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吸光光度法的应用中试样中微量组分的测定(四)
【来源/作者】周世红 【更新日期】
双波长吸光光度法:
在单波长光度分析中，常遇到如下问题难于解决。首先是共存的其他成分与被测成分吸收谱带重叠，干扰测定。其次是在测定的波长范围内，辐射光受到溶剂、胶体、悬浮体等散射或吸收，产生背景干扰。利用双波长吸光光度法，可有效地消除上述各种干扰，求得待测组分的含量，使吸光光度法的应用范围大为扩展。
(1)双波长吸光光度法的原理
使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸光度的差值。这样就可以从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号，进而消除各种干扰。
图8—16所示为双波长吸光光度法的原理图。从光源发出的光线分成两束，分别经过两个单色器，得到波长不同的单色光。借助切光器，使这两道光束以一定的频率交替照到装有试液的吸收池，最后由检测器显示出试液对波长为λl和γ2的光的吸光度差值△A。
设波长为λl和γ2的两束单色光的强度相等，则有：
由此可见，△A与吸光物质浓度成正比。这是用双波长吸光光度法定量分析的理论依据。可以看出，只要λl和γ2选择适当，就能将干扰组分的吸收消除掉，不必预先分离或采用掩蔽手段，就可对化合物分别进行定量测定。同时，由于只用一个吸收池，且以试液本身对某一波长的光的吸光度为参比，消除了因试液与参比试液及两个吸收池之间的差异引起的测量误差，提高了测量的准确度。
(2)双波长吸光光度法的应用
①在进行单组分测定时，通常以配合物吸收峰作测量波长，参比波长的选择有：以等吸收点为参比波长；以有色配合物吸收曲线下端的某一波长作为参比波长；以显色剂的吸收峰为参比波长等。
②两组分共存时的分别测定。当两种组分的吸收光谱有重叠时，要测定其中一个组分就必须消除另一组分的光吸收。
图8—17所示为x、y两共存组分的吸收光谱曲线。测得试液中cx时，选γ2和λl作测定波长和参比波长。y在γ2和λl波长处的摩尔吸光系数相等，即εyγ2=εyγ1，吸光度相等，称为等吸收点。而组分x在γ2处有最大吸收。根据吸光度的加和性，则：
对于γ2 Aγ2=εyγ2bcx+εyγ2bcy
对于γ1 Aγ1=εxγ1bcx+εyγ2bcy
故由双波长光度计测得:
△A=Aγ2一Aγ1=(εyγ2—εxγ1)bcx (8—19)
可见，△A与cx成正比而与cy无关，从而消除了y的干扰。
被测组分x在两波长处的△A越大，越有利于测定。同样方法可以在组分x的干扰下测定组分y的含量。
需要指出的是，选择波长的原则，必须符合两个基本条件：一是干扰组分y在这两个波长(测定波长和参比波长)处应具有相同的吸光度，二是待测组分在这两个波长处的吸光度差值应足够大。因此，此时的双波长法又称为等吸收波长法。
另外，应用双波长法时，干扰组分的吸收光谱中至少需要有一个吸收峰或谷，这样才能在两个不同波长处存在等吸光度值。
③浑浊样品的测定：浑浊样品由于散射的原因造成背景吸收较大。但背景吸收随波长变化较小，因而相近波长下的背景吸光度差值近似为零，故选择合适的双波长就能消除背景吸收。
参考资料：分析化学
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(1)200～400nm的紫外光区，(2)400～760nm的可见光区， (3)2.5～25μm(按波数计为4000cm&-1&～400cm&-1&)的红外光区。
检测仪器/分光光度法
紫外分光光度计，可见分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。
基本原理/分光光度法
分光光度法当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为:根据朗伯(Lambert)-比尔(Beer)定律:A=abc式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/dm^3)， a为吸光系数。其中吸光系数 与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。溶液中其他组分（如溶剂等）对光的吸收可用空白液扣除。由上式可知，当固定溶液层厚度l和吸光系数a时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长 ，然后以此波长 的光为光源，测定一系列已知浓度c溶液的吸光度A，作出A~c工作曲线。在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。这便是分光光度法测量浓度的基本原理。
主要特点/分光光度法
