，阴性对照菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌用大肠埃希菌；大肠埃希菌、沙门菌、大肠菌群用金黄色葡萄球菌。菌种的要求：不得超过5代，菌液制备为10～100cfu，验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行.验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。具体如下： 　　4.2.1试验组。取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查，当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。 　　4.2.2阴性菌对照组。设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组检出。 　　4.2.3结果判断。阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查，试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。 　　我们在审评工作中发现部分制剂本身具有抑菌或杀菌作用，如某些眼用软膏剂，某些含生物碱的中药复方制剂等，所制备的供试液本身具有影响微生物生长的作用，若不经方法学验证，难以保证所采用方法的适合该供试品的微生物限度检查，难以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。 　　以上介绍2005版微生物限度检查法增修订内容，重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证，提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证。
范文四：（文件审批页）
微生物限度检查记录
一、仪器设备
超净工作台型号
超净工作台型号
培养箱型号
培养箱型号
二、培养基、稀释剂
胰酪大豆胨琼脂培养基：批号
沙氏葡萄糖琼脂培养基：批号
胰酪大豆胨液体培养基：批号
麦康凯液体培养基：
麦康凯琼脂培养基：
蛋白胨水培养基：
枸橼酸盐培养基：
磷酸盐葡萄糖胨水培养基：批号
三、对照菌
对照菌液：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]
配制批号：
靛基质试液 а-萘酚乙醇试液 甲基红指示液 40%氢氧化钾 结晶紫染液
配制批号：
配制批号：
有效期至 配制批号：
配制批号：
有效期至 配制批号：
碘试液 95%乙醇溶液 沙黄染液 五、检测
1供试品溶液的制备：
配制批号：
配制批号：
有效期至 配制批号：
2需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数 2.1需氧菌总数
培养开始时间
培养结束时间
2.2霉菌和酵母菌总数
培养开始时间
培养结束时间
2.3结果判定：
结论： 3大肠埃希菌
3.1供试品溶液的制备和增菌培养：
取供试品，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）”制成1：10供试液。取供试液
ml，接种至
ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。培养温
培养开始时间
培养结束时间
3.2选择和分离培养：
取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，培养温度
培养开始时
4结果判定：六、结论：
检验日期：
复核日期：
微生物限度检查
本章所提供的检测程序用于测定包括原料药及制剂在内的各种药品中需氧菌数量以及不含有指定的微生物。 如果已有充分的证据证明某种自动化的方法可以给出与本章所提供的方法等效的或更好的实验结果，可以用该方法替代本章所提供的方法。在实验准备以及实施的过程中，应遵守无菌操作。除另有规定外，本检查法中“孵育”是指 将容器置于温度控制在30-35?C的空气中24-48小时。术语“生长”在此处是专用于表示存活的微生物的增殖。
预试验（验证试验）
应有充分的证据证明在实验条件下检品本身对可能存在微生物的增殖无抑制作用，这在很大程度上决定了下述所规定的检查方法的结果有效性。因此，应进行预试验，测定金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌分别接种到稀释的检品中共同培养后的存活情况，以使检查标准化并作为随后试验的具体要求。方法如下：接种1ml金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及沙门氏菌的24小时肉汤培养物（稀释度大于等于10-3）至最低稀释级样品供试液中（样品用pH 7.2磷酸盐缓冲液, 大豆-酪蛋白水解物琼脂培养基或乳糖液体培养基稀释），若微生物在相应的培养基中不能生长，则该部分试验无效，有必要按下述步骤对实验进行调整：通过（1），增加稀释剂的体积，供试品量保持不变，或（2）在稀释剂中加入足够量的灭活剂；或（3）适当地将（1）和（2）结合使接种物可以生长。
可在培养基中加入0.5%的大豆卵磷脂和4.0%的聚山梨酸酯-20以中和供试品中的所存在的抑菌成分。或者用酪蛋白水解物-大豆卵磷脂-聚山梨酸酯-20-培养基按前述方法重复试验以确认对供试品中的保护剂或其他抗菌剂的中和作用。若产品中含有抑菌成分，而该产品又是可溶的，可采用无菌检查项下产品的无菌检查法中的薄膜过滤法。
如果在加入灭活剂或大大增加稀释剂的体积后仍不能使上述培养物恢复存活，而且该产品不适合采用薄膜过滤法，可以作如下推断：所接种微生物的分离培养失败是由于该产品的抑菌活性。此信息表明该产品未被指定（上述给定）的微生物所污染（此信息表明该产品大概不会被上述给定的微生物所污染）。应继续进行监测以建立该产品的抑菌谱和杀菌活性范围。
缓冲液和培养基
培养基既可以按以下处方配制，也可以使用生产者或销售商推荐的，与该配方相类似
的脱水培养基。
按以下程序配制培养基：将可溶性固体溶解在水中，必要时可加热促使其完全溶解，用HCl或NaOH溶液调节培养基的pH使其在使用时达到规定值。在25 ± 2℃时测定pH值。
如果配方中有琼脂，则琼脂的含水量不应超过15%，配方中的水均应为纯水。
PH 7.2磷酸盐缓冲液
储备液—在1000ml容量瓶中将磷酸二氢钾KH2PO434g（monobasic potassium phosphate）溶于约500ml水中，用NaOH TS（约175ml）调节pH至7.2±0.1。加水至刻度， 混匀。分装，灭菌。冷藏保存备用。
除非另有规定，培养基均应采用高压蒸汽灭菌方式（见灭菌项下，蒸汽灭菌）， 灭菌时间取决于待灭菌的培养基的体积。
将酪蛋白胨、大豆卵磷脂溶解在960ml水中，在温度为48-50°C水浴中加热约30分钟使其完全溶解。 加40ml聚山梨醇酯20混合，按所需量分装。
II. 大豆-酪蛋白水解物琼脂培养基
灭菌后pH7.3 ± 0.2。
III. 大豆-酪蛋白水解物培养基
按无菌检查项下大豆-酪蛋白水解物培养基的配制方法进行。
IV.甘露醇-盐琼脂培养基
将上述成分混合后，加热并不停不断地搅动，煮沸1分钟使之完全溶解。灭菌后pH7.4 ± 0.2.
