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鼠疫耶尔森菌
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鼠疫耶尔森菌特性抗原的克隆表达与初步应用研究
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中国疾病预防控制中心硕L学位论文 鼠疫耶尔舞菌特异性抗喊的克降表达与初步应用研究 本研究中的缩略语 学位论文原创性、真实性声明 本人郑重声明：《鼠疫耶尔森菌特异性抗原的克隆表达与
初步应用研究》是本人在中国疾病预防控制中心病原生物学
专业攻读硕士学位期间，在导师指导下完成的硕士学位论文。
我承诺：本论文中所涉及的所有数据、试验记录以及研究结果
均真实可信，引用资料已注明出处，无剽窃、篡改、抄袭之行
为。如本论文原创性方面出现问题，我愿负法律责任。 本课题的研究成果归中国疾病预防控制中心所有，发表文
章的单位署名为中国疾病预防控制中心。 特此声明!
学位论文作者 签名 ： 研究生导师 签名 ： 果莹魈 彩茅多为不
2007年-『月2日 2．007年]月&日
中国疾病顶防|空制中心硕JJ学位论文 鼠疫耶尔舞菌特异性抗原的克隆表达与初步应用研究 论文摘要 鼠疫耶尔森菌特异性抗原的克隆表达与初步应用研究 硕士研究生： 粱莹 导 师： 海荣 研究员 俞东征
研究员 单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 目的：利用基因工程的技术手段，获得融合表达的鼠疫菌特异性抗原，建立一
种非F1抗原的新型鼠疫快速诊断方法，并与经典的鼠疫菌检测方法相结合用于解决
鼠疫监测现场工作中遇到的各种问题。
己发表的鼠疫菌C092株全基因组序列设计引物，PCR扩增目的基因片段。实验中采
用pET-30a + 作为表达载体，通过双酶切反应和连接反应，将目的基因片段定向插
疫反应性。应用固定化金属离子亲和层析技术烈i．1、『TA柱 纯化重组蛋白，并初步建立
了基于该重组蛋白的间接ELISA方法。
人血清发生特异性反应。用纯化的重组P
正在加载中，请稍后...耶尔森菌属（Yersinia）属于科，包括耶氏菌、耶氏菌与假结核耶氏菌等十余个菌种，这是一类革兰阴性小。其中鼠疫耶氏菌、小肠结肠炎耶氏菌与假结核耶氏菌对人类的已明确。本属通常先引起啮齿动物、家畜和鸟类等动物，人类通过接触已感染的动物、食入污染食物或节肢动物叮咬等途径而被感染。
：为两头钝圆，两级浓染的卵圆形短小杆菌。革兰阴性，有，无，无。兼性厌氧，最适生长温度为27-30摄氏度，pH为6.9-7.2。
致病性与：鼠疫耶氏菌具有F1、V/W、Pgm、Pst1等重要的因子，毒力很强，少量细菌即可使人致病。感染后可获得牢固免疫力，再次感染罕见。机体主要产生针对F1、V/W的等，具有调理促吞噬、细菌及中和等作用。
出自A+医学百科 “耶尔森菌属”条目
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临床执业医师考试复习指导：耶尔森菌属
&　　耶尔森菌属(Yersinia)细菌属于肠杆菌科，是一类革兰阴性小杆菌。包括11个菌种，其中鼠疫耶氏菌、小肠结肠炎耶氏菌与假结核耶氏菌等三种肯定是人类致病菌。本属细菌通常先引起啮齿动物、家畜和鸟类等动物感染，人类通过接触动物、被节肢动物叮咬或食入污染食物等途径感染。
　　一 鼠疫耶 氏菌
　　鼠疫耶氏菌(Y.pestis)俗称鼠疫杆菌，是鼠疫的病原菌。鼠疫是一种自然疫源性的烈性传染病，历史上曾发生过三次世界性大流行。人类鼠疫是被疫鼠的鼠蚤叮咬而受染，年世界各地报告鼠疫病例共5440余例，死亡681人，病死率11%。因此，鼠疫依然威胁着人类。
　　(一)生物学性状
　　形态与染色
　　为形两端浓染的卵圆短杆菌。大小为0.5~0.8
&1~2mm。一般单个散在，偶尔成双或呈短链。有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰染色阴性。从死于鼠疫的尸体或动物新鲜内脏制备的印片或涂片，形态典型，有时可见到吞噬细胞内外均有本菌。但在化脓或溃疡性病灶及腐败材料中可见菌体膨大成球形，且着色不佳。如在陈旧培养物或生长在含高盐(30g/L
NaCl)的培养基上则呈多形态性，有球形、杆形、棒形和哑铃状等，亦可见到着色极浅的细菌轮廓，称菌影(ghost)。
　　培养特性
　　兼性厌氧，最适生长温度为27~30℃，最适pH为6.9~7.2。在普通培养基上能生长，但生长缓慢。在含血液或组织液的培养基上生长，
