提高免疫组化染色质量的相关处理和操作
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提高免疫组化染色质量的相关处理和操作
& & && 恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是［1］决定染色成败的内部因素。在组织细胞准备过程中，不仅要求保持组织细胞形态的完整，更需要保持组织或细胞内的抗原，使之不受损失或弥散，防止组织自溶。很显然，在一张组织或细胞已坏死、抗原已丢失的材料上，再好的技术和抗体也难以成功染色。本文就组织标本及时取材、固定、组织脱水和包埋、切片以及免疫组化规范操作等过程进行分析与讨论，旨在与技术人员一起学习交流，以提高免疫组化染色的质量，为病理诊断提供有力保证。1 组织标本及时取材1.1 组织标本&& & & & 包括实验动物标本、活组织检查标本、手术切除标本和尸体解剖标本等。一般常用者为实验动物标本、活组织检查标本和手术切除标本。组织块大小以2cm × 1.5cm × 0.3 cm为宜。1.2 取材原则&& & & & 取材器械如刀、剪、钳，刃口必须锐利，以免组织因受压而变形。取材部位应是主要病变区及病灶与正常组织交界处。取材前先除去表面坏死组织并防止组织干涸，一旦组织干涸，则无论怎样取材也不能获得满意的染色效果。另取远离病灶的正常组织作对照。用作石蜡包埋的组织厚度不宜超过0.3cm，用作冷冻切片的组织厚度以 0.3～ 0.4cm 为宜。取材操作要准确、快速。取材后应立即固定组织( 固定液量应大于组织体积 20 倍以上) 或制成冷冻切片。新鲜组织若不能立即制作，可贮存于液氮内或－70 ℃ 冰箱内。2 固定& & & & 组织或细胞固定的目的是使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外源性或内源性酶的反应，防止细胞自溶，以保持组织细胞的固有形态和结构，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，防止抗原的丢失或弥散。因此，标本应尽可能保持新鲜并及时进行固定。由于抗原的稳定性不同，所选固定剂的种类、固定时间及温度都应注意。常用的固定剂通过两种途径固定抗原，即交联性固定和蛋白沉淀性固定。常用的交联性固定剂是甲醛和戊二醛。应用此种固定剂，组织收缩小，但渗透较慢，且因交联而使抗原遮蔽，并可造成某些抗原成分的破坏和丢失。蛋白沉淀性固定剂的代表是乙醇，乙醇能较好地保存酶、肽类等组织抗原。虽然乙醇易使组织收缩变形，但对免疫组织化学来说，仍不失为一种较好的固定剂。类似的固定剂还有甲醇和丙酮。2.1 固定液2.1.1 甲醛固定液 & & & & 常规的福尔马林固定可以检测多种抗原。由于保存的福尔马林常发生酸化，因此用 0.01 mol/L磷酸缓冲液( PBS) 稀释成 10% 福尔马林液( pH 7. 4) 常获得较好的效果。现代的免疫组化方法极为敏感，尽管有的抗原在染色前已丢失很多，但还能被较好的显示出来。醛类固定剂的交联作用，常形成抗原的遮蔽。用蛋白酶消化处理，以打断分子间的交联，使抗原暴露出来，从而明显改善了免疫组化的染色效果。不同的抗原成分对固定剂有不同的要求，因此应针对性地选择固定剂及固定条件。2.1.2 丙酮&丙酮的组织渗透性和脱水性较强，常用于冷冻切片或细胞涂片的后固定，以冷丙酮(4 ℃) 固定 5～15min，取出自然干燥后，贮存于低温冰箱内备用，可以较好地保存抗原，尤其是对一些较脆弱的抗原。2.1.3 乙醇&因纯乙醇的穿透力差，选用 95% 的浓度室温固定。由于抗原性保存较好，亦可用于组织或细胞的固定。2.1.4 4%多聚甲醛磷酸缓冲液&多聚甲醛40g，0.01 mol/L PBS，pH 7.4，1 000 ml，60 ℃ 混合加热至两者全溶。注意温度勿过高，以免甲醛蒸汽逸出。2.1.5 戊二醛—甲醛液2.5%戊二醛1ml，浓甲醛10 ml，蒸馏水加至100ml。2.1.6 醋酸—甲醛液40%甲醛液10 ml，冰乙酸3ml，加生理盐水至100ml。