【血液学相关新闻】老年人长期腰痛背当心多发性骨髓瘤（科普：什么是多发性骨髓瘤MM）
腰疼是中老年人常见的病症之一，许多上了年纪的人并不把这当回事儿。然而一种血液性恶性肿瘤&多发性骨髓瘤&，就可能隐藏在腰疼背后，并且绝大多数患者在发病早期都容易被误诊。
腰疼易被中老年人忽视多发性骨髓瘤患者大多数都是在综合医院的其他科室辗转治疗无效后，才来到血液科。在临床上，较少见到在发病第一时间，就来血液科对症治疗的患者。多发性骨髓瘤是一种血液病，属于恶性肿瘤，目前尚不明确病因，也没有发现有效预防的办法，对于这种疾病，最好是&早发现、早治疗&。多发性骨髓瘤往往&青睐&40岁以上的中老年人，其典型表现为腰背疼痛，由于人上了年纪容易出现骨质疏松，轻微的劳累或磕碰都可能导致腰背疼痛，因此很多中老年人都没把这当回事儿。当疼痛时间长、疼痛严重时，他们才接受治疗，这往往会贻误病情、耽误治疗。据了解，多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生的恶性肿瘤，发病率估计为2～3/10万。持续性无法解释的骨骼疼痛、特别是背部或胸廓疼痛，是该病的常见症状。该病常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血，而且对细菌性感染的易感性增高，正常免疫力受损，病情严重的部分病人可能出现昏迷、失明、肢体瘫痪、肾功能衰竭等。
腰背痛竟是多发性骨髓瘤1年多前的一个平常日子，陈大伯像往常一样，打算上街逛逛打发一下时间，突然一个不小心，摔了一跤，觉得腰背疼痛了起来，活动时疼痛更加明显，但是休息后似乎有所好转。他以为是腰背扭伤，便到义乌当地医院看病治疗，开了些活血化瘀的药吃吃，腰貌似不痛了，陈大爷以为病就这样好了。但仅仅隔了三个月，陈大爷又摔了一跤，这一摔可摔出了大问题，陈大爷的腰痛越来越严重，从以前的起床自如，发展到现在连坐起来都困难。陈大爷和家人慌了，立即到杭州看病。辗转杭城各大院，最终医生诊断陈大爷的病是多发性骨髓瘤，他便开始在浙大一院多发性骨髓瘤诊疗中心治疗。陈大爷自己说：&没想到摔一跤会摔出一个骨髓瘤来，本以为就是扭伤，休息几天就好了，结果是个癌症，哎！&
多发性骨髓瘤为何易误诊那么，为何大多数多发性骨髓瘤病人都是辗转求医，才能被确诊呢？这种病早期容易被误诊，是因为各个医院设备不好，还是医生水平不高？其实都不是。该病发病初期，容易被误诊为骨质疏松、腰椎病、贫血等病，其原因除了血液病在所有疾病中所占比例相对较少、人们不容易想到外，其症状和以上几类疾病表现相似，是导致患病初期误诊高发的重要原因之一。虽然多发性骨髓瘤属于血液病中的多发病，其比例不低于白血病，但由于血液病在所有疾病中所占的比例相对偏低，因此，患者出现腰背酸痛等中老年人常见症状，很少有人能想到这是血液性疾病。另外，多发性骨髓瘤的症状和许多常见病相似。比如，由于多发性骨髓瘤的典型症状为腰背等部位骨头疼痛，所以患者第一次就诊往往直奔外科，这也是比较合理的；有的患者会出现头晕目眩、浑身无力等症状，这都属于神经科疾病的典型表现，于是在外科治疗无效后，患者会被转到神经科接受检查、治疗；还有些患者由于病情发展，会出现浮肿，这是出现了肾损坏的表现，于是他们辗转到泌尿科问诊&&但是，外科、神经科、泌尿科等科室的相关检查，基本都不涉及血液检查，因此无法查出病人患的是多发性骨髓瘤，只有在医院各个科室检查、治疗无果后考虑到发病率较低的血液科，才算&找对了门儿&。其实，只要到血液科查个血常规，这种疾病就能被发现了。&
一、多发性骨髓瘤MM，来自《临床血液学检验》
多发性骨髓瘤（MM）：即浆细胞骨髓瘤
是骨髓内单一浆细胞株异常增生的一种恶性肿瘤，其特征是单克隆浆细胞恶性增殖并分泌过量的单克隆免疫球蛋白或其多肽链亚单位，即M蛋白（monoclonal protein），正常多克隆浆细胞的增生和多克隆免疫球蛋白分泌受到抑制，从而引起广泛骨质破坏、贫血、感染等一系列临床表现。尿内出现本周蛋白，最后导致贫血和肾功能损害。【病因】尚不明确。&病因：遗传因素、慢性抗原刺激、电离辐射、病毒感染等 发病机制：癌基因的激活 ,单株前B细胞突变,瘤细胞自分泌及旁分泌某些淋巴因子，尤其IL-6,是骨髓瘤细胞最关键的增生和存活因子。【临床特点】40岁以下发病少见，早期多无明显症状（1）骨髓瘤细胞对骨骼和其他组织器官侵润与破坏： 1）骨痛、骨质疏松和病理性骨折； 2）脾、淋巴结、肾脏以及肝脏等肿大； 3）贫血；其他：髓外骨髓瘤、神经浸润，可发展为浆细胞白血病胸、肋、锁骨连接处发生串珠样结节者为本病特征。