分光光度法对于分析人员来说，可以说是最有用的工具之一。几乎每一个分析实验室都离不 开紫外可见分光光度计。分光光度法的主要特点为：（1）应用广泛由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加以测定。到目前为止，几乎化学元素周期表上的所有元素（除少数放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法 。在国际上发表的有关分析的论文总数中，光度法约占28%，我国约占所发表论文总数的33% 。（2）灵敏度高由于新的显色剂的大量合成，并在应用研究方面取得了可喜的进展，使得对元素测定的灵敏 度有所推进，特别是有关多元络合物和各种表面活性剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光 系数由原来的几万提高到数十万。（3）选择性好目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如、、、 、、等元素的测定，已有比较满意的方法了。（4）准确度高对于一般的分光光度法，其浓度测量的相对误差在1～3%范围内，如采用示差分光光度法进 行测量，则误差可减少到0.X%。（5） 适用浓度范围广可从常量（1%～50%）（尤其使用示差法）到痕量（10-8～10-6%）（经预富集后）。（6） 分析成本低、操作简便、快速由于分光光度法具有以上优点，因此目前仍广泛地应用于、、、、、等部门及环境监测系统。单在水质分析中的应用就很广，目前能有直接法和间接法测定的金属和非就有70多种。
主要种类/分光光度法
紫外分光光度法双波长分光光度法纳氏试剂分光光度法钼锑抗分光光度法亚甲基蓝分光光度法邻菲罗啉分光光度法荧光分光光度法
使用范围/分光光度法
凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，可用于药品的、纯度检查及含量测定。
测定方法/分光光度法
对照品比较法（1）按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100±10%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下式计算含量，即得。（2）计算式A样×G对/稀释倍数×100×1含量（%）= ————————————-- ×100%A对×G样/稀释倍数×100×1吸收系数法（1）按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸收度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，应注意仪器的校正和检定。（2）计算式A样含量（%）= ——————————————- ×100%G样/稀释倍数×(E1％1ｃｍ)对×100×1计算分光光度法采用计算分光光度法应慎重。本法有多种，使用时均应按各品种项下规定的方法进行。当吸收度处在吸收的陡然上升或下降的部位测定时，波长的微小变化可能对测定结果造成显着影响，故对照品和测试条件应尽可能一致。若测定时不用对照品，如维生素A测定法，则应在测定时对作仔细的校正和检定。
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扫码下载APP联系人：陈小姐第六章 吸光光度法（高级药物分析工和化验分析工理论试卷）
一、填空题（每题1分，共20分） 1、紫外可见吸收光谱是由分子中的????
??产生的。 2、不同波长的光具有不同的能量。波长愈大，光的能量???????? 3、分子吸收光谱同原子吸收光谱相比，分子吸收光谱是???????? 4、物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。硫酸铜颜色呈蓝色是由于它吸收了白光中的????????
5、二苯硫腙－四氯化碳萃取剂吸收580～620nm波长的光，因此，该萃取剂呈现的颜色是????????
6、摩尔吸收系数的单位是????????
7、质量相同的A、B两物质，其摩尔质量M（A）>M（B），经相同方式显色后测定，测得的吸光度相等，则它们摩尔吸收系数的关系是????????
8、某有色物的摩尔浓度为1.0×10-5mol/L，以1cm比色皿在最大吸收波长下的吸光度为0.28，在此波长下，该有色物的摩尔吸收系数是????????
9、吸光度A与透光率T的关系式为????????
10、用邻二氮菲光度法测铁时，浓度为1.0×10-4mol/L的透光度为64％，若浓度为1.5×10-4mol/L时，其透光率为????????
11、离子选择电极相应斜率S（mv/px）的理论值为????????。 12、人眼能感觉到的可见光的波长范围是????????。 13、在紫外-可见分光光度法中，透射光强度（I）与入射光强度（Io）之比I/Io称为????????。 14、在光度分析中，某有色物质在某浓度下测得其透光度为T；若浓度增大1倍，测透光度为????????。 15、在可见分光光度计中常用的检测器是????????。 16、某吸光物质的摩尔质量为M，则其摩尔吸光系数?与比吸光系数E之间的换算关系为????????。 17、芳香族化合物的紫外可见特征吸收带的是????????。 18、分子荧光的产生是
19、荧光量子效率是指
1 20、在同样条件下，测的浓度为0.030?g/ml的罗丹明标准液的荧光强度为60，样品的荧光强度为50，空白液的荧光强度为10，则样品中罗丹明的浓度为
?g/ml 二、判断题（每题1分，共20分，把选项填在答案栏，对的打“√”错的打“×”） 题号 1 答案