2.1.7 Bouin液 苦味酸 75ml饱和液，福尔马林25ml，冰乙酸5ml。此液的组织穿透力较强而收缩性较小，为免疫组化常用固定液之一。2.1.8 Carnoy液 无水或100%乙醇60ml，氯仿30ml，冰乙酸10 ml，混合后4 ℃保存备用。2.1.9 三聚乙醛液&三聚乙醛1g液溶于0.072 mol/L( pH 7.5)二甲胂酸钠缓冲液100 ml，另加蔗糖0.72g，于60 ℃ 充分搅拌溶解。此液常用于免疫荧光标记。2.2 固定方法2.2.1 浸入法&将取材组织立即浸泡在固定液内，必要时可在低温(4℃) 固定，固定时间一般在2 ～ 12 h。2.2.2 灌注法&适用于实验动物研究。用插管由左心室插入主动脉，先用 PBS 冲洗血液，再以泵或吊瓶灌注固定液(若取脑组织于4 ℃灌注更好) 。灌注量按动物大小而定。一般在灌注后30 min内取材，所取组织再置同一固定液内浸入固定 1 ～ 3 h。灌注法可使固定液迅速到达全身各处组织，以达到充分固定的目的。2.2.3 微波固定 此法依据微波处理后，标本温度升高，分子运动加快，促进固定液向组织内渗透，短时间达到固定效果。可采用家用微波炉，将标本材料放入5～10ml 固定液内，置于炉内旋转台周边，中央放一烧杯盛300～500ml纯水或加少量冰块以吸收炉内产生的热量，选择强档照射10～30s，照后固定液温度≤50 ℃ 。取出后，在相同固定液内再固定 2 ～ 6 h( 室温) 。3 组织脱水和包埋3．1 脱水、包埋程序&& & & & 用于免疫组化的石蜡包埋与常规石蜡包埋的要求稍有不同: 脱水、透明等过程应在室温下进行，尽量减少组织抗原的损失。组织块大小以 2cm×1.5cm ×0.3cm 为宜。浸蜡和包埋的石蜡应控制在 65 ℃ 或 65 ℃ 以下。组织块脱水、透明、浸蜡时间推荐如下:&(1) 固定程序 2道 固定液为 10% 中性缓冲甲醛液，时间为 45 min，设置加温50℃ ，加压，搅拌。(2) 脱水程序 8道 前4道为95%乙醇，后4道为100%乙醇，时间均为60 min，仅在最后1道的95% 和 100% 乙醇设置加压，搅拌。(3) 透明程序2道 第1道为硬脂酸和石蜡，比例为 3∶2，第2道为硬脂酸和石蜡，比例为 2∶3，时间均为60 min，均设置加温65 ℃ ，加压，搅拌。(4) 浸蜡程序 2 道 均为 56 ～ 58 ℃ 纯蜡，时间均为 60 min，设置加温 65 ℃ ，加压，搅拌。3.2 包埋方法3.2.1 石蜡包埋 以熔点低的软蜡包埋(即低温石蜡包埋) 为好。3.2.2 冷冻干燥包埋法 & & & & 此法原理是将新鲜组织块低温速冻，利用真空去除组织内所有的水分，使石蜡直接浸入组织制成蜡块。此法可保存组织内可溶性抗原，防止蛋白变性和酶失活，用于免疫荧光标记、免疫酶标记和放射自显影。3.2.3 塑料包埋法 & & & & 采用乙二醇甲基丙烯酸酯或环氧树脂( Epon 812 或 618) 包埋，其切片可同时作光镜及电镜检测抗原，定位准确。4 切片4.1 载玻片和盖玻片的处理4.1.1 清洗&& & & & 由于免疫组化染色周期较长，且要经过多次孵育和漂洗，有时还需要蛋白酶的消化，因此如果载玻片不经适当处理，切片常会逐步脱失，甚至完全脱落，导致染色失败。常用的处理方法是将载玻片或盖玻片用洗衣粉浸泡4h，流水漂洗 4 h，蒸馏水冲洗控干。4.1.2 涂粘片剂&& & & & 经过处理的载玻片，还需涂抹粘片剂，以防脱片。常用的粘片剂有:&①多聚赖氨酸 取多聚赖氨酸(poly-L-lysine PLL，相对分子质量大于 7.0×104 ) 0.5g 加蒸馏水 50 ml 制成，4 ℃ 保存。使用前加蒸馏水(1∶10) 稀释，放入载玻片浸泡 5 min，60 ℃ 烤箱烘干 1 h 或室温过夜干燥后备用。② 3-氨丙基三乙氧基硅烷 ( 3-aminopropyltriethox-ysilane，APES) 取 APES 制成 1 ∶ 50 丙酮溶液，现用现配。