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Genistein对大鼠肝星状细胞的增殖及
?世界华人消化杂志 日; 18(3): 229-233 ISSN
CN 14-1260/R基础研究 BASIC RESEARCHＧｅｎｉｓｔｅｉｎ对大鼠肝星状细胞的增殖及ＴＧＦ－β１、ＭＭＰ－２和 ＴＩＭＰ－２表达的影
响廖 明, 李 彦, 舒 伟廖明, 舒伟, 广西医科大学医学科学实验中心 区域性高发肿 瘤早期防治研究教育部重点实验室 广西壮族自治区南宁市 530021 李彦, 广西大学 广西壮族自治区南宁市 530004廖明, 博士, 讲师, 主要从事肝脏蛋白质组学研究. 作者贡献分布: 此课题由廖明设计; 研究过程由廖明与舒伟完 成; 数据分析由李彦完成; 本论文写作由廖明与李彦完成. 通讯作者: 廖明, 讲师, 530021, 广西壮族自治区南宁市, 广西医 科大学医学科学实验中心, 区域性高发肿瘤早期防治研究教育 部重点实验室.
在线出版日期: mRNAs was measured by semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). RESULTS: Genistein at concentrations of 12.5, 25 and 50 mg/L signi?cantly inhibited cell proliferation (0.306 ± 0. ± 0.0085, and 0.1316 ± 0.0049 vs 0.4468 ± 0.0299, all P & 0.05). Compared with untreated cells, the expression of MMP-2 mRNA was markedly upregulated (all P & 0.05), and the expression of TGF-β1 and TIMP-2 mRNAs was markedly dowregulated (all P & 0.05) in HSCs treated with different concentrations of genistein. CONCLUSION: Genistein exerts anti-?brogenic effects perhaps by inhibiting the expression of TGF-β1 and TIMP-2 mRNAs and increasing the expression of MMP-2 mRNA in HSCs in rats.Key Words: G H Gene expressionLiao M, Li Y, Shu W. Effects of genistein on cell proliferation and TGF-β1, MMP-2 and TIMP-2 expression in hepatic stellate cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi ): 229-233■背景资料Effects of genistein on cell proliferation and TGF-β1, MMP-2 and TIMP-2 expression in rat hepatic stellate cellsMing Liao, Yan Li, Wei Shu Ming Liao, Wei Shu, Medical Scienti?c Research Center of Guangxi Medical University, Key Laboratory for Early Prevention and Treatment of Endemic Tumors, Ministry of Education, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Yan Li, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Correspondence to: Ming Liao, Medical Scientific Research Center Of Guangxi Medical University, Key Laboratory for Early Prevention and Treatment of Endemic Tumors, Ministry of Education, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China.
Published online: HSC是肝纤维化 时ECM过多产 生和沉积的主要 细胞来源, HSC 的激活、增殖 及ECM的过量 沉积在肝纤维化 过程中起核心作 用 . G e n i s t e i n是 来源于豆类植物 的异黄酮类化合 物, 体内、外的 研究表明其对多 种肿瘤细胞具有 较好的抑制作用. 本研究旨在观察 Genistein对HSC 增殖和肝纤维化 相关基因表达的 影响, 探讨其抗肝 纤维化机制.AbstractAIM: To investigate the effects of genistein on cell proliferation and the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinase-2 (TIMP-2) in rat hepatic stellate cell (HSC) and explore its possible anti-?brogenic mechanism. METHODS: After cultured HSC-T6 cells were exposed to different concentrations of genistein for 24 h, cell proliferation was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, and the expression of TGF-β1, MMP-2 and TIMP-2摘要 目的: 观察4, 5, 7-三羟基异黄酮(Genistein) 对大鼠肝星状细胞(H S C)增殖及T G F-β1、 MMP-2及TIMP-2基因表达的影响, 探讨其抗 肝纤维化的可能机制.