关于免疫组化DAB染色(免疫组化,显色) - 动物实验 - 生物秀
标题: 关于免疫组化DAB染色(免疫组化,显色)
摘要: [关于免疫组化DAB染色(免疫组化,显色)] 我想请教大家一些关于免疫组化的问题，DAB显色怎么在镜下控制？而且DAB见光易分解，是不是片子最后做完必须立即在显微镜下观察？我用DAB显色15分钟颜色都不是很深，是不是DAB已经过期没什么效果了？那个DAB是07年的。 关键词:[免疫组化 显色]……
我想请教大家一些关于免疫组化的问题，DAB显色怎么在镜下控制？而且DAB见光易分解，是不是片子最后做完必须立即在显微镜下观察？我用DAB显色15分钟颜色都不是很深，是不是DAB已经过期没什么效果了？那个DAB是07年的。
回复有钱人，抗体在你面前就是水回复我不懂你的意思~能不能说明白点啊？回复我最多染30秒，你看一下你用的DAB的说明书，应该过期了回复你得先摸索一抗的稀释浓度 有可能一抗的浓度低了 还要注意抗原修复方法的选择 AR加热还是酶消化，二抗 是否选对，然后DAB配制有无问题 （我们实验室是这样：1.DW 150ml 2.DAB Tab 3T 3.待其溶解后加入H2O2 150ul ,即浓度为30 mg/ml, 含有0.03% H2O 2）
在镜下观察的时候要迅速 防止切片干燥！
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电话：021-免疫组化诊断不仅仅是棕色显色
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免疫组化诊断不仅仅是棕色显色
来源：91360智慧病理网——沈勤根据2016年福州会议陈国璋教授讲稿编译，未经授权，不得转载。一、免疫组化显色的解释1.阳性或者阴性均有重要意义。2.染色定位对于评判真假阳性同样重要；有些抗体/蛋白（如P120 catenin，β-catenin）着色部位改变提示特定的病理意义。二、免疫组化染色模式可提供额外线索　　一些免疫染色，着色的特定分布可为诊断提供额外的线索和标准，如：胞浆含量、细胞形态、阳性细胞分布或排列方式、阳性细胞比率、阳性着色强度。三、Cytokeratin1.显示肿瘤细胞内胞浆物质含量　　小细胞癌胞浆稀少，免疫染色呈特殊改变，棕色着色纤细、不完整环绕核周或仅位于核旁点状，而非小细胞癌因胞浆丰富则着色宽阔、并完整环绕胞核。　　尽管小细胞癌还可表达Syn，但不总是表达。因此Cytokeratin染色含量可助区分小细胞癌和非小细胞癌。　　2.粘膜部位病变，观察Cytokeratin显色的分布和模式可助识别微小癌灶　　鼻咽部粘膜活检，粘膜下Cytokeratin着色的细胞分布紊乱、失去正常组织结构，再仔细观察细胞形态，更确认为癌。　　胃粘膜活检，固有层内细胞弥漫生长、失去正常腺体结构，需要鉴别印戒细胞癌和组织细胞，若pan-Cytokeratin表达呈印戒细胞样或条索状，则诊断为印戒细胞癌。四、CK201.尿路上皮CK20表达增多/异常分布，提示异型增生和原位癌。　　2.正常尿路上皮均浅表覆盖的伞细胞表达CK20；若基底层或上皮全层均着色，提示异型增生或原位癌。五、p161.p16染色真阳性的界定包括阳性细胞的分布和方式。　　2.与肛门生殖器部位感染HPV有关；不同部位癌的HPV感染率不同，宫颈癌（～100%），肛管（70-100%），阴道癌（60%），外阴癌（50%），阴茎癌（35%）。　　3.p16是周期依赖激酶抑制因子，免疫着色定位于胞核+/-胞浆。在适当的背景下，p16阳性说明肿瘤内高危型HPV转录活性强。　　