（2）血浆蛋白异常： 1）感染、 2）高粘滞综合征、 3）出血倾向、 4）淀粉样变性和雷诺现象（3）感染和肾功能不全，也是死亡的主要原因。【检验】1、血象：不同程度的贫血，多属正常细胞、正常色素性。贫血随病情的进展而加重。成熟红细胞呈&缗钱&状排列。可有少数幼粒-幼红细胞。血沉加快。晚期患者有全血细胞减少。骨髓瘤细胞可在外周血出现，当&2.0&10^9/L时，应诊断为浆细胞白血病。2、骨髓象：骨髓瘤细胞占有核细胞总数10%以上。该细胞在骨髓内可呈弥漫性分布，也可呈灶性、斑片状分布，因而有时需多部位穿刺才能诊断。骨髓活检可提高检出率。 瘤细胞的大小，形态和成熟程度与正常浆细胞有明显不同。有时可见火焰细胞：
3、血液生化检查：异常球蛋白血症：M蛋白（三种类型： 1.免疫球蛋白分子 &/ &2.游离的轻链，即本周蛋白 &/ &3.某种重链的片段）。血钙、血磷测定：增高。血清碱性磷酸酶：正常。血清&2微球蛋白：增高 血清乳酸脱氢酶：增高.尿：蛋白尿、本周蛋白血清及尿液蛋白检测：（1）75%左右骨髓瘤患者血清蛋白电泳可检测到M成分；（2）70％左右的患者尿中发现M成分，即B-J蛋白；（3）白蛋白正常或减少，正常的γ-球蛋白比例减少判断M成分的存在：（1）血清蛋白电泳上出现M成分； （2） 免疫电泳出现异常沉淀弧；（3）两种轻链显著不平衡-免疫固定法； （4）单克隆免疫球蛋白、轻链的定量-速率散射比浊法。依据M成分分型：（1）IgG型：约占70%，呈现典型MM临床表现；（2）IgA型：约占23%～27%，有火焰状瘤细胞、高血钙、高胆固醇；（3） IgD型：含量低，不易在电泳中出现，多见于青年人，常出现高血钙、肾功能损害及淀粉样变性；（4）IgM型：本型少见。易发生高粘滞血症或雷诺现象；（5）IgE型：罕见，骨损害少见，易并发浆细胞白血病；M蛋白在血清蛋白电泳上的位置取决于单克隆免疫球蛋白的类型6）轻链型：约占20%，瘤细胞仅合成和分泌单克隆轻链，尿中出现大量B-J蛋白，而血清中检测不到M成分，瘤细胞生长快，病情进展迅速，常有骨损害，较易出现肾功能不全； 7）双克隆或多克隆免疫球蛋白型：约占1%，4、其他检验（1）血钙&血磷正常或&（ 肾功能不全时），血清碱性磷酸酶一般正常或轻度&；（2）血清β2-微球蛋白&、血清乳酸脱氢酶 &，与疾病的严重程度相关；（3）肾功能多项指标可异常；（4）血沉常明显加快；（5）血清IL-6及SIL-6R水平&5、免疫表型：骨髓瘤细胞CD45呈较弱阳性或阴性，多数病例CD19和CD20阴性，但CD38、CD79a和CD138阳性，可检测到单克隆κ或λ轻链，CD56多为阳性表达，但随病情进展，如终末期患者以及浆细胞白血病患者，CD56可为阴性。6、细胞遗传学与分子生物学20%-60%的新病例和60%-70%的进展期病例存在染色体的结构和数量的异常。常见的有8、13、14号染色体、X染色体及13 q14、17p13等部分缺失，3、5、7、9、11、15和19号染色体获得。常见的结构异常涉及1、11、和14号染色体。常见的易位是t（11；14）（q13；q32），与cyclinD1过表达有关。采用PCR技术检测免疫球蛋白重链基因重排可作为单克隆浆细胞恶性增殖的标志，用于与反应性免疫球蛋白增多的鉴别诊断。7、X线检查（1）早期为骨质疏松； （2）典型病变为圆形、边缘清楚如凿 孔样的多个大小不等溶骨性损害； （3）病理性骨折。个别有骨质硬化。 早期可无骨骼X线表现，核素骨显像可较X 线检查提前3～6个月发现骨病变。
【诊断】诊断至少需要一个主要和一个次要标准或三个必须包括（1）和（2）的次要标准。这些标准必须出现在有症状，疾病正在进展的病人。主要标准： （1）&骨髓浆细胞增多（&30%）、（2）&活检示浆细胞瘤、（3）& M蛋白： 血清IgG&3.5g/dl，IgA&2g/dl；尿本-周蛋白&1g/24h次要标准：（1）&&&骨髓浆细胞增生（10%-30%） （2）&&&&M蛋白：出现但少于以上B标准 （3）&&&&溶骨病损 （4）&&&正常免疫球蛋白降低（&正常的30%）： IgG&600mg/dl、IgA&100mg/dl、IgM&50mg/dl
【鉴别诊断】