将洁净载玻片放入，20～ 30s 取出，稍停，用纯丙酮或蒸馏水涮去未黏附的APES，置通风橱晾干即可。以上方法以多聚赖氨酸常用，粘片效果较好，但价格较贵，宜单面推涂。4.2 石蜡切片&& & & & 免疫组化的切片常来自蜡块，石蜡切片质量的好坏，直接影响染色的效果。石蜡切片的组织结构保存良好，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致，应用范围广，切片厚度 2～7μm，还可制备连续切片，是免疫组化常用的制片技术。所制的蜡片或蜡带，由上述制备的载玻片捞取后，置37 ℃ 温箱内过夜，可减少脱片。若长期保存，可置 4 ℃ 冰箱内。& & & & 以低温石蜡(56 ℃) 包埋的组织块，用锋利的切片刀或一次性切片刀切出没有刀痕、均匀的薄片最为理想。裱片时应注意将组织片贴附于粘片剂处，切忌皱折和裂口。因皱折和裂口处常造成非特异性着色。裱好的切片应竖直放置片刻、沥干水分，而后置于56 ℃ 温箱中烘烤24 h，即可染色。4.3 冷冻切片 & & & & 冷冻切片的最大优点是能够保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原。为避免在制备冷冻切片时的冰晶形成，必须使组织温度骤降，可采用液氮速冻方法。将组织放置软塑料瓶盖(或事先用 OCT 包埋浸没组织) 内，再把装有组织的瓶盖缓缓投入液氮内 10～20 s，取出置于 －70 ℃ 冰箱贮存或置入恒冷箱内切片。切片最好采用恒冷箱切片机进行切片。切片机置于 －30 ℃ 低温密室内，不受环境温度变化的影响，切片时低温，室内温度以 －18～－15 ℃为宜。切片薄达 4～6μm 而且可制连续切片。& & & & 冷冻切片或细胞学标本，经空气干燥后，置冷丙酮 (4 ℃) 中固定 10 min 后，即可染色。5 免疫组化规范操作& & & & 免疫组化是一个多步骤、多条件的复杂过程，每一步骤都会影响最终的结果。因每一步骤都有其特定的条件，应严格按照特定的条件进行操作。对结果影响较大的因素主要［2］为是否进行热修复和抗体的问题。5.1 &修复的问题&& & & & 关于抗原是否修复，存在着不同的意见。欧洲专家一致认为不能进行，以免产生假阳性，而美国学者的意见是需要进行，中国专家组推荐可以进行修复。如CD117 ，采用 EnVision 两步法，柠檬酸缓冲液( pH 6.0) ，使用高压锅进行免疫组化热修复。具体的操作程序: 将切片放在金属架上(不宜太密) ; 高压锅加入 0.01 mol/L 枸橼酸钠缓冲液 3 L，煮沸; 金属架放在枸橼酸钠缓冲液内，加盖，加压 1～5 自来水浴冷却高压锅;自来水洗，Tris 缓冲液冲洗。5.2 抗体的问题&& & & & &免疫组化一般多选用单克隆抗体，单克隆抗体的效果好于多克隆抗体。抗体的效能，工作液使用方便，但是长时间放置后效能降低。5.3 免疫组化染色分析5.3.1 染色的结果&& & & & 一般可分为两类: 无色片(即无阳性信号) 和“杂音”染色片(有阳性信号) 。免疫组化阴性情况，即染色结束后，切片中无任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这样的情况有两种可能: 真阴性的结果和假阴性的结果。5.3.2 真阴性的结果&整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。5.3.3 假阴性的结果 & & & & 即此阴性结果不是真实的反映。切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。染色过程中的某一或某些环节出现问题。比如，组织未进行抗原修复，因为有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达; 选用了只能用于冷冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程。