4.也可以说，HPV阳性的肛门生殖器癌（包括原位癌和浸润癌）表达p16。　　5.Roche的免疫组化手册里面详细介绍了鳞状上皮细胞表达p16的评判标准：　　阳性：基底细胞和副基底细胞连续着色（片状；带状），表面细胞可或不着色，染色强度一致的强着色。　　阴性：全部不着色；或孤立细胞/少量细胞簇不连续着色，特别是基底细胞和副基底细胞不连续着色。　　6.p16在子宫颈病变中的表达　　子宫颈外口和子宫颈尽管，宫颈萎缩，反应性不典型增生：P16均阴性。　　尖锐湿疣、CINⅠ：若与高危型HPV有关，则p16阳性；与低危HPV有关，则p16阴性。　　CINⅡ/Ⅲ/鳞癌，原位腺癌，浸润腺癌，p16阳性（～100%）。　　因此p16最主要的诊断意义在于：鉴别CIN与反应性改变/萎缩，p16阴性则基本上排除高危型HPV感染；原位腺癌与化生的鉴别诊断。　　7.腺上皮染色p16：　　阴性：正常腺上皮；输卵管上皮化生/子宫内膜样化生（部分细胞表达，呈斑驳状着色）。　　阳性：原位腺癌/浸润性腺癌（所有细胞连续地一致着色）。　　口咽部位病变的p16染色标准，p16表达可作为口咽部癌伴有HPV感染的标记。　　所有/大部分的基底细胞样/非角化型口咽癌，或部分角化型口咽癌，若p16强染色，则说明存在HPV感染，可直接代替HPV检测。　　颈部淋巴结转移性鳞癌（明确或怀疑原发灶为口咽癌），若p16强表达，则HPV感染，可直接代替HPV检测。　　口咽部传统角化型鳞癌p16着色（此型不一定与HPV感染有关），则仍需要HPV检测。　　Modern Pathology，12-1220，口咽鳞癌P16染色表达范围和模式与HPV RNA检测关系：P16阳性细胞数50%-75%，且＞25%融合性表达（＞10个细胞簇连续表达），HPV RNA检测阳性；P16阳性细胞数75%-100%，HPV RNA检测阳性；其他表达数量和模式均无法检测出HPV RNA。六、S1001.依据细胞表达S100的形状形态可提供诊断线索。如R-D病：S100显示组织细胞（非常大，核着色），而伸入内的浆细胞（暗区）胞核不着色。因此S100可助于显示组织细胞边界和伸入现象。　　2.S100染色可鉴别Langerhans组织细胞增生病和皮病性淋巴结炎，两者均有细胞核沟，均表达S100、CD1α、Langerin的细胞量增加，但是Langerhans组织细胞增生病：核更卵圆形，细胞离散（树突缩起），S100染色显示细胞卵圆形、没有/很少突起。　　皮病性淋巴结炎：核更拉长，细胞边界不清（更多树突交织），S100染色突起明显。　　3.梭形细胞恶黑VS指突状细胞肉瘤　　指突状细胞肉瘤的免疫表型：CD45/LCA+/-；S100++（长、分支状突起）；CD68-/+；CD163常-；CD20-，CD3-；CD4-/+，CD43-/+，CD45RO+/-；CD1α-，Langerin-（by definition）；FDC细胞标记-（by definition）。　　会诊病例中的绝大多数指突状细胞肉瘤实际上为梭形细胞恶黑，而不幸地，梭形细胞恶黑常常HMB45和melan A阴性，导致无法肯定或排除诊断。梭形细胞恶黑的S100染色无突起，可MiTF灶性阳性。七、Desmin　　肿瘤细胞染Desmin呈星芒状，则不是平滑肌或骨骼肌细胞。　　如深部腱鞘巨细胞瘤、血管瘤型纤维组织细胞瘤，Desmin染色呈星芒状、放射线状。八、Myogenin　　阳性细胞比例可帮助横纹肌肉瘤的分型，如：腺泡亚型（所有细胞均阳性），胚胎型（部分细胞表达）。九、CD20　　小淋巴细胞增生病变，若CD20弱表达，则怀疑慢性淋巴细胞性白血病（即便最初没考虑到）。　　