1、浆细胞白血病：与MM鉴别的主要依据是外周血浆细胞数：当外周血浆细胞占白细胞总数的20％以上或浆细胞绝对值&2&10^9/L时，则为PCL，可为原发或是MM病程终末的一个并发症，更多见于轻链型、IgE型和IgD型。PCL具有MM的大多数表现，溶骨病损和骨痛较少见，淋巴结病及器官增大更常见，肾衰常见。PCL预后较差，生存期短。2、浆细胞瘤：浆细胞瘤是克隆性的浆细胞增生，细胞形态及免疫表型与多发性骨髓瘤相同，不同的是浆细胞瘤表现为骨骼内或骨外孤立性生长。【检验】血象、骨髓象正常。肿瘤组织活检示浆细胞瘤。绝大多数患者血、尿中无M成分，少数患者出现少量M成分，局部治疗后通常都会消失，但骨外浆细胞瘤发生广泛播散时，血和尿中可出现高水平的M成分。当进展为MM时，实验室检验与MM相同。
【诊断】依靠X线、MRI等影象学、肿瘤组织活检、以及血、尿蛋白电泳等可明确诊断。&
3、意义未定的单克隆免疫球蛋白病（MGUS）是一种原发性的单克隆免疫球蛋白血症，其特点是没有恶性浆细胞病或其他相关异常，单克隆免疫球蛋白水平升高有限，一般无临床症状。约25%的患者在随访20年后发展为多发性骨髓瘤及相关疾病。目前认为MGUS是多发性骨髓瘤的前驱病变。【临床表现】多见于中老年，一般无临床症状， M蛋白常在体检或其他无关疾病进行检查时被发现，有些患者因血沉增快而作进一步检查而发现 。【检验】M蛋白多为IgG，其次是IgM、IgA及轻链型。骨髓浆细胞可增多，但少于骨髓有核细胞的10%，形态与正常浆细胞相似，无核仁。
【诊断】（1）&&出现M蛋白，但比骨髓瘤的少 （2）&&骨髓中浆细胞增生&10% （3）&&无溶骨病损 （4） 无骨髓瘤相关性症状本症应与多发性骨髓瘤及其亚型，以及Waldenstr&m巨球蛋白血症、淀粉样变性等其他恶性浆细胞病鉴别，还要与出现于非浆细胞疾患或非淋巴细胞增殖性疾患的继发性单克隆免疫球蛋白血症鉴别。诊断后必须长期随访。&&
BMJ 综述：多发性骨髓瘤最新诊疗进展
多发性骨髓瘤（MM）是第二常见的血液系统肿瘤（占 10%-15%），占血液系统肿瘤死亡人数的 15%-20%。随着对骨髓瘤发病机制的进一步认识，其治疗方法也有了新的进展。虽然骨髓瘤目前仍无法治愈，但目前的治疗方案可显著延长患者生存期，新确诊患者中位生存期可达 5 年左右。本文综述了多发性骨髓瘤的最新诊疗进展。
1. 何谓骨髓瘤？高危人群有哪些？
在骨髓瘤中，骨髓瘤浆细胞在骨髓浸润（图 1）并产生单克隆蛋白，此蛋白在血液或（和）尿液中均可检测到，损伤器官或组织。流行病学研究表明，多发性骨髓瘤发病前会出现机制不明的单克隆免疫球蛋白病（MGUS），这是一种无症状的疾病状态。多发性骨髓瘤多发于老年人（中位年龄 70 岁），任何年龄均可发病，确诊病例中 15% 是 60 岁以下，40 岁以下占 2%。非裔加勒比人多发性骨髓瘤发病率是白人两倍，所有种族群体中，男性发病率比女性高 50%。对于多发性骨髓瘤，目前还没有已知的遗传因素或明确的环境危险因素。
图 1 多发性骨髓瘤患者骨髓活检示大量浆细胞浸润。H-E 染色（左）和抗 CD138 免疫组化染色（右）凸显浆细胞。
2. 涉及哪些病理生理学过程？多发性骨髓瘤发病机制是由 B 淋巴细胞分化为浆细胞过程中遗传基因发生突变。约半数病例发生染色体易位，即癌基因易位到 14 号染色体的免疫球蛋白重链基因（IgH 基因易位），导致癌基因过表达和细胞增殖失控。其他病理特征是细胞具有部分奇数三倍体，即染色体 3、5、7、9、11、15、19 和 21。这些众多三体的表现称为超二倍性。随着研究的不断进展，发现骨髓瘤中也存在一些基因突变，如 RAS 基因突变。因为骨髓瘤细胞增长和存活要依赖骨髓中其他的细胞，比如成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、基质细胞和树突状细胞，故以骨髓微环境为靶标的治疗方法有所进展。
3. 为何导致骨病和高钙血症？骨髓瘤患者骨重建的不平衡是由破骨细胞活性增加与成骨细胞功能降低引起。骨髓瘤细胞能促进破骨细胞激活因子和抑制成骨细胞分化的细胞因子生成增加。未受控制的骨溶解也会引起高钙血症。
4. 为何导致肾功能损害？大多数情况下，恶性浆细胞产生异常蛋白即单克隆免疫球蛋白（大多是 IgG 或 IgA）。多发性骨髓瘤通常不会出现 IgM 异常蛋白，其存在往往提示其他疾病，如华氏巨球蛋白血症。同时浆细胞可以产生数量不等的单克隆游离轻链。在多发性骨髓瘤和 MGUS 患者尿液中可发现轻链，即本周氏蛋白。大约 20% 多发性骨髓瘤患者血清和尿液中出现轻链，而 2% 患者既不产生轻链也不产生异常蛋白，被称为非分泌型。轻链在肾小球滤过、近端小管重吸收。当轻链滤过量超过近端小管重吸收量时，轻链会在远端小管沉淀析出形成管型，造成肾小管阻塞和肾小管间质炎症，导致急性肾损伤。90% 多发性骨髓瘤肾损害是由管型肾病所导致。其他原因包括淀粉样蛋白沉积、脱水、高钙血症、高粘滞血症和服用肾毒性药物，如非甾体类抗炎药。