但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和( 或) 已超过有效期是主要的原因。5.3.4 解决阴性染色的措施 & & & & 在免疫组化操作过程中设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。通过观察组织的内对照，也可以进行判断。如 CD117 ，可以从肥大细胞的染色情况来判断是免疫组化过程中出了问题还是本身组织就不表达CD117。因为正常的肥大细胞可以表达CD117，主要在细胞膜或胞质表达。参考文献:［1］王伯沄，李玉松，黄高昇，等． 病理学技术［M］． 北京: 人民卫生出版社， － 66．［2］吴秉铨，刘彦仿，主编． 免疫组织化学病理诊断［M］． 北京: 科学技术出版社，2007: 15 － 22．温馨提示本文来源：临床与实验病理学杂志
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IHC免疫组化
上海尔湾生物技术有限公司技术服务之免疫组化
◇技术简介
免疫组化以抗原抗体特异性结合的免疫学原理为基础，通过化学显色方法使标记的第二抗体（通常为HRP辣根过氧化物酶）显色，从而特异的显示出与其结合的第一抗体识别的抗原。方便对该抗原做进一步的定性，半定量等研究工作。
◇服务内容及周期
石蜡切片的免疫组化：
费用（报价）
骨样品需脱钙处理
将组织脱水浸蜡
2-5个工作日
将样本切片烘烤
1-2个工作日
抗体孵育 DAB显色
1-2个工作日
抗体孵育 DAB显色
3-5个工作日
50/片/抗体指标
显微镜拍摄显微图像
1-2个工作日
分析阳性区域与强度
2-3个工作日
实验报告与说明
1-2个工作日
冰冻切片的免疫组化：
费用（报价）
新鲜组织冰冻切片
2-3个工作日
抗体孵育 DAB显色
1-2个工作日
抗体孵育 DAB显色
3-5个工作日
显微镜拍摄显微图像
1-2个工作日
分析阳性区域与强度
2-3个工作日
实验报告与说明
1-2个工作日
细胞爬片免疫组化：
费用（报价）
复苏 传代细胞
3-5个工作日
800/株细胞
2-3个工作日
抗体孵育 DAB显色
2-3个工作日
抗体孵育 DAB显色
2-3个工作日
显微镜拍摄显微图像
1-2个工作日
分析阳性区域与强度
2-3个工作日
实验报告与说明
1-2个工作日
◇客户需提供的实验资料
石蜡切片，固定液固定的新鲜取材的组织样品或制作好的蜡块；冰冻切片，新鲜组织样品或固定液固定的样品；细胞爬片，细胞株或客户自己爬好的经过固定液固定的片子。其它如血液涂片，组织液等情况请来电咨询。
需检测的目的蛋白第一抗体，或由我公司代客户查询与购买。
阳性对照样品。（尽量提供）
相关文献与参考资料。（尽量提供）
◇返回给客户的实验结果与实验材料
1.& 预实验玻片。
2.& 正式实验玻片，拍摄的显微照片。（可选）
3.& 数据分析（可选），完整实验报告。
4.& 制作好的样品蜡块，剩余的抗体与说明书等实验材料。
◇注意事项与说明
1. 实验说明：表格中的服务内容，客户可以根据自身需要选择部分或全部；每张玻片原则上只放一个组织切片，需同一张片子上放连续切片2张或多张的实验前请告知；客户在提供寄送样本的同时需要说明样本的切片方向以及所要观察的组织结构；显微拍摄照片，请说明拍照所需要拍摄的显微倍数与张数（即视野数），以及拍摄组织的细胞种类，组织区域等；预实验结束后，经客户确认，进行正式实验；
2. 样品要求：
小型动物标本需经灌注取材；组织样本不宜过大，表面积以1平方厘米大小，厚度以5毫米厚为宜，小于米粒大的组织，无法制作蜡块；固定时间根据组织种类和大小有所不同，但不宜超过72小时，若固定72小时之后无法寄送样本的可以将样本转移至75%乙醇溶液中4度保存。
冰冻切片的样本，准备冰冻切片的组织，灌注与固定方式与石蜡包埋样本相同，亦可不经灌注动物与固定直接寄送新鲜冷冻样品，冰冻切片后再固定。