CD20强阳性，为B细胞淋巴瘤，但对分型没有特异意义。十、CD5　　小淋巴细胞增生病变，若CD5弱表达，则怀疑慢性淋巴细胞性白血病/套细胞淋巴瘤。　　正常T细胞强表达CD5，CD5弱表达的细胞为肿瘤性B细胞，需要与CD3对比观察。十 一、Immunoglobulin细胞弱强表达提示为单克隆性肿瘤　　肿瘤细胞一致强度表达轻链κ（单克隆）。　　有时κ染色可见2组细胞群：强表达为正常浆细胞，弱-中度表达为肿瘤性细胞。十二、BCL2淋巴滤泡内强表达，提示BCL2基因重排（如滤泡性淋巴瘤）1.BCL2免疫组化可以鉴别滤泡性淋巴瘤（常阳性）和滤泡反应性增生（生发中心阴性）。　　2.滤泡反应性增生的滤泡内T细胞可以表达BCL2，会误诊为生发中心的B细胞。若滤泡内BCL2阳性的细胞＞＞CD3阳性细胞，则说明为真正BCL2重排肿瘤（滤泡性淋巴瘤）；若滤泡内BCL2阳性的细胞与CD3阳性细胞数量相当，则说明为非肿瘤病变。在穿刺小样本时有帮助诊断。　　3.若滤泡内细胞BCL2染色强度＞＞周围细胞染色，则说明为真正BCL2重排肿瘤。　　4.滤泡间细胞强表达BCL2，即可认为BCL2真阳性，无需比较CD3。　　5.病灶包膜外细胞强表达BCL2，则为BCL2真阳性。十三、HER2可评估乳腺DCIS是否存在微浸润　　HER2染色，DCIS病灶外周呈光滑规整圆形，而微浸润区域不规则、不圆滑。十四、ER1.染色帮助提示微浸润（病灶外形不规则、圆滑），而DCIS病灶呈光滑规整圆形。　　2.大巢状、大团状细胞弥漫强表达ER，最外层细胞容易误诊为受压变梭的肌上皮（并不是肌上皮，ER染色强度与内层细胞一致强度），结合P63等抗体证实诊断。十五、ER、CK5/6判断乳腺导管上皮增生VS乳腺癌1.导管上皮增生：CK5/6表达呈镶嵌状，ER表达强弱不一。　　2.乳腺DCIS：ER一致强阳性，CK5/6阴性。　　3.注意，ER、CK5/6联合诊断仅用于导管内呈实性、接近实性、筛状生长，并不适用于单腺管病变（也可强表达ER）。十六、CDX2注意染色强度和范围　　肠癌弥漫强表达；而胃癌表达较弱、且表达数量不一。十七、染色定位改变ALK；β-catenin；CAMTA1；P120-catenin1.ALK重排相关肿瘤，伙伴基因和易位位点不同，则ALK蛋白表达细胞定位不同。　　2.β-catenin核阳性，见于多种不同类型肿瘤：韧带样纤维瘤病，筛状-桑葚亚型的甲状腺乳头状癌，胰腺实性-假乳头状肿瘤，鼻咽球周细胞瘤，Sertoli细胞瘤/微囊性间质瘤。　　3.CAMTA1核阳性，标记上皮样血管内皮细胞瘤；一些正常组织（甲状腺、结肠）胞浆弱表达。　　4.P120-catenin，乳腺小叶癌（原位、浸润）胞浆弥漫表达VS膜表达则为导管癌。
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免疫组化技术常用显色液的选择与使用这是一篇介绍免疫组化常用显色液的文章，为什么要写显色液呢？因为……当我还是个免疫组化技术新人的时候，在AEC显色液的使用上经历了一次惨痛的失败，那一年那一天那一刻那种心碎的感觉，今生难忘！（旁白）：有什么不高兴的，说出来让大家高兴高兴呗……一、关于AEC显色液的一次失败教训话说大约在九年前，刚开始做免疫组化不久，接到一研究生的科研免疫组化制片工作，180个蜡块，研究生提供的免疫组化试剂中选用了AEC显色液。协助研究生做实验只能在周末进行，周六切片烤片，周日完成制片。周日一大早到实验室，当年还是手工操作，终于在下午4点钟开始显色，第一次使用AEC显色液，看着切片上AEC的红色色原一点点呈现，成功的喜悦在心里荡漾…….