5. 多发性骨髓瘤有什么症状？常见症状有贫血（75%）、高钙血症（30%）、肾功能损害（25%）和骨病（70%）。骨病临床表现为疼痛性溶骨性病变、椎体粉碎性骨折或长骨骨折（图 2）。脊椎病理性退化性骨折导致脊髓受压，另外，5% 的多发性骨髓瘤患者髓外软组织中出现浆细胞瘤。高钙血症、急性肾功能衰竭和脊髓受压都是急症，及时诊断和治疗对降低器官长期损伤具有重要意义。异常蛋白过高会导致高粘滞血症症状（头痛、鼻出血、视力模糊和意识模糊），同时会引起体液免疫功能下降致复发性细菌感染。30% 确诊病例是通过偶然发现红细胞沉降率、总蛋白或免疫球蛋白增高诊断的。比如嗜睡或背痛等，表现出的症状通常不具特异性而导致诊断延误。近日公布的一份报告显示，56% 患者通常在 6 个多月后才去血液科就诊。三分之一病例是在急诊确诊，未规范治疗，因此这类患者预后较差（一年生存率分别是 51% 和 82%）。
图 2 &X 光片示右肱骨螺旋性骨折。此患者之前身体状况较好，但显示右臂骨折
6. 多发性骨髓瘤如何诊断？表 1 是国际骨髓瘤工作组总结关于多发性骨髓瘤、无症状性多发性骨髓瘤和 MGUS 的诊断标准。MGUS 的诊断标准是浆细胞浸润和异常蛋白浓度较低，同时患者无骨髓瘤一般临床表现，如高钙血症、肾功能不全、贫血或骨病变。每年大约 1% 的 MGUS 患者可发展为多发性骨髓瘤。当浆细胞和单克隆蛋白浓度较高，但没有出现骨髓瘤相关器官或组织损伤情况，即为无症状性多发性骨髓瘤，此类型每年大约有 10% 进展为有症状的多发性骨髓瘤。多克隆免疫球蛋白上升反映急性炎症，而非进展为 MGUS 或多发性骨髓瘤。表 2 总结了考虑确诊多发性骨髓瘤时所需的检查，强调全科医生对患者进行筛查的必要性。临床诊断疑似多发性骨髓瘤，及伴有贫血、肾功能受损、高钙血症、X 线检查示溶骨性病变、检测出异常蛋白或尿本周氏蛋白其中至少 1 项症状的患者应转诊到血液科。
表&1&国际多发性骨髓瘤工作组的诊断标准
症状性多发性骨髓瘤3&项必需的标准诊断：1.&骨髓中单克隆浆细胞&10%（非分泌型患者骨髓中单克隆浆细胞&30%）2.&血清或尿液出现单克隆蛋白3.&有证据表明多发性骨髓瘤相关的器官或组织损害：（1）高钙血症（&10.5&mg/dL（2.6&mmol/L）或正常上限）（2）肾功能不全（血清肌酐＞2&mg/dL（176.8&&mol/L）（3）贫血：血红蛋白&&100&g/L&或者低于正常值下限&20&g/L（4）溶骨性病变、骨质疏松或病理性骨折
无症状性多发性骨髓瘤2&项必需的诊断标准：（1）单克隆蛋白&30&g/L&或骨髓中单克隆浆细胞&10%（2）无骨髓瘤相关器官或组织损害
MGUS必需的诊断：（1）单克隆蛋白&＜30&g/L（2）骨髓单克隆浆细胞＜10%（3）无多发性骨髓瘤相关的器官或组织损害
表&2&诊断多发性骨髓瘤的检查
筛查试验全科医生部分：（1）血常规（2）血清尿素氮和肌酐（3）红细胞沉降率或血浆粘度（4）血清钙和白蛋白测定（5）免疫球蛋白和血清蛋白电泳（6）尿本周氏蛋白测定（7）有症状部位的影像学检查
诊断试验血液医生部分：（1）骨髓穿刺和浆细胞表型检测（2）血清和尿免疫固定电泳（3）血清游离轻链测定（4）骨骼检查
评估肿瘤负荷和预后试验血液医生：（1）骨髓涂片荧光原位杂交分析（2）血清β2&微球蛋白浓度（3）血清白蛋白浓度（4）血清和尿中的单克隆蛋白定量有必要通过 X 平片对骨骼进行检查，包括颅骨、脊柱、胸部、骨盆以及上肢骨来确定骨髓瘤的病变累及范围。磁共振成像（MRI）是影像学检查的金标准，用于检查颈椎病和脊髓受压情况。如果没有 MRI，可用 CT。放射性核素骨显像对于多发性骨髓瘤不起作用，因为其原理是依靠成骨细胞对锝的吸收，但多发性骨髓瘤的成骨细胞通常减少或缺乏。因此，骨髓瘤溶骨性病变在骨扫描中的显示出典型的&冷&区。正电子发射型计算机断层显像（PET）可能在筛查、监测疾病和观察髓外部位有一定的作用，尤其是在非分泌型多发性骨髓瘤。