寄送样本时，请将样本转移至2-5ml离心管中，加满固定液，盖紧盖子。如有条件请使用封口膜封口，以免运输过程中，离心盖打开或脱落，液体和标本溢出。冰冻切片的新鲜样品如未固定请使用干冰运输，本公司提供干冰运输费用。细胞株寄送时，请复苏细胞，培养瓶加满培养液，加5%血清，封口膜封口，常温寄送，夏季高温寄送时，可加冰袋，但冰袋不可与培养瓶直接接触，也可以用干冰直接寄送冷冻的细胞株。其它如血液样品，组织液样品寄送时，请提前咨询技术支持。
请随样本附上样本的清单以及其它必要的实验材料说明，方便接受人员清点接收。
3. 抗体要求：客户购买抗体请尽量购买文献中成功使用的抗体品牌与货号，选购抗体注意查看抗体使用的范围与种属，本公司可代客户选购实验成功率较高的抗体。本公司抗体库中有的抗体，可为客户免费使用，详情请咨询客服。
◇联系我们
咨询电话：135-&&&&&&&&&&&&&&&&&&
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常规石蜡切片制作
石蜡制片技术是利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成切片的病理实验技术。是病理实验技术的核心内容，常规染色、特殊染色、酶组织化学显示、免疫组织化学染色及原位杂交技术等都离不开制片技术。病理教学、科研、临床活检、尸体剖验等都是建立在石蜡组织制片和常规染色的基础上，它也是组织学、胚胎学、生物学、动物学等科学研究观察组织细胞形态结构变化的主要方法。石蜡切片制作的主要过程有：取材→固定→洗涤→脱水→透明→浸腊→包埋→切片→染色→封固。一般需约24h。利用全自动脱水机和包埋机可实现石蜡切片的自动化、程序化操作，大大提高制片效率。&
（一） 洗涤
洗涤是组织固定后把渗入组织中的固定液洗去，以利于脱水及透明，并防止染色中福尔马林色素产生。&
1.一般洗涤法一般常规固定液（10%福尔马林液）可用流水冲洗，冲洗时间基本根据固定时间长短而定，尸检组织、大动物组织冲洗时间为24h左右，小动物组织冲洗为2-10h。&
2.特殊洗涤法固定液为乙醇或乙醇混合液固定者，一般不要求冲洗，如需冲洗必须用与固定液中的乙醇浓度相近的乙醇冲洗，不可用水或浓度相差很大的乙醇冲洗。含有苦味酸固定的组织，可用50%或70%乙醇浸洗。用氯化汞固定的组织常有一种结晶状或不规则块状沉淀物生成，该物必须洗掉，否则会使组织发脆，或染色不良。脱汞的方法是：用0.5%碘酒溶液（70%乙醇配制）逐渐反复加入70%乙醇中，直至加入的碘呈黄色为止，最后用硫代硫酸钠洗去，或用70%乙醇洗去碘。&
（二） 脱水
脱水就是利用脱水剂置换及完全除去组织内的水分，以利于透明及浸蜡。由于脱水剂穿透组织的速度很快，可以使组织再次发生一定的硬化变脆及过度收缩，因此必须从低浓度开始，依次递增，直至纯脱水剂，最后组织内水分为高浓度脱水剂所取代，故也称为梯度脱水。&
常用的脱水剂有:&
1.乙醇（alcohol，酒精） 是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，乙醇的脱水能力比较强，又能硬化组织，但容易使组织收缩及硬化变脆（尤其是高浓度乙醇）。因此在以乙醇作为脱水剂时，应该先从浓度较低的乙醇开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。大多数组织标本可以从70％乙醇开始，再经80％，95％以至无水乙醇。 对一些经水溶性固定剂固定的柔软组织如眼球，胚胎组织、神经组织等需要慢慢脱水，从50％乙醇开始。有时为了某种特殊要求，如要做糖原的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为防止糖原和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水乙醇中固定，而不需要经过水洗和低浓度乙醇的脱水过程。一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水乙醇的脱水程序，即可达到脱水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％乙醇，两次100％乙醇重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。脱水时间应视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同而异。如脱钙的骨组织，实质性脏器等的脱水过程宜短，而疏松结缔组织，脂肪组织等，脱水过程则宜适当延长。&