V. Baird–Parker琼脂培养基
边加热边搅拌，煮沸一分钟。灭菌，冷却至45C- 50C, 加入10ml灭菌的1%亚碲酸钾溶液、50ml蛋黄乳化液， 轻轻混合均匀，倾注平皿。（卵黄乳化液制备：将蛋壳表面消毒，无菌条件下打开蛋壳， 将完整的蛋黄分离至无菌量筒中。 加入无菌盐水TS，使蛋黄与盐水比为3 :7。转移至一无菌搅拌杯中高速搅拌5秒钟。）灭菌后pH6.8 ± 0.2.
VI. Vogel–Johnson琼脂培养基
将固溶体(固体溶液)煮沸1分钟，灭菌，冷却至45C— 50C，加入灭菌的1%亚碲酸钾溶液。灭菌后pH7.2 ± 0.2。
VII. Cetrimide琼脂培养基
将所有的固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使之完全溶解。 灭菌后pH7.2 ± 0.2.
VIII. 用于荧光检测的假单胞菌琼脂培养基
将固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使之完全溶解。
灭菌后pH7.2 ± 0.2。
IX. 用于检测绿脓菌素的假单胞菌琼脂培养基
将固态成分溶于水后，加入甘油，边搅动边加热，煮沸1分钟使之完全溶解。
灭菌后pH7.2 ± 0.2.
X. 乳糖培养基
XI. 亚硒酸盐-胱氨酸培养基
最终pH: 7.0 ± 0.2
混合，加热使之溶解用流动蒸汽加热15分钟，不要高压灭菌。
XII. 连四硫酸盐培养基
将固溶体(固体溶液)加热至沸腾。用时加由5g碘化钾和6g碘溶于20ml水中配制而成的溶液，之后加入10ml 千分之一的亮绿溶液，混合，加入亮绿溶液后不要加热。
XIII. 亮绿琼脂培养基
将固溶体(固体溶液)煮沸1分钟，使用前高压灭菌，将培养基融化，倒入平皿中，令其冷却。
灭菌后pH 6.9 ± 0.2.
XIV. 木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂培养基
最终pH: 7.4 ± 0.2
边搅拌便加热固态物与水的混合物至沸点，勿过度加热或高压灭菌 。立即转移至约50?C水浴中，冷却后立即倒入平皿中。
XV. 亚硫酸铋琼脂培养基
最终pH: 7.6 ± 0.2.
边搅拌便加热固态物与水的混合物至沸点，勿过度加热或高压灭菌 。立即转移至约50?C水浴中，冷却后立即倒入平皿中。
XVI. 三糖铁琼脂培养基
灭菌后pH7.3 ± 0.2. XVII. 麦康凯琼脂培养基
将固态物与水混合煮沸1分钟令其充分溶解，灭菌后pH7.1 ± 0.2.
XVIII. Levine Eosin亚甲兰琼脂培养基（伊红美兰琼脂培养基）
将明胶胰酶消化物、磷酸氢二钾及琼脂溶解在温水中，冷却。用时融化，按下述比例加入其余组分并混合：每100ml 琼脂液中加入5ml 20% 乳糖溶液2ml 2%伊红溶液以及2ml 0.3%（1/300）的亚甲兰溶液。最终配好的培养基可能不是澄清透明的。
灭菌后pH7.1 ± 0.2.
XIX. Sabouraud葡萄糖琼脂培养基
XX. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基
倾倒平皿之前，在熔融后冷却至45C的培养基中加入无菌10%酒石酸溶液调节pH
3.5 ± 0.1。 勿将pH 3.5的培养基再次加热。
各专项试验一次试验所用的供试品量为10mL或10g.
供试液的制备程序
应根据试样的物理性状选择适宜的方法制备供试液， 该制备方法还应不影响原有的微生物的种类和数量。供试液可以是来源于供试品的全部或部分的溶液或混悬液， 只要适宜于将要进行的检测程序。
对那些有着明显的溶解，但不能完全溶解的固态供试品， 可将其适当地粉碎成细粉，并将其悬浮在指定的赋形剂中， 按《需氧菌总数计数》、《金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查》以及《沙门菌属、大肠埃希菌检查》项下的规定进行。
由真溶液组成的液体供试品，或由水或浓度小于30%乙醇作为赋形剂配成的混悬液供试品 以及那些几乎完全溶解于90ml pH7.2的磷酸盐缓冲液中或指定的培养基中的固态供试品，按《需氧菌总数计数》、《金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查》以及《沙门菌属、大肠埃希菌检查》项下的规定进行。
对于与水不混溶的液体、软膏（油膏）、乳剂、蜡制品，其混悬液制备可按下述方法进行：加入最小量的合适的无菌乳化剂（例如：一种聚山梨醇酯），机械搅拌，必要时温热至温度不超过45℃。按《需氧菌总数计数》、《金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查》以及《沙门菌属、大肠埃希菌检查》项下的规定进行。
USP29- 微生物限度检查
对于气雾剂供试品，将容器置于乙醇－干冰混合物中冷却约１小时，钻开容器，放置室温，使抛射剂释出，如有可能，可加温排出抛射剂。按检测要求的量，依前述两个程序之一的要求将一定量的供试品以适当的方式转移。 如果不能从10个气雾剂形式的容器中获得10g 或10ｍl供试品，则可将冷却的容器中的内容物全部转移到培养基中，令抛射剂释出， 用残留物进行检测。若检测结果不确定或可疑，可从20个或更多的容器中取样重新检查。
总需氧菌计数
平皿法用于完全溶解的供试液或允许采用平皿法的半透明供试液，其他供试液采用多管法进行检查。无论用那种方法，都必须首先准确称量或量取供试品10ｇ（当供试品为固态时）或10mL（当供试品为液态时），将其溶解或悬浮在pH 7.2 磷酸盐缓冲液, 大豆－酪蛋白水解物液体培养基, 或酪蛋白水解物－大豆卵磷脂－聚山梨醇酯20液体培养基中，使成100mL。如果稀释级为1:10时供试液过于粘稠，不能用移液管移取，可将供试液稀释（1：50， 或1：100）直至可以移取。在进行总需氧菌检查之前，应按《预试验Preparatory Testing》项下的规定进行验证， 确认不存在抑菌活性。应在适宜稀释级的供试液制备后1小时内将其加入到培养基中用于接种培养。
必要时，将供试液继续稀释，使加入1ml 供试液培养后的菌落数在30-300个。分别向两个无菌平皿中加入1ml终稀释级供试液，每皿注入15-20ml融化后冷却至45℃的大豆-酪蛋白水解物琼脂培养基， 盖上平皿，轻轻敲打或旋转使样品与琼脂培养基混合，室温凝固。 倒置培养48-72小时后，检查菌的生长，计数菌落数。取两个平皿每克或每毫升供试液的需氧菌数的平均值报告菌数。如果在稀释级为1：10的 样品平皿中未发现微生物菌落，则将该结果表示为每克或每毫升样品中菌数小于10个。
多管培养法
取14支规格类似的试管， 分别加入9ml大豆-酪蛋白水解物液体培养基。将其中12支分成四组，每组3支。除对照组3支外，在第一组（“100”）三支管中以及第四支管（管