哼着小曲收片，水洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，水洗……艾玛呀，切片上红色的AEC色原居然全部消失了，只剩下苏木素淡淡的蓝色……啊，苍天，为什么？掏出AEC说明书一看，AEC显色终产物溶于乙醇，显色后不能用盐酸酒精分化苏木素，要用水性封片剂进行封片（翻翻实验试剂，并未发现水性封片剂，看来这研究生也是个二把刀）。下午的阳光如此灿烂，而我的心情如此灰暗！异常安静的实验室里，我听到自己心碎的声音……180个蜡块!这就是一个二把刀研究生遇上一个新手技术员的故事。我们在成长的过程中会经历大大小小的错误，只有学会复盘学会反省，才能提升认知不断成长成更好的自己。开始实验前一定要认真看试剂说明书，掌握技术流程！开始实验前一定要认真看试剂说明书，掌握技术流程！开始实验前一定要认真看试剂说明书，掌握技术流程！重要的事情说三遍！敲黑板……各位开始做免疫组化的新童鞋们，尤其要注意啊！二、免疫组化常用的显色系统与显色液目前常用的显色系统有两类：（一）辣根过氧化物酶（HRP）显色系统：辣根过氧化物酶（HRP）可用DAB或AEC作为供氢体，H2O2作为底物，最终使抗原抗体结合的终产物呈棕黄色或红色。DAB（3，3’-二氨基联苯胺）显色液：H2O2作为底物，终产物呈棕黄色或棕褐色。为病理科最常用的免疫组化单染显色液。DAB显色的棕黄色色原稳定性好，不溶于有机溶剂，切片复染后可以分化脱水透明，色原长期保存不褪色。DAB为联苯偶氮化合物，可诱发皮肤癌和膀胱癌，在显色操作过程中需注意防护。DAB显色后的残液需妥善处理，避免污染环境。AEC（3-氨基-9-乙基卡巴唑）显色液：H2O2作为底物，终产物呈深红色。AEC显色终产物溶于酒精和有机溶剂，故复染苏木素后禁止用盐酸酒精分化、梯度酒精脱水和透明。必须使用水性封片胶封片。AEC显色终产物容易褪色，切片颜色不能长期保存。（二）碱性磷酸酶（AP）显色系统：NBT/BCIP(四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐)显色液：NBT与BCIP同时存在时，在碱性磷酸酶的作用下，NBT被还原成蓝色或紫蓝色沉淀。NBT色原不溶于酒精。NBT显色终产物容易褪色，切片颜色不能长期保存。Permanent Red显色液：Permanent Red显色的终产物呈玫瑰红色。色原溶于酒精和有机溶剂，复染苏木素后禁止用盐酸酒精分化、梯度酒精脱水和透明。必须使用水性封片胶封片。Fast &Red显色液：Fast Red显色的终产物呈玫瑰红色。色原溶于酒精，复染苏木素后禁止用盐酸酒精分化、梯度酒精脱水和透明。必须使用水性封片胶封片。三、免疫组化多重染色技术中显色液的选择与使用免疫组化双染技术，就是使用两种不同种属来源的一抗，连接不同种属的二抗和不同的显色系统，在同一张组织切片中，同时显示组织和细胞不同部位的两种抗原表达情况。双染常用的显色系统组合：（一）HRP-AEC/AP-NBT组合：前列腺癌CK-HMW+P63+ AMACR （P504S）双染主要用于前列腺癌的辅助诊断。AMACR（P504S）在前列腺癌细胞胞浆阳性表达，呈紫蓝色，p63/34?E12在基底细胞核和胞浆阳性表达，呈红色。（二）HRP-DAB/AP- Permanent Red组合：前列腺癌CK-HMW+P63+ AMACR (P504S)双染主要用于前列腺癌的辅助诊断。AMACR(P504S)在前列腺癌细胞胞浆阳性表达，呈玫瑰红色，p63/CK-HMW (34βE12)在基底细胞核和胞浆阳性表达，呈棕黄色。