7. 影响预后的因素有哪些？虽然引进新药已改变了许多患者的命运，但多发性骨髓瘤仍然是一个异质性疾病。一些确诊患者生存期可达 8 年，然而一部分高危患者在 24 个月内死亡。国际分期系统以β2 微球蛋白和血清白蛋白浓度为基础将风险分为三个等级（表 3）。IgH 易位涉及 4 和 16 号染色体分别称为 t（4；14）和 t（14；16），此为高风险因素并与预后差相关。抑癌基因 p53 位于 17 号染色体的短臂或长臂，而 17 号染色体长臂缺失（del17p）与预后不良相关。患者有 t（11；14）或 t（6；14）IgH 基因易位以及超二倍体患者被认为具有标准风险疾病。年龄是一个独立预后因素，同时也影响治疗效果。是否完全缓解影响患者的总生存期。年轻患者采用高剂量化疗方案中位生存期约 7 年。
表&3&国际分期系统Ⅰ期&血清β2&微球蛋白＜3.5&mg/L&和白蛋白&35&g/LⅡ期&介于Ⅰ期和Ⅲ期之间Ⅲ期&血清β2&微球蛋白&5.5&mg/L（无论白蛋白水平）
8. 如何治疗多发性骨髓瘤？MGUS 和无症状多发性骨髓瘤患者通常采取严密临床观察。到目前为止，还未发现有干预措施可延迟或阻止 MGUS 进展为多发性骨髓瘤。无症状性多发性骨髓瘤患者应常规血液科随访。随机对照试验表明，化疗对无症状性多发性骨髓瘤生存率无影响。目前的药物试验主要针对有高风险进展为症状性多发性骨髓瘤的患者。英国血液学标准委员会（BCSH）指南推荐低风险进展为骨髓瘤的 MGUS 患者可在基层医院监测，而高风险患者须在血液科医生的指导下监测病情。（图 3）检测流程示初检测到异常蛋白，包括 MGUS 患者在基层医院随访的频率和何时需要转诊到血液科。
图 3 初检测到异常蛋白的检查流程在过去十年，随着硼替佐米（一种蛋白酶体抑制剂）和沙利度胺、来那度胺（免疫调节剂）（表 4）的出现，多发性骨髓瘤的治疗有了前所未有发展。包含新药的治疗方案是目前治疗多发性骨髓瘤的主要方案，初始治疗可使大部分患者缓解，并可使疾病进入稳定期，从而获得良好的生活质量。由于缺乏有效的治疗，复发是不可避免的，但至少有一半的患者复发后用相同或不同的化疗方案可达到缓解。
表&4&治疗多发性骨髓瘤常用的药物
患者复发后越来越耐药，疾病进入难治终末期，治疗相当困难，有时会伴随髓外表现及全血细胞减少（图 4）。
图 4 骨髓瘤典型的疾病进程。多发性骨髓瘤初始治疗方案的选择取决于年龄和是否有合并症。初始化疗方案的目标是达到完全缓解和最大限度的控制药物毒性，对于年轻（一般年龄＜65 岁）和体质较好患者，需要联合高剂量化疗和自体造血干细胞移植来巩固治疗。老年患者或有其他严重疾病患者，不适合进行自体干细胞移植的只能单纯用化疗。根据异常蛋白或轻链的下降程度对治疗效果分等级如表 5 所示。表 6 列出了治疗方法的主要副作用。
表 5 多发性骨髓瘤的缓解或进展的分类传统上的分类是以异常蛋白减少或者增加的量为基础，但现在也应考虑骨髓浆细胞增生程度、骨病变的进展以及是否存在软组织浆细胞瘤。随着用于检测骨髓中残留的骨髓瘤细胞技术的进步，新的缓解深度得到认可，如严格完全缓解。
完全缓解检测不到异常蛋白和软组织的浆细胞瘤消失和骨髓中浆细胞 & 5%
较好的部分缓解异...
人人移动客户端下载Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis | Protocol (Translated to Chinese)
Automatic Translation
This translation into Chinese was automatically generated through Google Translate. |
&JoVE Medicine
建立一个人类多发性骨髓瘤异种移植模型中的鸡，研究肿瘤的生长，侵袭和血管生成
*1,4, *1,2, 1, 1,3
1Department of Internal Medicine V, Innsbruck Medical University, 2Oncotyrol GmbH, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institute
* These authors contributed equally
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人多发性骨髓瘤（MM）细胞需要间质细胞和细胞外基质成分为存活和增殖的支持性微环境。我们建立了与植入人类骨髓瘤和间质细胞体内鸡胚模型来研究癌症药物对肿瘤的生长，侵袭和血管生成作用。
Date Published: 5/01/2015, ; doi:
Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (99), e52665, doi:10. (2015).