A）中加入1ml 供试品溶液或混悬液，混匀。取1ml管A中的内容物移入至另一个分组后剩余的管中（管B），混匀。管A 和管B中分别含有供试液100mg（或100uL）和10mg(或10uL).。 向第二组（“10”）的3支试管中分别加入管A的内容物1ml，
向第三组（“”）的3支试管中分别加入管B的内容物1ml，废弃管A、管B 中剩余的内容物。将各试管封严，培养。检查各管中微生物的生长情况， 对照管应澄清， 含供试液的样品管参照表1整理实验数据，可以给出每克或每毫升供试液中最可能的微生物的数量。
表1. 多管培养法最可能的微生物总数
金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查
在供试液中加入大豆-酪蛋白水解物培养基使成100ml ， 混匀后培养。检查培养基中菌的生长情况。如果有菌生长， 用接种环将培养物划线接种于Vogel–Johnson 琼脂培养基表面（或Baird–Parker 琼脂培养基,或甘露醇-盐琼脂培养基） 以及 Cetrimide(溴化十六烷基三甲铵) 琼脂培养基表面, 倒置培养。如果每个平皿中均未发现具有表2、3所列特性的菌落，则判该供试品未检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。
表2、金黄色葡萄球菌在选择培养基中的形态特征
表3、铜绿假单胞菌在选择培养基中以及检定琼脂培养基中的形态特征
血浆凝固酶试验（用于金黄色葡萄球菌）：用接种环从Vogel–Johnson 琼酯培养基 (or Baird–Parker琼酯培养基, or Mannitol–Salt琼酯培养基)表面挑取可疑菌落转移至含0.5ml哺乳动物血浆的试管中（最好是兔血浆或马血浆，有添加剂或无添加剂的血浆均可），37C水浴，3小时后开始观察， 随后以适当的间隔观察直至24小时。阴性对照和阳性对照与未知样品同时检测。如果没有观察到任何凝集，判该供试品未检出金黄色葡萄球菌。
氧化酶与色素试验（用于铜绿假单胞菌）：用接种环从Cetrimide(溴化十六烷基三甲铵)琼脂培养基表面挑取可疑菌落分别接种至含用于荧光检测的假单胞菌琼脂培养基和用于绿脓菌素检测的假单胞菌琼脂培养基的平皿上，如果要转移的菌落数量较多，可以将每个平皿分成四个扇形部分，每部分接种一个单独的菌落。盖上平皿， 于35 ± 2℃倒置培养至少3天。在紫外灯下检查划线接种表面，并检查菌落是否具有表3所列特征。
通过氧化酶试验确证在铜绿假单胞菌培养基上生长的任何可疑的菌落。在有菌落生长的平皿上放置预先用二盐酸N,N-二甲基对苯胺浸渍的滤纸条或圆片， 也可将菌落转移到前述滤纸条或圆片上。若颜色没有从粉色变为紫红色，则判该供试品未检出铜绿假单胞菌。如有必要，可采用其它适宜的培养和生化试验确认是否为铜绿假单胞菌。
沙门菌属及大肠埃希菌检查
取供试液加入到一适当的容器中，再加入乳糖液体培养基使体积达100ml， 培养。检查培养物的生长情况，若有菌生长，轻轻摇动使混匀，分别向含有10ml亚硒酸盐-胱氨酸液体培养基和10ml连四硫酸盐液体培养基的容器中加入1ml， 混匀后培养12-24小时。（保留剩余的乳酸液体培养物。）
沙门菌属检查：用接种环分别取部分亚硒酸盐-胱氨酸液体培养物和连四硫酸盐液体培养物在亮绿琼脂培养基、木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐琼脂培养基以及亚硫酸铋琼脂培养基表面划线接种。盖好培养皿， 倒置培养。 如果没有符合表4所列特征的菌落，则判该供试液未检出沙门氏菌。
表4、沙门氏菌数在选择性培养基中的形态学特征
如果发现与表4所列特征相符的革兰氏阴性菌， 需进行进一步的确证试验。 用接种针分别挑取可疑菌落在三糖铁琼脂培养基斜面上进行划线接种，然后将接种针刺入斜面下。 培养。若斜面未见红色（碱性）、底层未见黄色（酸性）（有或无硫化氢产生而伴随的底层发黑）， 判该供试品未检出沙门氏菌。
大肠埃希氏菌检查——用接种环取剩余的乳糖培养物在麦康凯琼脂培养基表面划线接种。倒置培养。若未见与表5所列特征相符的菌落，判该供试品未检出大肠埃希氏菌。
表5、大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂培养基的菌落形态特征
如果发现符合表5所列特征的菌落，需进行进一步的确证试验。用接种环将可疑菌落接种到伊红美兰琼脂平板上，若菌落数量较多，可将琼脂平板的表面分成扇形，分别接种分离的菌落。倒置培养。如果未发现有菌落在反射光下呈金属光泽，在透射光下呈蓝黑色， 则判该供试品未检出大肠埃希氏菌。可以通过适宜的分离培养和生化试验进一步确证是否存在大肠埃希氏菌。
霉菌及酵母菌计数
按需氧菌总数计数项下的平板法操作，培养基则由大豆酪蛋白培养基改为等量的Sabouraud葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基。培养条件为：倒置培养5-7天，温度20-25?C。
如果对上述用10.0g供试品检验量的任何实验结果有疑问，可以将检品量扩大到25g， 按前述方法复验。
*此外，确证试验可依据Official Methods of Analysis of the AOAC, 12th ed. (1975), sections
46.013-46.026.的规定进行。
ZW-300A智能微生物限度检验系统
【产品特点】
1.人性化、智能化设计，采用触摸按键式控制，操作方便，体现了人性化，专业化。
2.二合一功能，不但是做微生物限度检查的首选，还可当独立真空泵使用，曾加了仪器的使用范围，减少了用户的成本。
3.一台仪器可选择三种滤杯，滤膜直径有50mm和70mm可选，滤杯有一次性和可重复使用可选，增加的用户的选择范围。
4.可同时抽滤三张滤膜，大大提高了工作效率。
5.增设电子万年历，方便操作人员把握时间。
6.滤杯采用可重复使用材料设计，经久耐用，节省成本，操作方便。
7.每个滤头采用独立控制的方式，方便操作人员灵活使用。
8.一体化超小型设计，减小了对层流台操作空间的占用。
9.无油真空泵设计，噪音低。
10.仪器表面经镜面处理，便于清洁和消毒。
【工作原理】
将供试品注入微生物限度培养器内，通过检验仪自带内置真空泵负压抽滤，将供试品中微生物截留在滤膜上，将相应的液体培养基加至滤杯内，覆盖整个滤膜表面即可，启动仪器抽滤，滤膜上的培养基滤干立即停止抽滤。盖上盖子形成封闭的培养盒，置于相应的恒温培养箱内培养并计数。
【技术参数】
220V(±10%)
50HZ(±2%)
抽气速率：30L/min
量：≥300ml/min
声：≤55bd（负载状态）
真 空 度：60kpa
过 滤 器：三联