乙醇脱水的基本原则：从低浓度开始逐渐升到高浓度，以保持组织中的水分完全脱净。一般1cmX1cmX0.2cm大小的组织,脱水全过程仅需要数小时即可完成。在各级浓度乙醇内处理的最短时间分别减少到2—4h也能获得满意的结果。如果组织脱水不尽，随后的透明、浸蜡都会受到影响，致使切片很难完成。外检标本的制作，目前都采用快速脱水的方法。科研标本、教学标本的脱水时间比较长，其目的在于更充分脱水，并适当加强了组织的硬度。&
2.丙酮(Acetone)可用作固定液，也是一种比较好的脱水剂，可配制不同浓度进行脱水。脱水作用比乙醇强、速度快,但容易使组织过度硬化，所以应适当掌握脱水时间。丙酮价格较高，一般情况下，多用在无水酒精的补充脱水或快速脱水，一般组织脱水少用。&
3.叔丁醇(tertiary Buty alcohol)无毒,可与水、乙醇、二甲苯等混合,而且也能溶解石蜡,因此叔丁醇不仅可以替代乙醇使组织脱水,还可以代替二甲苯使组织透明。平常在稀释时都与乙醇按照一定比例配制使用或单用,优于正丁醇，不会使组织收缩和变硬，不必经过透明剂直接浸蜡。&
脱水后组织中水分被透明剂所代替称透明。常用的脱水剂如乙醇等不能溶解石蜡与之相混合，因此在浸蜡之前必须使用一种既可以同乙醇又能同石蜡相混合的媒剂，以便使石蜡渗入到组织中去，当组织中全部为媒剂取代时，光线可以透过，组织呈现不同程度的透明状态，此现象就称透明，所用媒剂为透明剂。实质上透明仅是一种过程而非目的，其所以出现透明现象是因其折光系数改变的缘故。组织一旦呈现透明状态，说明脱水剂已被媒剂所取代，就可以将组织浸入溶解的石蜡进行浸蜡。透明剂很多，常用的有：二甲苯，苯，甲苯，氯仿，香柏油等。&
1.二甲苯（xylene） 是最为常用的一种透明剂，易挥发、无色透亮液体，长期接触对呼吸道黏膜有刺激作用，它能与乙醇，丙酮相混合，又是石蜡的溶剂。在透明过程中，能使组织发生硬化、收缩、变脆，且作用迅速，因此，组织在二甲苯中时间不宜过长，一般是达到组织的透明为止，一般需0.5-1h。&
2.甲苯（toluene）性质同二甲苯，优点是对组织块收缩较小，但透明较慢，一般需60h左右，也易变脆。有时用以代替二甲苯。&
3.苯（benzene） 与二甲苯相似，它较甲苯和二甲苯的作用稍缓，对组织收缩较少，不易变脆，一般需60h左右，但苯较二甲苯毒性大，挥发快，易燃，吸入能引起中毒，故应注意安全使用。&
4.氯仿(chlorofoem)即三氯甲烷。也是一种很好的透明剂，它的作用缓和，透明能力比二甲苯、苯差，透明时间12-24h，组织在此液内不易变硬变脆，这一点较苯，二甲苯和甲苯优良。但氯仿比重较大，折光率较小，组织在氯仿中不易呈现二甲苯那样的透明现象，所以组织要比实际需要浸渍更长一些时间保证完全渗透和置换出酒精。&
5.TO型生物制片透明剂是近年来针对二甲苯挥发性大，对人体有害而研制的一种替代透明剂，认为TO的优点是无毒，对组织软硬适中，收缩性小，制片后染色效果好。&
透明时间的长短因组织的大小而异。例如脑组织和有血块的组织，应缩短在二甲苯内留置时间，而一些肌肉组织和胃肠组织则应该稍延长在二甲苯内留置时间，最好先投入乙醇和透明剂等量混合液半小时，再入透明剂，并更换一次透明剂，待组织完全透明后进行浸蜡，一般需要0.5h至2-3h。 脂肪组织由于其结构不同透明最快，但是这并不能说明组织中脱水剂已完全被透明剂取代，因脂肪组织本身折光率与透明剂（二甲苯）相近，所以应在透明剂中多浸一段时间使脂肪组织尽可能为透明剂所溶解，才有利于石蜡的侵入。&
（四）浸腊