多发性骨髓瘤（MM），恶性浆细胞疾病，无法治愈的和新的药物都需要改善患者的预后。由于缺乏骨微环境和自动/旁分泌生长因子的人的MM细胞不易培养。因此，目前迫切需要建立适当的体外和体内培养系统来研究对人MM细胞新的治疗的作用。这里，我们提出一个模型，以在体外和体内生长的人类多发性骨髓瘤细胞在一个复杂的三维环境。 MM细胞系OPM-2和RPMI-8226被转染以表达该转基因GFP和培养在人类间质细胞和胶原的存在I型基质为三维球状体。此外，球状体接枝在鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和肿瘤生长通过立体声荧光显微镜监测。这两种型号允许新的治疗DRU研究GS在一个复杂的三维环境和肿瘤细胞块移植物在转基因特异性GFP-ELISA均化后进行量化处理。此外，主机和肿瘤细胞的侵袭进入下卧宿主组织的血管生成反应，可以每日通过立体显微镜监测和针对人肿瘤细胞（Ki-67的，CD138，波形蛋白）或宿主壁细胞覆盖血管免疫染色分析（结蛋白/ ASMA）。 总之，onplant系统允许研究在一个复杂的三维环境MM细胞生长和血管生成，使筛选靶向生存MM细胞的增殖和新的治疗的化合物。
根据奥地利法律，美国公共卫生服务禽流胚胎实验室动物福利办公室不被视为活的脊椎动物，直到实验动物福利hatching.The NIH办公室在这方面（HTTP提供了书面指导：// www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm和NIH出版号：06-4515）。
1.细胞培养和慢病毒转染培养的MM细胞系OPM-2，RPMI-8226，并从骨髓在RPMI1640培养基中的人类间质干细胞，补充有在存在10％牛胎儿小牛血清和100IU / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和2mM谷氨酰胺的5％的CO 2在37℃。 转染5×10 6的HEK 293FT细胞病毒包装结构（9微克）的DNA和3微克pLenti6 / V5 dest中eGFP的向量通过使用30微升脂质体转染试剂转染培养基（10毫升）中。 12小时后取出转染中，加入10 mL的DMEM培养基含10％小牛血清和1％非必需氨基酸（NEAA）。
5天后，游泳细胞（1000 XG，5分钟），离心后收集HEK293FT细胞的上清液。通过实时PCR测定病毒滴度为28别处描述。 转染1×10 6个MM细胞与eGFP的慢病毒颗粒（1×10 5个颗粒）在24孔板中的完全生长培养基。 3天后，加入2微克/毫升瘟到培养基开始选择过程。对于市售的eGFP慢病毒，使用500微克/ ml新霉素的。
2周选择后，eGFP的簇表达MM细胞会出现;通过离心（1,000×g离心，5分钟）收集细胞，并扩大其作为OPM-2 的eGFP和RPMI-8226 eGFP的亚系进行实验（第2和3）。
2. 3D-多发性骨髓瘤球体模型寒意胶原I型解决方案和10×DMEM??冰。 混合1/10体积10×DMEM培养基进入胶原基质;添加NaOH水溶液（0.2 N），以中和酸性的胶原溶液以7.4的pH值;店胶原/冰介质溶液。 转基因混合MM细胞系（OPM-2或的eGFP RPMI-8226 绿色荧光蛋白 ; 250,000球体，）与人类间质细胞（50,000个细胞/球体， 即 30微升滴）。 在15ml试管（1000×g离心，5分钟）离心细胞混合物，冷制备胶原混合物（1mL）溶液加入到细胞沉淀拌匀（1,000微升尖）。 立即吸取30微升胶原/细胞混合物（用100μl尖端）在一个24孔板上无菌石蜡薄膜，并允许细胞/胶原混合物在37℃（ 见图1A）聚合30分钟。 覆盖的MM球体用含有1,10和100nM的硼替佐米1mL中培养基（参见图1B）。 之后，在37℃72小时温育的，文件球状体由荧光立体显微镜（ 见图1C）。 通过使用镊子具有宽扁钳口在反应管转移的每个球体的GFP的测量（ 见图1D）。
3. 3D多发性骨髓瘤异种移植模型中的CAM 孵化鸡蛋中为鸟卵的特别培养箱中在37℃和70％湿度下三天。 此后，打开蛋和转移胚胎灭菌用乙醇，方形，10厘米的塑料称量船与细胞培养板盖和孵化“ 前卵 ”用于进一步六天，使得CAM是能够开发（参见图2A）。 寒意胶原I型溶液和10×DMEM在冰上，混合1/10体积10×DMEM培养基到胶原基质，添加氢氧化钠（0.2 N），以中和酸性的胶原溶液以7.4的pH值;店胶原/冰介质溶液。 混合转基因MM细胞系（OPM-2 的eGFP或RPMI-8226 绿色荧光蛋白 ; 250,000球体，）与人类间质细胞（50,000个细胞/球体）。 离心细胞在15ml试管（1000×g离心，5分钟;对于每个试验化合物1小瓶），药物添加1mL中冷制备胶原混合物（在所需的工作浓度）的细胞沉淀并充分混合（1,000微升尖）。 放置胶原滴在6孔颈部30分钟上的封口膜（各30微升），以允许细胞外基质的聚合在37℃。 转移“onplants”来自步骤3.6与使用镊子到CAM的未处理表面（2厘米的距离胚胎）的9日龄鸡胚（4- onplants每个鸡胚，参见图2B） 经过5天的体内生长在蛋孵化器在37℃和70％的湿度，文件异种移植物通过荧光立体显微镜（ 见图2C）。受低温的冰箱5小时安乐死鸡胚胎在4℃。 由眼科剪刀取出移植与下层组织CAM和镊子与宽阔平坦的下颌。它们用于GFP的测量（第4节， 见图2D）或血管和/或侵入的肿瘤细胞（第5）免疫组化分析。 通过ELISA 4.绿色荧光蛋白定量的蛋白质传送每个MM球体或切除异种移植入0.5毫升RIPA缓冲液含有200微克/毫升蛋白酶抑制剂。 均质球体/异种移植物在冰上组织匀浆器。 执行三个冷冻/解冻周期在液氮和37℃水浴中。 离心机匀浆在4℃下20分钟（12,000克）和存储上清液。 稀释样品中的ELISA试剂盒的测定缓冲液（200微升）1:20。测量GFP的水平通过使用生物素化抗GFP抗体商业GFP ELISA试剂盒，根据制造商的协议。