机体材料：L304不锈钢
外形尺寸： *
【使用范围】
药：纯化水、注射用水、眼用制剂、原料药、胶囊、生物制品、片剂、口服制剂
品：纯净水、矿泉水、饮料
工：各种需测试微生物水样
化妆品：各种用水及产品
疾：江、河、湖、海、水样
范文七：ZW-300A微生物限度检查仪
使用说明书
1.系统概述
ZW-300A型微生物限度检查仪由主机、过滤器、内置真空泵、连接管、抽滤瓶等组成。ZW-300A是一种操作安全、简单的薄膜过滤装置（及薄膜过滤法），选择薄膜过滤法的前提，供试品性状允许。安全可靠，以传统的平皿法检验法相比，它具有以下优点：
①回收率高，对有抑菌性的供试品效果尤为明显，结果真实可靠；
②操作简单、安全，操作者经过简单的培训即可进行检验操作；
③有一次性无菌包装微生物限度过滤器和反复使用滤杯两种滤杯可选； ④不需外接真空泵，也可以做独立真空泵使用；
⑤采用电磁阀，实现了智能控制；
⑥仪器表面镜面抛光处理，便于清洁和消毒；
⑦整机体积小，流线型设计，外形美观。
2.应用范围
制药行业：ZW-300A型微生物限度检查仪可对制药行业中的制药用水（纯化水、注射用水），液体原料和非规定灭菌制剂药品的微生物限度进行检验。
食品饮料行业：ZW-300A型微生物限度检查仪可用于检测矿泉水、啤酒、白酒、果汁和其他饮料及在生产过程中用到的液体原料。
3.工作原理
ZW-300A型微生物限度检查仪由主机、过滤器及微孔滤膜（滤膜孔径0.45μm或0.22μm）、抽滤瓶等组成。系统采用无油真空泵负压抽滤原理，在微生物限度过滤器内的微孔滤膜上下面产生一个压差，微生物限度过滤器中的供试品由于压差作用通过微孔滤膜，将供试品中可能存在的微生物截留在微孔滤膜上，取出微孔滤膜，菌苗朝上，平贴到培养基上培养，或将培养基直接加至滤杯内培养，观察结果，计数。
4.产品描述
4.1.型号说明
4.3.性能参数
(1)工作电压：220V/50Hz
(3)抽气速率：30L/min
(4)真 空 度：60Kpa
音：≤65db
(7)外形尺寸：27*21*13*cm
质：L304不锈钢
(9)排液管规格：内径Φ9mm
(10)客户根据实际情况（排液；量的多少来选择抽滤瓶的大小）自配缓冲
4.4.工作环境
(1) 环境要求：百级层流洁净室或超净工作台；
(2) 环境温度：15℃~35℃
(3) 相对湿度：≤80％RH无水珠凝结现象；
(4) 工作电压：220V/50Hz
(5) 电器安全：仪器有效触地，触地阻抗≤4Ω。
4.5.控制和显示
ZW-300A型微生物限度检查仪操作面板采用按键式控制，操作直观可靠，外形如下图所示：
4.5.1.显示屏
接通电源后显示屏上出现下图所示界面。
(1)power — 启、停键，控制仪器运行、停止。
(2)1、2、3 —电磁阀开关键，显示屏上从左到右显示“OFF、OFF、ON”分别由1、2、3号键控制。
(2) ▲ — 进入时间设置，在日期上出现闪烁的光标，此时按“▼”键或“▲”键进行日期、星期、时间的设置，按“1”键，从左向右移动到下一级，光标在下一级闪烁，按“2”键，从右到左移动到上一级，光标在上一级闪烁，按“3”键，为确认键。
5.安装及调试
安装调试前应准备三个滤杯和1000ml纯化水。
5.1.1.开箱及检查
打开包装，取出资料袋、仪器以及随机配件和备件，取出资料袋中的装箱单，仔细核对装箱内容。
5.1.2.电源连接
将仪器平稳放置在工作台上，接通电源。
5.1.3.管路连接
取出抽滤瓶放置在仪器左侧，按图1（ZW-300A型微生物限度检查仪示意图）所示，取出滤杯逐个固定在主机上，将连接管与抽滤瓶正确连接。
5.1.4.一次性微生物限度过滤器（M70）
如使用一次性微生物限度过滤器，外形如图所示：
安装操作步骤：
(1)打开无菌包装，包装破损，请勿使用，取出滤杯与适配器连接，用一只手垂直向下压滤杯，直至滤杯不能向下移动。
(2)阀门设置成关闭状态，将供试品注入一次性微生物限度过滤器内，然后启动真空泵，再打开相应阀门，实施过滤集菌。
(3)供试品过滤集菌结束后（滤膜上没有水珠），先关闭相应阀门，在停止真空泵，取相应的液体培养基注入滤杯内，培养基覆盖滤膜表面即可。再启动真空泵，然后再打开相关阀门，抽滤培养基，直到滤膜表面无培养基，立即关闭相应阀门，再停止真空泵。
(4)取下滤杯，将帽塞套在底座排液口上，再将杯体取下，盖子盖在过滤器上，形成培养箱。
(5)将培养盒放置在生化培养箱及恒温培养箱中，按规定温度和时间进行培养，逐日观察、计数。
5.1.5.反复使用开放式过滤器（ZW-3B）
如使用反复使用开放式过滤器，外形如图所示:
安装操作步骤：
(1) 试验前，应先将滤杯清洗干净、晾干、取滤膜(50mm)侵泡到纯化水里
3~5min，取出装入清洗好的滤杯内，用牛皮纸或纱布包好进行湿热灭菌、备用。
(2) 取已灭菌好的滤杯，与主机连接，顺时针方向拧紧。
(3) 阀门设置成关闭状态，将其供试品注入反复使用开放式过滤器内，然后启动真空泵，再打开相应阀门，实施过滤集菌。
(4) 供试品过滤集菌结束后(滤膜上没有水珠)，先关闭相应阀门，在停止真空泵，逆时针方向拧下滤杯。再逆时针方向拧下固定圈，将透明杯体与底座分开，用无菌镊子取出密封圈，在用无菌镊子取出滤膜。
(5)将滤膜贴到事先准备好的培养基上，菌面朝上，平贴，不得有气泡。相应的液体培养基注入滤杯内，培养基覆盖滤膜表面即可。再启动真空泵，然后再打开相应阀门，抽滤培养基，直到滤膜表面无培养基，立即关闭相应阀门，再停止真空泵。
(6)盖上盖子放置在生化培养箱及恒温培养箱中，按规定温度和时间进行培养，逐日观察、计数。
5.2.1.检查重点
(1)电源开关是否正常；
(2)按键设置和控制是否正常，显示屏显示是否正常；
(3)仪器运行是否正常，有无异常噪音(除真空泵正常噪音外)，或者异常的振动；
(4)电磁阀控制是否正常；
(5)滤杯拆装是否正常，是否出现漏液情况；
(6)抽滤是否顺畅，抽滤时间是否在规定时间内。
5.2.2.调试步骤
(1)连接好管路，装上滤杯。
(2)取600ml~1200ml纯化水，每个滤杯注入100ml纯化水；
(3)接通电源，打开电源开关，显示屏亮，让电磁阀处于关闭状态，按下“power”键，启动真空泵，再分别打开相对应的电磁阀，实施抽滤(抽滤时间1~5min为正常范围)，根据速度将准备好的纯化水加入滤杯中，纯水顺畅地从排液口流出。
(4)过滤集菌结束后，及滤膜表面无水珠，先关闭相对应的电磁阀，在按下“power”键，真空泵停止运动；
(5)取下滤杯，滤膜过滤前后应无破损现象。
(6)调试结束后关闭电源，拆掉排液管和抽滤瓶，拆卸滤杯清洗晾干。
6.管路消毒与滤杯清洗。灭菌
6.1.管路有毒
6.1.1消毒条件
当出现下列情况时，必须对仪器内部管路和连接管消毒一次。
(1)第一次使用前；
(2)仪器长期没有使用再次使用前；