24~48h可形成柔软、粘稠的粗糙型菌落。在肉汤培养基中开始呈混浊，24h后表现为沉淀生长，48h后逐渐形成菌膜，稍加摇动菌膜呈&钟乳石&状下沉，此特征有一定鉴别意义。
　　抗原结构
　　鼠疫耶氏菌的抗原结构复杂，至少有18种抗原，重要的有F1、V-W、外膜蛋白和MT等四种抗原。
　　1.F1(fraction 1)抗原
　　是鼠疫耶氏菌的荚膜抗原，于37℃时产生，具有抗吞噬和活化补体的作用。F1的抗原性强，特异性高，其相应抗体具有免疫保护作用。但F1抗原是一种不耐热的糖蛋白，100℃15min即失去抗原性。
　　2.V和W抗原
　　系毒力质粒DNA编码。W抗原位于菌体表面，是一种脂蛋白;V抗原存在于细胞质中，为可溶性蛋白。两种抗原总是一起产生，与细菌毒力有关，使细菌具有形成肉芽肿损伤和在细胞内存活的能力，且有免疫抑制作用。
　　3.外膜蛋白(Yersinia outer membrane proteins,Yop)
　　其编码基因与V-W基因存在于同一质粒上，在37℃和含Ca2+条件下能产生数种外膜蛋白，这些蛋白能使细菌在突破宿主的防御机制，导致机体发病等方面具有重要作用。
　　4.鼠毒素(murine toxin,MT)
　　为可溶性蛋白，是一种外毒素，对鼠类有剧烈毒性，1mg即可使鼠致死，它可阻断动物b肾上腺能神经和引起心脏损害，但对人的损伤作用尚不清楚。MT具有良好的抗原性，用0.2%甲醛处理可使其脱毒制成类毒素，用于免疫动物制备抗毒素。
　　5.内毒素
　　其性质与肠道杆菌内毒素相似，可致机体发热，产生休克和DIC等。
　　抵抗力
　　对理化因素抵抗力较弱。湿热70~80℃10min或100℃1min死亡，5%来苏或5%石炭酸20min内可将痰液中病菌杀死，但在自然环境中的痰液中能存活36d，在蚤粪和土壤中能存活1年左右。
　　变异性
　　鼠疫耶氏菌通过自发或诱发性突变、转座子移位及基因转移等机制发生变异，其生化特性、毒力、耐药性和抗原构造等均可出现变异菌株。与多数肠道菌光滑(S)型菌落致病性强的特征不同，野生菌株的菌落呈粗糙(R)型。经人工传代培养后菌落逐渐变为S型，其毒力也随之减弱。
　　(二)致病性与免疫性
　　致病物质
　　鼠毒素主要对鼠类致病，具外毒素性质，但只有当细菌自溶裂解后才释放。鼠疫耶氏菌的毒力很强，少数几个细菌即可使人致病，其致病性主要与F1抗原、V-W抗原、外膜抗原及内毒素等相关。
　　所致疾病
　　鼠疫是自然疫源性传染病，一般先在鼠类间发病和流行，通过鼠蚤的叮咬而传染人类，尤其当大批病鼠死亡后，失去宿主的鼠蚤转向人群。人患鼠疫后，又可通过人蚤或呼吸道等途径在人群间流行。临床常见有腺型、肺型和败血症型鼠疫。
　　鼠疫耶氏菌侵入人体，被吞噬细胞吞噬后能在细胞内生长繁殖，并沿淋巴流到达局部淋巴结，引起严重的淋巴结炎。犯及的淋巴结多在腹股沟，一般为单侧，并引起肿胀、出血和坏死，称为腺鼠疫。如吸入染菌的尘埃则引起原发性肺鼠疫，也可由腺型或败血症型鼠疫蔓延而致继发性肺鼠疫。病人高热寒战，咳嗽、胸痛、喀血、呼吸困难，全身衰竭而出现严重中毒症状，多于2~4d内死亡。病人死亡后皮肤常呈黑紫色，故有&黑死病&之称。重症腺型或肺型鼠疫患者的病原菌可侵入血流，导致败血症型鼠疫，体温升高至39~40℃，发生休克和DIC，皮肤粘膜见出血点及淤斑，常并发支气管肺炎和脑膜炎等症状，多迅速恶化而死亡。
　　免疫性
　　鼠疫感染后能获得牢固免疫力，再次感染罕见。主要产生针对F1抗原、V-W抗原的抗体等，具有调理促吞噬、凝集细菌及杀菌等作用。另外，尚依赖于吞噬细胞吞杀细菌等细胞免疫的作用。
　　(三) 微生物学检查
　　按不同病型采取淋巴结穿刺液、痰、血液等。人或动物尸体取肝、脾、肺、肿大淋巴结和心血等。陈旧尸体取骨髓。因鼠疫为法定甲类烈性传染病，其传染性极强，除标本采取时要严格无菌操作和控制外，标本必须送指定的具有严格防护措施的专门实验室，并按严格操作规程进行。
　　直接涂片镜检
　　检材直接涂片或印片，分别进行革兰染色和美蓝染色，镜检观察典型形态与染色性。免疫荧光试验用于快速诊断。
　　分离培养与鉴定
　　将检材接种于血琼脂平板或0.025%亚硫酸钠琼脂平板等，经24h孵育后形成针尖样小菌落，经48h后才形成1~1.5mm灰白色较粘稠的粗糙型菌落。在液体培养基中孵育48h可形成&钟乳石&现象。当分离出可疑菌落时，可作涂片镜检，噬菌体裂解试验，血清凝集试验等进一步鉴定。
　　(四) 防治原则
　　灭鼠灭蚤是切断鼠疫传播环节，消灭鼠疫源的根本措施。我国目前应用EV无毒株生产活菌疫苗，多用皮下、皮内接种或皮上划痕，免疫力可维持8~10个月。此外，应加强国境、海关检疫。
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