5. Immunohi对血管和入侵肿瘤细胞stochemical分析切除修复与移植CAM面积在4％多聚甲醛O / N在4℃。 放置固定异种移植到嵌入盒，并将它们与增加的梯度醇系（50％，70％，80％，95％的乙醇，二甲苯和石蜡;每个步骤60分钟）转移至组织包埋站。 部异种移植物（5微米）通过使用台式旋转切片机。烘烤在56℃下在载玻片O / N石蜡切片。
Deparaffinize部分由递减梯度酒精串联双蒸水（混合二甲苯，95％，80％，70％，50％的乙醇，双蒸水;每个步骤10分钟）。 在水浴（95℃，20分钟）与抗原修复液进行抗原修复（柠檬酸盐缓冲液; pH值7.0;体积100微升）。 阻断内源性过氧化物酶活性用100μl3％的H 2 O 2 /甲醇30分钟。 在含PBS块段10％胎牛血清45分钟（体积100微升）。 染色1小时，用100μl初级抗体（1微克/毫升）稀释在含有1％胎牛血清在RT PBS中。 洗涤3次在PBS中后，孵育1与生物素化第二抗体（0.1微克/毫升）在含有1％胎牛血清在RT PBS中。 洗涤3次在PBS中后由抗生物素蛋白/生物素复合物（ABC）和二氨基联苯胺（DAB）底物溶液，根据制造商的说明进行显色反应。
5.11。停止反应通过转移部分，以双蒸水，染液用苏木精和安装部分用合成封固剂。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
在目标化合物的3D多发性骨髓瘤球体测定体外分析 由于在体外原代人MM细胞培养的限制，我们建立了新的三维体外培养模型为人类MM细胞系，利用细胞外生长基质和支持原代人骨髓间充质细胞从骨髓的（ 图1A，B）。 EGFP转基因MM细胞系允许可视化和MM肿瘤块的量化的三维生长球状体之后。两个MM细胞系OPM-2 的eGFP和RPMI-8226 的eGFP中培养3天，在增加浓度的硼替佐米和肿瘤（1- 100纳米）的存在下通过GFP的上立体荧光显微镜的表达进行观察（ 图1C） 。肿瘤细胞团由GFP-ELISA（ 图1球体的同质化和测量绿色荧光蛋白含量量化后D）。
在目标化合物的鸡胚中多发性骨髓瘤异种移植物的体内分析 三日龄鸡胚胎中培养前卵 6天，并在用于MM细胞（ 图2A）的接枝天9。 EGFP转基因骨髓瘤细胞（OPM-2 EGFP）与人骨髓间充质细胞嵌入到胶原蛋白I型细胞外基质成分。目标物质的硼替佐米的混合物在1纳摩尔（ 图2B）局部施用。每个动物4“onplants”接枝于鸡胚的绒毛膜尿囊膜（CAM）。经过5天的MM异种移植物形成，可以通过EGFP的表达被可视化的肿瘤。与对照组相比，MM细胞的异种移植物中的硼替佐米抑制生长。移植物显示较少绿色的MM肿瘤细胞块（ 图2C）。从单次移植的MM稀土元素不同的动物（N = 12）切下，均质化之后，由绿色荧光蛋白ELISA测量。在直接比较对照硼替佐米处理的异种移植物有一个显著降低骨髓瘤细胞块（ 图2D）。
在血管生成反应和骨髓瘤侵异种移植在鸡胚体内分析 周围onplants的血管生成反应可通过立体显微镜进行观察。异种移植物的血管形成在药物处理的异种移植物（1纳摩尔Plitidepsin， 图3）中的显著降低。血管生成应答通过如由Ribatti 等人 21所述的用于明胶海绵测定计数血管出芽成onplant量化。 对于入侵分析，异种移植物被切除与相邻的CAM区。异种移植物固定，石蜡包埋和切片制备（ 图4 </STRONG&）。切片用针对ASMA /结蛋白，以检测覆盖鸡血管壁细胞的抗体，并与针对人Ki-67的，波形蛋白和CD138来检测增殖和侵入的人类肿瘤细胞鸡宿主组织中（ 图4）的抗体。
图1. 3D多发性骨髓瘤细胞球体。 OPM-2 的eGFP和RPMI-8226 eGFP的球状体与原代人骨髓间充质细胞和胶原I型作为细胞外基质组分（B）的球体（A）的代培养用培养基和硼替佐米的各浓度（1- 100纳米）。（C）的 MM球状体生长3天并通过立体荧光显微镜拍照。横道500微米。（D）单SPHeroids在裂解缓冲液之后，测定GFP的ELISA分析。单个球体的绿色荧光蛋白的浓度，计算（5例，平均值±SEM）。星号表示P值&0.05;公司=控制; BZB =硼替佐米。
图2.多发性骨髓瘤异种移植模型。 （一）在发育9天前OVO鸡胚胎用于移植实验。（B）OPM-2 EGFP和RPMI-8226 EGFP的混合与原代人骨髓间充质细胞，胶原蛋白I型是细胞外基质成分， 1纳米硼替佐米。后凝固球状体（n = 4时的）被移植对鸡胚的绒毛膜尿囊膜第（℃）5天后的MM移植在CAM可以通过EGFP的表达被可视化。异种移植可以每天通过立体荧光显微镜拍照。横道500微米。（D）的单MM异种移植物被切除与下层的CAM组织，在裂解缓冲液，并在绿色荧光蛋白ELISA测量。单个肿瘤的GFP浓度计算（12例，平均值±SEM）。星号表示P值&0.05; BZB =硼替佐米。
记录在案移植对鸡胚的CAM五天后血管瘤图3.分析。MM异种移植物（OPM-2 EGFP）。相比于对照移植物，treatm耳鼻喉科与plitidepsin（1nMol，N = 10）导致表面上生长的肿瘤是由CAM组织血管少。血管生长到onplants（红色）被计为在血管类型的图形模型描绘。横道1毫米。
骨髓瘤细胞浸润图4.分析。MM异种移植物（OPM-2 EGFP）与下层CAM宿主组织（硼替佐米治疗与控制）的免疫组化分析。增殖人MM细胞染色阳性，Ki-67的，CD138和波形和入侵的细胞群宿主组织。鸡血管沾满壁画细胞标记阿斯玛（大血管和动脉）和结（毛细血管）。 Magnificati200X上，星号表示凸轮的血管。