(3)仪器搬离过微生物限度检查室或洁净室；
6.1.2.消毒剂
仪器管路消毒可采用以下消毒剂：
(2)新洁尔灭
(4)次氯酸溶液
6.1.3.消毒方法
(1)准备100ml消毒剂、200ml无菌水(不需微孔滤膜)；
(2)按照仪器的调试步骤(见5.2.2)，先将100ml消毒剂过滤，保持3~5分钟，再将200ml无菌水进行过滤，即可完成管路消毒。
6.2.滤杯清洗、灭菌方法(如使用一次性微生物限度过滤器，无需进行此项)
6.2.1.清洗方法
每次使用前，都应对滤杯进行清洗(中性洗涤剂)，透明杯体用软质棉擦拭，自然晾干，取侵泡好的滤膜装入滤杯，用牛皮纸/纱布包好，准备灭菌。
6.2.2.灭菌方法
每次使用前都应该对滤杯进行湿热灭菌。
7.1.准备工作
(1)检查工作环境，是否符合药典要求。
(2)将仪器置于超净工作台上，按照说明书中5.1.2、5.1.3、5.1.4的方法安装仪器。
7.2.消毒与清洗、灭菌
(1)根据使用情况参考说明书6.1.1、6.1.2、6.1.3的条件和方法对仪器的管路进行消毒。
(2)按照6.2.1、6.2.2的清洗、灭菌方法对滤杯进行清洗和灭菌。
(1)取已灭菌好的滤杯与主机相连，确保密封完好。
(2)将事先准备好的供试液倒入滤杯内，不要超过滤杯最大刻度。
(3)打开电源，按下“power”键，将相应的电磁阀打开，仪器开始运行，根据过滤速度将余下的供试液倒入滤杯内进行过滤。
(4)待供试液全部过滤完后，先关闭相应的电磁阀，再按下“power”键，仪器停止运动。
(5)反复使用开放式过滤器操作步骤：将滤杯取下，拧开固定圈，将透明杯体与底座分开，用取膜器或者其他方法将滤膜顶出底座上端面，用无菌镊子取出滤膜。滤膜菌面朝上，平贴在事先准备好的固体培养基上，滤膜上不得有气泡。
一次性微生物限度过滤器操作步骤：直接将相应的液体培养基注入滤杯，液体培养基覆盖滤膜表面即可，打开电磁阀，按下“power”键，启动真空泵，直至滤膜表面无液体培养基，立即关闭相应的电磁阀，按下“power”键，停止运动。
(6)将制备好的培养皿或培养盒转移至规定温度条件下的生化培养箱及恒温培养想中进行培养。
(7)操作结束后，切断电源。
(8)主机表面用酒精擦拭干净，按照说明书6.1进行消毒。
8.注意事项：
(1)仪器必须有效接地；
(2)根据供试品性状来选择滤膜材质，过滤前后应保证滤膜的完整性；
(3)仪器不工作时，请断电；仪器待机时，请将电磁阀关闭，设置为“OFF”状态；
(4)不能抽滤强酸、强碱、强氧化剂、强腐蚀等液体；
(5)当供试品中含有不溶性的颗粒，悬浮物时，可能导致滤膜堵塞影响过滤，应将供试品进行预处理，除去颗粒或悬浮物；
(6)抽滤前，应确保管道密封性良好；
(7)如使用一次性微生物限度过滤器，打开无菌包装前，先检查包装是否破损；
(8)如使用一次性微生物限度过滤器，供试品集菌结束后，应加入不含琼脂的液体培养基；
(9)添加供试液时的液体高度不能超过滤杯最大刻度；
(10)清洗滤杯时，透明杯体只能用软材质的布或其它柔质物品清洗，以免划伤杯体；
(11)密封圈、透明杯体长时间使用会老化，请更换，以确保正常抽滤；
(12)若无菌室采用化学剂消毒时，将仪器置密封罩内，或搬出无菌室，以免损坏电子部分腐蚀金属部件。
9.保养与维修
为了确保仪器的使用寿命，请定期对仪器进行保养，保养方法如下：
(1)仪器工作环境应符合要求(4.4)
(2)按照6.1.1、6.1.2、6.1.3进行消毒，每次使用结束后，仪器表面用酒精擦拭。
(3)仪器长期不使用应储存在相对湿度不超过75％RH，无腐蚀性气体和通风良好的清洁环境中。
一般故障检修：
(1)指示灯不亮，仪器不工作，请检查电源情况、插座等。
(2)仪器能正常工作，单检品过滤速度慢或无法过滤，请检查:
A.管路连接是否漏气，滤杯密封性是否良好；
B.检品是否含有较多不溶性的颗粒，悬浮物等；
C.检查不锈钢网片是否堵塞，不锈钢底座出液孔是否堵塞。
(3)若属其他原因，请与厂家联系。
(1)凡属材质或制造不当之缺陷，本公司负责保修，为期一年，自产品出售之日起，视情况予以调换或维修。
(2)若因使用不当或其它人为因素所致损坏或故障，本公司负责修理，并酌情核收修理费。
范文八：微生物限度检查记录 口服） 微生物限度检查记录（口服） 编号： 检品名称 批 号 规格 供样单位 检验日期 检验依据 《微生物限度检查法检验操作规程》 编号： 供试品制备：1 常规法 供试品 g(ml) 加 PH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至 ml ①匀浆仪 挡 min ② 研钵法 ③保温振摇法 2 非水溶性供试品 供试品 g（ml） 加乳化剂 g（ml) 3 抑菌性供试品处理方法 供试品 g 或 ml PH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液 方法： 就在哪个数字下面打钩） （ 选择哪个方法 就在哪个数字下面打钩）
细菌数 30~35℃ 3天 霉菌(酵母菌)总数 23~28℃ 5 天 培养箱编号： 设定温度： 培养箱编号： 设定温度： 培养基配制批号： 培养基配制批号： 培养时间： 1 月 20 日 15 时～ 1 月 23 日 15 时 培养时间： 1 月 20 日 15 时～ 1 月 25 日 15 时 1：10 1:100 1:1000 阴性对照 1：10 1：100 1：1000 阴性对照 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 24h 0 0 0 0 24h 0 0 0 0 48h 7 5 0 0 48h 0 0 0 0 72h 7 5 0 0 72h 32 31 3 3 96h 120h 平均 结果 33 33 31 31 3 3 3 3
60cfu/g (应不过 100 cfu/g 或 ml)
320cfu/g 1000cfu/g 或 ml) 320cfu/g (应不过 1000
大肠埃希菌检查 培养基 配制批号 培养箱 编号 设定温 度 结果 阳性 对照 + + +
试验方法 BL MUG 靛基质 EMB 或 MacC
阴性 对照 -
革兰染色镜检 I NR V-P C 乳糖 结论： 未检出 活螨检查 供试品 2 瓶或盒 检验者
（应不得检出 ） 直接检查法（集螨法） 校对者
结果：未检出 未检出
范文九：微生物限度检查方法适用性试验报告
品名：黄连上清片
******药业有限责任公司
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌总数、霉菌数和酵母菌总数及控制菌检查。当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。