组织经透明后，移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这一过程叫浸蜡。其目的是以石蜡置换出组织中的二甲苯，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块，以便切成薄片。浸蜡的方法是将组织块经过二甲苯透明后，立即投入到溶化的石蜡中去，浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡（石蜡1、2、3），使剩余透明剂完全去除。&
石蜡根据熔点不同分软蜡和硬蜡，软蜡熔点低，硬蜡熔点高，一般切片所有软蜡的熔点为42－45℃，45－50℃，硬蜡熔点为52－54℃，56－60℃，现在也有62－64℃的硬蜡。使用时应根据组织类型以及制片时的温度和气候而异。夏季采用高熔点的石蜡，冬季则采用低熔点的石蜡。 组织较硬时，用硬蜡，反之，用软蜡。浸蜡需要能够保持于54－60℃温箱内进行，一般箱内温度略高于石蜡解点2－3℃即可。&
组织浸蜡时间也应视组织种类大小和结构不同而异，基本上与组织固定时间成正比。也要考虑组织的种类，骨、皮肤和中枢神经系统等致密组织要比软组织如肝肾等需要加倍时间；含血多的组织，肌肉和纤维束在蜡内易过硬而发脆，故浸蜡时间应缩短；疏松组织，脂肪，消化道组织等浸蜡时间可以适当延长一些。为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。以熔点较低的软石蜡作为第一步（石蜡1），然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步（石蜡2），第三步(石蜡3)。浸蜡时间1－4h，或更长。&
（五）包埋
包埋是组织经过固定、脱水、透明、浸蜡后，再用石蜡铸成蜡块的过程。包埋用的石蜡温度要稍高于浸蜡的温度。石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，它有许多优点，操作简易便于掌握，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存。&
1.石蜡包埋方法先准备好一次性塑料包埋盒（或L型金属包埋框和包埋底板）、冷凝用的水缸、酒精灯、镊子等，将熔蜡倾入一次性塑料包埋盒（或L型金属包埋框和包埋底板）内，迅速用加温镊子镊取组织块平放入包埋框底部，一般切面朝下置入框底并轻轻压平，待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却均匀凝固，否则蜡内常形成结晶致切片破碎。待石蜡块完全凝固变硬后，除去金属包埋框，取出蜡块，修切边缘部多余的石蜡，准备制成切片或储藏备用。&
2.石蜡包埋的注意事项&
(1)包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求在60℃左右。&
(2)包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬、变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。&
(3)包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压； 管状、囊壁、皮肤及消化道等组织应竖埋，不要卷曲；相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致；多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。&
(4)石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中，加速冷却可增加石蜡密度、韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。&
3.常规石蜡切片组织处理程序&
(1)组织取材2mm厚度，固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数小时。&