题号 11 答案
1紫外光的波长范围是400～800nm 2、吸收光谱曲线表明了吸光度随波长的变化 3、吸收光谱曲线中，最大吸收处的波长为最大吸收波长 4、吸光系数的大小只与物质的性质、温度、溶剂有关 5、吸光度随透射率的增大而增大 6、在紫外可见区测量吸光度时可以选择石英和玻璃吸收池 7、在符合朗伯比尔定律的范围内，有色物的浓度、最大吸收波长、吸光度三者的关系是增加、增加、增加 8、吸光度随入射光的波长减小而减小 9、光度分析中，用1cm的比色皿测得的透射率为T，若改用2cm的比色皿测得的透射率为T2 10、由甲、乙两个不同浓度的同一有色物质的溶液，用同一波长的光测定，当甲溶液用1cm比色皿，乙溶液用2cm比色皿时获得的吸光度相同，则它们的浓度是甲是乙的两倍 11、目视比色法中，常用的标准系列法是比较一定厚度溶液的颜色深浅 12、紫外光分子光谱法中的光源是钨丝灯 13、在分光光度计中，光电转换装置接受的是透射光的强度 14、多组分吸光光度法可用解联立方程的方法求得各组分的含量，这是基于各组分的浓度有一定的函数关系 15、双波长分光光度计的输出信号是样品在两个波长处吸光度的差值 16、双波长分光光度计与单波长分光光度计的主要区别在于使用的单色器的个数
2 17、适合于连续变化法测定配合物的配合比是固定金属离子和显色剂的总浓度不变 18、再用连续变化法测定配合物的组成时，测得金属离子占总浓度的分数是0.33时，此配合物的组成（M:R）为1：3 19、甲醛分子中只存在????的跃迁 20、在苯的非极性溶剂中看不到其精细结构 三、选择题（每题2分，共40分，把选择答案的字母填在表格中） 题号 1 答案
题号 11 答案
1、在分光光度法中，宜选用的吸光度读数范围是 A、0～0.2
B、0.1~0.4
C、0.2~0.7
D、1.0~2.0 2、用紫外可见光度法测定时，要求控制溶液的pH范围是 A、3～9
D、1～14 3、在用紫外可见光度法测定溶液中的时，需要加入盐酸羟胺，其作用是 A、作为中和剂
B、作为氧化剂
C、作为还原剂
D、作为显色剂 4、在用紫外可见光度法测定溶液中的时，需要选用参比溶液，该参比溶液的组成是 A、溶剂水
B、溶剂水和显色剂
D、除铁以外所有组成测量溶液的试剂 5、某物质的摩尔吸光系数很大，则表明 A、该物质溶液的浓度很大
B、该物质对某波长的光吸收能力很强
C、光通过该物质溶液的光程很长
D、测定该物质的灵敏度越低 6、有色配合物的吸光度与下列因素无关的是 A、入射光的波长
B、比色皿的厚度
C、有色配合物的浓度
D、配合物的稳定常数 7、影响有色配合物的摩尔吸收系数的因素是 A、比色皿厚度
B、入射光的波长
C、配合物的浓度
D、配合物的稳定性常 3 数 8、以下说法正确的是 A、透射率与浓度成直线关系
B、摩尔吸收系数随波长而变
C、吸光度与浓度不呈线性关系
D、玻璃棱镜适合于紫外区 9、以下说法错误的是 A、有色液的最大吸收波长不随有色液的浓度而改变
B、物质对不同波长的光具有选择性吸收
C、有色液的摩尔吸收系数越大，显色反应越灵敏
D、目视比色法也是吸收光度法 10、在吸光光度法分析中，常出现标准曲线不通过原点的情况，下列说法中不会引起这一现象的是 A、测量合参比溶液所用比色皿不对称
B、参比溶液选择不当
C、显色反应的灵敏度低
D、显色反应的检测限太高 11、下述说法中，不引起偏离朗波比耳定律的是 A、非单色光
B、介质的不均匀性
C、检测器的光灵敏度范围
D、溶液中的化学反应 12、若分光光度计的测量绝对误差Dt=0.01，当测得透射率 T=70%时，则其测量引起的浓度相对误差是 A、4％
D、8％ 13、示差吸收光度法和普通吸光光度法不同点在于参比溶液的不同。前者的参比溶液为 A、去离子水
B、以空白溶液（不含待测组分的溶液）
C、在空白溶液中加入比待测溶液浓度稍高的标准溶液
D、在空白溶液中加入比待测溶液浓度稍低的标准溶液 14、用普通吸收光度法测得标准溶液C1的透射率为20％，试液的透射率为12％；若以示差光度法测定，以C1为参比溶液，则试液的透光率为 A、40％
D、70％ 15、某显色剂在pH为1～6是呈黄色，pH为6～12时呈橙色，pH大于13是呈红色。该显色剂与某金属离子络合后呈现红色，则该显色反应应在 A、弱酸溶液中进行
B、弱碱性溶液中进行
C、中性溶液中进行
D、强碱性 4 溶液中进行 16、指出下述操作中错误的是 A、比色皿外壁无水珠
B、手捏比色皿的毛面
C、用普通白纸去擦比色皿外壁的水珠
D、待测溶液注到比色皿的三分之二高度处 17、示差分光光度法主要适用于 A、低含量组分的测定
B、高碱度条件下的测量
C、高组分含量的测量
D、高酸度条件下测定 18、下列化合物同时具有n???,????,???? A、一氯甲烷
D、异丙醇 19、不能用作紫外可见光谱法定性分析参数的是 A、吸光度
B、最大吸收波长
C、吸收光谱形状
D、吸收峰的数目 20、下列各带中属于芳香族化合物的特征吸收带的是 A、R带和K带
B、B带和K带
C、E带和B带
D、K带和E带 四、简答题（每题3分，共12分） 1、摩尔吸收系数的物理意义是什么？
2、什么是吸收光谱？什么是标准曲线？
3、有机化合物存在几种电子类型？发生哪些跃迁？哪种跃迁是紫外可见吸收？
4、用流程图说明紫外可见分光光度计组成/