我公司生产的品种黄连上清片由于依照《中国药典》2010版的检查方法验证，细菌、霉菌和酵母菌、控制菌检查均采用平皿法。故现升级为《中国药典》2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌拟采用平皿法重新进行方法适用性试验，以确认平皿法仍然适用于该品种的微生物限度检查。
2.验证内容
2.1培养基确认
经检查，上述培养基来源于北京奥博星科技有限公司，是我公司审计的合格供应商，并经过培养基适用性实验检查合格，可以使用。
确认日期：
2.2检查用培养基配制方法
上述培养基按照规定的方法配制、灭菌后可以使用。 确认人：
确认日期： 2.3使用设备
上述设备经过校准合格，设备状态良好，可以使用。 确认人:
确认日期：
2.4实验用菌株
上述传代后待使用的菌种在5代之内，菌种特征明显，无变异，可以使用。 确认人：
确认日期： 2.5试验方法 2.5.1供试品制备
取供试品 10g加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液，该供试液可以用于需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌的检查。
2.5.2菌液的制备
2.5.2.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培养物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，制成10的菌液，依法10倍稀释至10， 分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用。
2.5.2.2取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入沙氏葡萄糖液体培养基中置20～25℃培养箱中培养2～3天，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物1ml加入9mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，制成10的菌液，依法10倍稀释至10
取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基
约20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用。
2.5.2.3取黑曲霉的新鲜培养物接种沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.05%聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，将孢子洗脱。取1ml加入含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，制成10 的菌液，依法10倍稀释至10，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml菌液备用。
2.5.3菌落计数
2.5.3.1分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌菌液各1ml接种至胰酪大豆胨琼脂培养基中（每种菌液接种2个平皿），置30～35℃培养不超过3天；
2.5.3.2分别取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基中（每种菌液接种2个平皿），置30～35℃培养，不超过5天。
2.5.3.3菌落计数结果见下表（2个平皿计数取平均值）
菌落计数结果（cfu∕ml）
2.5.4需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验
2.5.4.1供试液制备
取供试品10g加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，做为供试液。
2.5.4.2实验条件
2.5.4.2.1需氧菌培养温度：30～35℃ 3～5天。
2.5.4.2.2霉菌和酵母菌培养温度：20～25℃ 5～7天。
2.5.4.3试验方法
2.5.4.3.1试验组（供试液+菌液+培养基）
a.分别取3份供试液各10ml，分别加入0.1ml不大于100CFU的铜绿假单胞菌液、金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液，混匀后取其中1ml注皿，倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，置30～35℃培养箱中培养不超过3天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。
b.分别取2份供试液各10ml，分别加入0.1ml浓度不大于100CFU白色念珠菌液、黑曲霉菌液，混匀后分别取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，置30～35℃培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。
2.5.4.3.2供试品对照组（供试液+稀释液+培养基）
取供试液4ml，分别注入4个无菌平皿中（每皿1ml）；将其分成2组，分别加入0.1mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀后一组倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，另一组倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，置与试验组相同条件下培养, 计数。
2.5.4.3.3菌液对照组（稀释液+菌液+培养基）
分别取5份稀释液各10ml，分别加入0.1ml浓度不大于100CFU的5种菌液，混匀后每份取2 ml分别注2个无菌平皿（每皿1 ml）中，倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基（铜绿假单胞菌液、金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液注入胰酪大豆胨琼脂培养基）和沙氏葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌液、黑曲霉菌液注入沙氏葡萄糖琼脂培养基），置与试验组相同条件下培养, 计数。每株试验菌平行制备2个平皿。