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的新的治疗剂用于难治性MM的发展需要较少耗时且昂贵的体内系统评估人类MM细胞的对药物的敏感性。迄今为止，只有少数的体内系统可用于新的抗骨髓瘤治疗的临床前评价。他们都有自己的化合物库29的大规模筛选的限制。 目前最好的模型为人类MM细胞是高度免疫缺陷小鼠7,13,30和火鸡胚胎29。既SCID小鼠和禽流胚胎异种移植模型可用于研究的MM的生物学和测试新的治疗的化合物。但是，鼠系统有一些局限性，包括自交系基因型，技术要求高的程序，长周期的观察，成本高。 在这项研究中，一种新的三维球体和禽流异种移植模型，提出研究人类MM细胞生物学，涉及人类MES的存在enchymal干细胞和细胞外基质作为支持部件。 MM细胞强烈地依赖于它们各自的微环境，即间质来源的生长因子，细胞因子和ECM成分的存在下存活和增殖31-33。此外，药物可能是低效或显示改变的活性时的骨髓瘤细胞是由它们的局部微环境31,34的保护。 相较于鼠模型中，所描述的三维体外和体内模型系统并不昂贵，快速，容易处理。此外，3D的MM移植球状体到鸡胚允许骨髓瘤诱导的血管生成的分析。我们的系统的一个限制是MM细胞生长的时间短，因此，转移的分析禽流骨头是不可能的。我们的模型的另一个局限性是我们与药物可能没有反映全身应用和药品营业额/修改肝酶CAM局部应用工作。在此外，约50％的存活率，直到接枝观察由于前卵鸡胚胎的生长条件。关于内皮标志为IHC分析，在人类和小鼠部用于染色的内皮细胞标记物最不特定于血管鸡。因此，我们建议染色壁画细胞标志物结蛋白/ ASMA或凝集素注射到鸡胚35。并不是所有可用人骨髓瘤细胞系将增长到侵入鸡宿主组织并显示肤浅的增长。这将导致损坏的组织切割切片在切片机之后。此外，特别照顾（选择抗生素），应采取转染的细胞没有时间内失去了绿色荧光蛋白转基因表达，由于永久遗传重组或DNA甲基化过程。 总之，人类的MM细胞我们的鸡胚胎移植瘤模型与基质的支持提供了一个可重复和可预测的体内模型STU镝MM细胞生长和血管生成。这说明MM模型可以促进体内的抗MM药物筛选过程更快，有助于缩短开发时间和新药的成本。随着进一步的改进步骤，例如骨替代材料，复杂的ECM基质和细胞因子系统可能用于测试治疗剂还对患者样品得到改善。这是个性化癌症医学和个体难治MM患者药敏试验的先决条件。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
作者有没有竞争经济利益
Catalog Number
RPMI-8226 cells
STR profiled
OPM-2 cells
STR profiled
Human mesenchymal stem cells&
PC-C-12974
HEK293FT cells&
Invitrogen
RPMI1640 Medium
Sigma Aldrich
Fetal Bovine Serum& HyClone
ThermoScientific
SH30070.03
L-Glut- Pen- Strep solution
DMEM Medium
Sigma Life Sciences
Transfection Medium/Opti-MEM&
eGFP lentiviral particles
GeneCopoeia
LPP-EGFP-LV105
Ready to use viral particles
pLenti6/V5Dest6 eGFP vector
Invitrogen
PN 35-1271
from authors
ViralpowerTM packaging mix&
Invitrogen
P/N 35-1275
Transfection reagent/ Lipofectamin 2000
Invitrogen
Blasticidin
Invitrogen
Collagen-Type1& Rat Tail
BD Biosciences
DMEM powder
Life Technologies
plitidepsin
bortezomib
LKT Lab., Inc.
SPF-white hen eggs
Charles River
Fertilized& white Leghorn& chicken eggs
Plastic weighing boats
Art.Nr. 1-1125
for ex-ovo culture
Petridish square (Lids)
for ex-ovo culture
RIPA Buffer (10x)
Cell Signaling
Protease Inhibitor Tablets
11 836 170 001
Complete Mini EDTA-free
Cell Biolabs, Inc.
Histocette II
Ethanol absolut
20,821,321
Roti-Histol
Art.Nr.6640.4
SuperFrost Microscope Slides
R. Langenbrinck&
Labor- u. Medizintechnik
DakoCytomation Wash Buffer 10x
DakoCytomation
Target Retrieval Solution (10x)& pH 6,1
m-a-hu ASMA clone 1A4
m-a-hu CD138 clone MI15
m-a-hu Vimentin clone V9
m-a-hu Desmin clone D33
m-a-hu Ki67& clone MIB-1&&
biotinylated goat- anti-mouse IgG
Vector Laboratories Inc.
Vectastain Elite ABC Kit
Vector Laboratories Inc.
FAST DAB Tablet Set.
Sigma Biochemicals
Mayer&s haemalaun solution
1,092,490,500
Roti Histokitt
Art.Nr.6638.2
Bench top rotary microtome
Thermo Electron, Shandon Finesse ME+
Tissue embedding station
Leica, TP1020
Egg-Incubator
Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light&
Olympus, SZX10
Ultra Turrax&
Homogenizer
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