(2)组织流水冲洗6－12h。&
(3)70％乙醇2-4h。&
(4)85％乙醇2-4h。&
(5)95％乙醇（Ⅰ）2-4h。&
(6)95％乙醇（Ⅱ）1-2h。&
(7)100％乙醇（Ⅰ）1-2h。&
(8)100％乙醇（Ⅱ）1-2h。&
(9)二甲苯（Ⅰ）0.5-1h。&
(10)二甲苯（Ⅱ）1h左右。&
(11)浸蜡（Ⅰ）1-2h。&
(12)浸蜡（Ⅱ）2-4h。&
（13） 组织包埋。&
（六）切片
优良的切片技术取决于所有器械的透彻了解和丰富的实践经验,实验工作的每一方面都需熟练的技巧，这只有靠实践才能获得。经良好训练和实践的技术工作者能在很短时间内制出第一流的切片。&
1.切片机切片机是切制薄而均匀组织片的机械，组织用坚硬的石蜡支持，每切一次借切片厚度器自动向前（向刀的方向）推进所需距离，厚度器的梯度通常为1μm。切片机的基本类型按结构分五种：①摇动式切片机，②轮转式切片机，③滑动式切片机，④推动式（雪橇式）切片机，⑤冰冻切片机。最常用的是轮转式切片机。&
轮转式切片机：系借转动手摇轮进行切片动作。 通常用于石蜡切片，该机用途广，可连续切片，使用方便，速度快，切片刀是固定的，目前使用一次性刀片，不需磨刀。轮转式切片机是靠旋转一个重轮，带动螺纹轴或齿轮，将组织夹具向前推进，并在上下平面摆动，推动的距离靠一个有刻度的调节器控制。夹具（安装组织固定台）每上下摆动一次，即向前推进此调节器，可控制组织块按需要的调节刻度（μm）。调节切片厚度的装置刻有1-25或1-40等数字，每个数字代表一个μm，可根据需要随意调节。&
2.石蜡切片操作将预先冷却的组织蜡块装在切片机固定器上的夹座内，注意蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行。根据需要调整切片厚度标尺，一般4-6μm，摇动切片机手轮先进行修整切片，修出组织切面后，再进行切制。实践中可用右手均匀转动切片机手轮，左手用毛笔托起蜡片，协调地进行切片操作，切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，尽可能将切片带拉直展开，用毛笔将切片带从刀口向上挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于展片箱（40℃左右热水）水面上。待切片充分摊开展平后，手持清洗好的以涂有蛋白甘油面的载玻片之一端，投向水中去附贴切片，待切片被接引附贴于载玻片上后，再移至玻片上的1/2处，如组织较小，可在玻片上多贴几片或几排，但排列应密集、整齐，用铅笔在玻片一端的毛玻璃上写上标本编号，字要写得小而清楚、端正。切片附贴后，放在空气中稍晾干，即可进行烤片（60℃的温箱中烤30-60min）。血块组织、皮肤组织须及时烤片，但对脑组织及较大组织待完全晾干后，才能进行烤片。&
3.切片的注意事项&
(1)切片质量的好坏，除与技术熟练程度和切片机的好坏有关外，切片刀是决定的因素，所以刀一定要十分锋利，否则在切片时会自行卷起或皱起，或将组织划伤出现刀痕，更不能将切片切成连续地长条带状。切片刀如有缺口存在，将使制成的切片断裂、破碎，不完整。&
(2)切片机的各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动。在每次更换蜡块时，应习惯地检查一下组织块是否夹紧，切片刀是否稳固，稍有疏忽就会影响切片质量，甚至将蜡块全部切坏，造成不可弥补的后果。&
(3)在摇动切片机时，用力要求均匀一致，不宜过重过猛，否则可因用力过重而使机身震动，造成切片厚薄不均。遇有硬化过度的脑、肝、脾等组织时，更应该轻轻切削，以防组织由于震动形成空洞现象。&
(4)石蜡过软或室温过高，切片易粘与切片刀上，应使用冰块冷却，这样不仅可保持石蜡的硬度，同时也减少切片的褶皱。反之，石蜡过硬或室温过低，可在蜡块切面上哈气加温。&
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