2.5.4.3.4阴性对照组（稀释液+培养基）
另分别取2份各1mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液注入平皿, 倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，置30～35℃培养箱中培养不超过3天。倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基约20ml，置30～35℃培养箱中培养不超过5天。
2.5.4.4结果判定依据
2.5.4.4.1 阴性对照组应无菌生长，进行下一项计算。否则实验失败，不允许进行下一项判定。 2.5.4.4.2 试验组的菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
比值=试验组菌落数-供试品对照组的菌落数
菌液对照组菌落数
2.5.4.5试验结果
2.5.4.5.1阴性对照组结果：无菌生长。
2.5.4.5.2需氧菌总数计数结果
品名：黄连上清片
结果判定: 需氧菌总数计数实验阴性对照无菌生长，该实验有效； 5种菌的试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内，符合药典要求。
2.5.4.5.3霉菌和酵母菌计数方法适用性试验结果
2.5.4.5.3.1阴性对照组结果：无菌生长。
2.5.4.5.3.2霉菌和酵母菌总数计数结果
品名：黄连上清片
结果判定: 霉菌和酵母菌总数计数实验阴性对照无菌生长，该实验有效； 2种菌的试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内，符合药典要求。
2.5.5控制菌微生物检测方法适用性试验（包括大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌）
2.5.5.1大肠埃希菌检测方法适用性实验
2.5.5.1.1供试液制备
取供试品10 g加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，做为供试液。 2.5.5.1.2 供试品组（供试液+培养基）
取供试液10ml，接种至不超过45℃的胰酪大豆胨液体培养基100ml中，置30～35℃培养24小时, 取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30～35℃培养72小时。应无菌生长。
2.5.5.1.3试验组（供试液+菌液+培养基）
取供试液10ml，加入0.1ml不大于100cfu大肠埃希菌菌液，混匀后加入100ml胰酪大豆胨液体培养基，置30～35℃培养18小时, 取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30～35℃培养18小时。试验组应能检出大肠埃希菌的反应特征。
2.5.5.1.4阴性对照组 （稀释液+培养基）
取稀释剂PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml,加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养24小时，阴性对照应无菌生长。
2.5.5.1.5实验结果
品名：黄连上清片
2.5.4.1.5结论：上述实验阴性对照组无菌生长，实验有效。试验组检出大肠埃希菌，可以按此供试液制备方法和控制菌检查方法进行大肠埃希菌的检查。
2.5.5.2耐胆盐革兰阴性菌检测方法适用性实验
2.5.5.2.1供试液制备
取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基100ml混匀，制成1:10供试液。 2.5.5.2.2供试品组（供试品+培养基）
取供试液100ml置23℃培养2小时。取上述培养物10ml接种至100ml肠道菌增菌液体培养基中，33℃培养48小时后，分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，33℃培养24小时。如果平板上无菌落生长，判断供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。
2.5.5.2.4试验组（供试液+菌液+培养基）
取2份供试液各100ml，置23℃培养2小时，取上述培养物各10ml，分别加1ml不大于100cfu的大肠埃希菌菌液、铜绿假单胞菌菌液摇匀，接种至100ml肠道菌增菌液体培养基中，33℃培养24小时后，分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，33℃培养18小时。紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上应能检出耐胆盐革兰阴性菌的反应特征。
2.5.5.2.5阴性对照组 （稀释液+培养基）
取100ml胰酪大豆胨液体培养基，33℃培养24小时，阴性对照应无菌生长。
2.5.5.2.6实验结果
品名： 黄连上清片
2.5.5.2.7结论：上述实验阴性对照组无菌生长，实验有效。试验组检出耐胆盐革兰阴性菌，可以按此供试液制备方法和控制菌检查方法进行耐胆盐革兰阴性菌的检查。
2.5.5.3沙门菌检测方法适用性实验
2.5.5.3.1供试液制备
取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基100ml，混匀，做为供试液。 2.5.5.3.2 供试品组（供试品+培养基）
取供试液100ml，33℃培养24小时。取上述培养物0.1 ml接种至10 mlRV沙门增菌液体培养基中。33℃培养24小时，取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，33℃培养48小时。
2.5.5.3.3试验组（供试液+菌液+培养基）
取供试液100ml，33℃培养24小时。取上述培养物0.1 ml加1ml不大于100cfu的沙门菌菌液摇匀，接种至10 mlRV沙门增菌液体培养基中。33℃培养18小时，取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，33℃培养18小时。木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应能检出沙门菌的反应特征。
2.5.5.3.4阴性对照组 （稀释液+培养基）
取100ml胰酪大豆胨液体培养基，置33℃培养48小时，阴性对照应无菌生长。
2.5.5.3.5实验结果
品名：黄连上清片