CD3和CD20双染CD3和CD20双染用于淋巴瘤的辅助诊断。B细胞为细胞膜CD20（L26）阳性表达，呈棕黄色；T细胞为细胞膜CD3（EP41）阳性表达，呈玫瑰红色。注意：除了单一的DAB显色，其他的显色液基本上都溶于酒精，切片需使用水性封片胶封片。水性封片剂的使用方法：方法一：切片水洗后，擦干切片边缘多余的水份，滴加水性封片剂2~3滴，盖玻片封片。优点：操作简单快捷，封片后可以立即阅片。缺点：切片的封片剂凝固非常缓慢，盖玻片长期处于极易滑动的状态，不利于切片保存和归档。方法二：切片水洗后，擦干切片边缘多余的水份，滴加水性封片剂3~4滴，将切片放置在烤片台上烤干封片剂，在烤片的过程中不时用牙签或移液器枪头摊开封片剂，加速干燥速度，同时使封片剂的覆盖厚度均匀。优点：封片剂干燥后可以立即阅片，立即存档。缺点：封片剂烤干的时间较长。干燥后的水性封片剂比较薄，切片在阅片与保存的过程中，容易受到磨损。方法三：按方法二烤干封片剂后，切片按常规封片方法进行二次封片。优点：达到水性封片的目的，避免组织表面受损。缺点：操作方法稍繁琐。四、相关产品信息产品编号产品名称规格ZLI-9017/DAB kit（20× 二管） 1ml/3ml/10mlZLI-9034DAB 显色增强剂3mlZLI-9049DAB粉剂5gZLI-9036/9037AEC（20×） 2ml/12mlZLI-9042AP-Red kit（40×） 2mlZLI-9043GBI-Permanent Red 6mlZLI-9041BCIP/NBT（100×） 0.1mlZLI-9551/9552GVA（水溶性封片剂） 5ml /15mlDS-0101前列腺双染试剂盒（AMACR+P63）30人份DS-0106前列腺双染试剂盒（AMACR+P63+CK-H）60人份DS-0110T/B细胞淋巴瘤双染试剂盒30人份DS-0001/0002双染试剂盒（Mo/HRP+Rb/AP）6ml/12mlDS-0005/0006双染试剂盒（Mo/AP+Rb/HRP）6ml/12ml
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免疫组化实验DAB显色时间如何把握？
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来源：互联网
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（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；
（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗 体孵育时间；
（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封 闭时间过长。
DAB显色一定不要超过10min，最好控制在5min之内。鉴于你的结果，我建议你考虑以下问题：
1、一抗的有效性。
2、二抗的有效性。
3、DAB是否有效。
以上问题都很好解决，曾经有位战友亦遇此问题，最后弄清楚是二抗失效。
此外，一切都没问题时，DAB显色在30秒之内即出结果，并且一定要在镜下控制，否则，时间过长，非特异性染色会出现，背景加深。
DAB显色液购买链接： /shop/goods.php?id=1689
(责任编辑：大汉昆仑王)
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