2.5.5.3.6结论：上述实验阴性对照组无菌生长，实验有效。试验组检出沙门菌，可以按此供试液制备方法和控制菌检查方法进行沙门菌的检查。
3.方法判定
黄连上清片按《中国药典》2015年版（1105）、（1106）非无菌产品微生物限度检查项下：“微生物计数法”“控制菌检测法”进行计数方法适用性实验和控制菌检查方法适用性实验，实验结果符合药典要求。
确认了该供试液的制备方法及计数方法可以用于黄连上清片需氧菌及霉菌、酵母菌计数的检查；确认了该供试液制备方法和控制菌检查方法可以用于该产品的三种控制菌检查。
4.再验证周期
当检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行计数方法适用性实验和控制菌检查方法适用性实验。
范文十：摘要：建立百灵安神片的微生物限度检查方法。方法按照《中国药典》2010版微生物限度检查方法进行验证试验。结论本品可采用培养基稀释法检查细菌数，采用常规法检查霉菌及酵母菌数，可操作性强。 　　关键词：百椹安神片；微生物限度检查；抑菌作用 　　百灵安神片主要含有制何首乌、酸枣仁（炒）、桑椹、灵芝、百合、知母、丹参、菊花、茯苓、合欢花等多种成分。其中多味中药材含有抑菌成分，可抑制污染的微生物生长，这就给药品造成了安全隐患，因此为了更好而有效的保障该药品的质量，我们根据《中国药典》2010年版一部附录[1]的要求对百灵安神片进行了微生物限度检验方法验证，以期获得更具科学性和准确性的微生物限度检查方法，从而保证检验结果的准确性。 　　1 药物与试剂 　　1.1样品 百灵安神片（批号，，）石家庄以岭药业股份有限公司 　　1.2 培养基 营养琼脂培养基（批号：）；改良马丁琼脂培养基（批号：121027）；玫瑰红钠琼脂培养基（批号：）；胆盐乳糖培养基（批号：1204232）；营养肉汤培养基（批号：120913）；改良马丁培养基（批号：120216）；乳糖胆盐发酵培养基（批号：）；曙红亚甲蓝琼脂培养基（批号：1301262）；4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（批号：120423）；乳糖发酵培养基（1206214）；pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 　　来源：中国药品生物制品检定所 　　1.3菌种 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]；大肠埃希菌[CMCC（B）44102]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]；黑曲霉[CMCC（F）98003]；乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]，以上培养基和菌种由中国药品生物制品检定所提供。 　　1.4仪器 生化培养箱：LRH-250F上海一恒仪器有限公司；生物安全柜：美国Frontline；菌落计数器：XK97-A 姜堰市新康医疗器械有限公司；超速离心机：LD4-1.8型 北京京立离心机有限公司。 　　2 菌液及供试品的制备 　　2.1菌悬液的制备 ①取经30～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的营养肉汤培养物，10倍稀释至50～100cfu/ml，备用；②取经23～28℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物，10倍稀释成50～100cfu/ml，备用；③取经23～28℃培养5～7d的黑曲霉斜面培养物，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～100cfu的孢子悬液，备用； 　　2.2供试品制备 称取样品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml制成1：10的供试液 　　3细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证 　　取规定量1：10供试液和上述制备好的阳性对照菌液1ml置平皿中，加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混合均匀，放置凝固后，置培养箱中培养。每株试验菌平行制备2个平皿，计数，计算回收率： 　　3.1平皿法 取1：10供试液1ml/皿 　　3.2培养基稀释法 取1：10供试液2ml，每1ml供试液等量分注5个平皿，每5个平皿为一组，倾注营养琼脂培养基，混匀，凝固后，倒置培养。另外取1ml供试液和白色念珠菌、黑曲霉阳性对照菌液1 ml注入平皿中，做2个平行样，倾注琼脂培养基，混匀，凝固后，倒置培养。见图1。 　　图1 　　3.3计算回收率 试验组：按上述三种方法取1：10供试液，分别污染50～100cfu/ml的试验菌株，立即倾注细菌和霉菌培养基，待凝固后，置规定温度培养3～5d观察结果：菌液组：测定所加的试验菌数；供试品对照组：测定供试品的本底菌数；稀释剂对照组：方法同试验组。 　　4结果与分析 　　见表1～表3。 　　由表1可知：五株试验菌适宜稀释度菌悬液菌落个数都在50～100cfu，因此符合微生限度检查方法验证用菌种稀释度要求。 　　5控制菌检查方法验证 　　见表4～表6。 　　从表4、表5、表6可以看出：该供试品控制菌检查可采用1：10供试液进行控制菌检查。 　　本品按照《中国药典》2010年版一部附录[1]检查，由以上试验结果得：按供试品制备方法称取10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml制成1：10的供试液，细菌限度检查采用培养基稀释法（0.2ml/皿），霉菌及酵母菌限度检查采用常规法；控制菌限度检查采用常规法。 　　6讨论 　　中药制剂含有多种成分，其中部分成分具有一定的抑菌作用，给中成药微生物含量检测带来一定困难。采用常规法进行微生物限度检查，将影响微生物限度检查结果的准确性，对患者安全用药埋下隐患。 　　通对本品的微生物限度检查计数方法的验证可知：建立了百灵安神片的微生物检查方法，可采用培养基稀释法（0.2ml/皿）进行细菌限度检查，可采用常规法进行霉菌及酵母菌限度检查；采用常规法进行控制菌限度检查。解决了药物抑菌成分的存在对微生物限度检查产生的干扰，能够真实、客观地反映药物的染菌情况，使检查结果科学、准确、可信。在处方、生产工艺及检测环境不变的情况下，可按上述验证后的方法进行本品的微生物限度检查。 　　参考文献： 　　[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-88. 　　编辑/王海静