方法: 将体外培养的大鼠H S C-T6分别给予 不同浓度的Genistein作用24 h后, 用噻唑兰 比色法(M T T)检测测定活细胞数, 采用半定 量RT-PCR法检测细胞中TGF-β1、MMP-2及 TIMP-2的mRNA水平. 结果: Genistein作用于大鼠HSC-T6后, 活细胞 数目减少, 12.5、25及50 mg/L 3个作用浓度 组与对照组的A 值比较有显著性差异(0.306 ±0.±0.6±0.0049■同行评议者王炳元, 教授, 中国 医科大学附属第 一医院消化内科230■相关报道ISSN CN 14-1260/R世界华人消化杂志日第18卷 第3期刘小菁等的体 外 实 验 表 明 , Genistein可以抑 制肝纤维化Ⅰ级 大鼠肝窦内皮细 胞增殖, 促进肝窦 内皮细胞细胞NO 合成, 对肝纤维化 的肝窦内皮细胞 功能有一定调节 作用.vs 0.9, 均P &0.05). 不同浓度的Genistein干预HSC-T6, MMP-2 mRNA表达 水平与对照组比较均明显增强(均P &0.05); TGF-β1和TIMP-2 mRNA表达水平与对照组 比较均明显降低(均P &0.05). 结论: G e n i s t e i n可能通过增强大鼠H S C M M P-2 m R N A的表达, 同时抑制T G F-β与 TIMP-2 mRNA的表达发挥抗纤维化的作用.关键词: 4, 5, 7-三羟基异黄酮; 肝星状细胞; 基因 表达廖明, 李彦, 舒伟. G e n i s t e i n对大鼠肝星状细胞的增殖及 TGF-β1、MMP-2和TIMP-2表达的影响. 世界华人消化杂志 ): 229-233唑兰比色法(MTT)测定活细胞数, 以检测其对细 胞增殖的影响; 而后采用半定量RT-PCR法检测 TGF-β1、MMP-2和TIMP-2的mRNA表达水平, 探讨Genistein抗肝纤维化的作用机制. 1 材料和方法 1.1 材料 H S C-T6, 为S V40转染S D大鼠H S C, 为永生化细胞, 表型为活化的H S C, 具纤维化 特性. 细胞由广西医科大学姜海行教授馈赠. Genistein(Sigma); DMEM(Gibco); 胎牛血清 (Hyclone); TRIzol(Invitrogen); 逆转录试剂盒 (Fermentas); 2×PCR mix(TaKaRa). CO2培养箱 (美国Thermo); 高速冷冻离心机(美国Thermo); 倒 置相差显微镜(德国Zeiss); 酶标仪(美国Thermo); PCR仪(美国Bio-Rad); 核酸蛋白测定仪(日本岛 津); 凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad); 低压电泳 仪(美国Bio-Rad). 1.2 方法 1.2.1 细胞培养: 将冷冻保存于超低温冰箱中的 HSC-T6复苏后接种于含100 mL/L胎牛血清的高 糖DMEM培养液中, 37 ℃、50 mL/L CO2条件下 培养. 当细胞呈单层致密状时, 采用2.5 g/L胰蛋 白酶消化后传代. 每次试验均在呈指数生长的 细胞中进行. 1.2.2 M T T法测定药物对细胞增殖的影响: 将 H S C以5×10 7 /L接种于96孔板, 培养12 h后, 换含3.125、6.25、12.5、25、50、100 m g/L Genistein的培养液, 每个浓度设5个复孔. 继续培 养20 h后, 每孔加入MTT 20 ?L, 继续培养4 h, 吸 出全部液体, 加入100 ?L DMSO, 微量振荡器上 振荡5 min, 酶标仪双波长(570/630 nm)比色. 1.2.3 RT-PCR法检测TGF-β1、MMP-2及TIMP-2 mRNA的表达: 将细胞以5×107/L接种于50 mL 培养瓶中, 分为空白对照组, 处理组为Genistein 的6.25、12.5、25、50 mg/L组. 培养12 h后, 处 理组换Genistein的培养液继续培养24 h. 采用 TRIzol法抽提细胞中总RNA. 用核酸蛋白测定仪 测定RNA含量及纯度, 保证A 260/A 280均为1.8-2.0. 取RNA 5 ?g, 采用M-MuLV逆转录酶将其逆转 录成cDNA. 根据NCBI的GenBank基因序列自行 设计引物, 引物序列为: β-actin: FP: 5'-AACCC TAAGGCCAACCGTGAAAAG-3', RP': 5'-TCA TGAGGTAGTCTGTCAGGT-3', 产物长度: 240 TGF-β1: FP: 5'-ATGGTGGACCGCAACAA C-3', RP: 5'-TGAG CACTGAAGCGAAAGC-3', 产物长度: 329 M M P2: F P: 5'-T G G A A//229.asp0 引言 肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纤维 化时细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过 多产生和沉积的主要细胞来源, HSC的激活、 增殖及E C M的过量沉积在肝纤维化过程中起 核心作用. 转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)是强有力的致纤维化的细胞 因子, 在肝纤维化时表达明显增多, 促进HSC增 殖活化, 合成大量ECM, 在纤维化进程中起重要 作用 . 基质金属蛋白酶(matrix metal proteases, MMPs)及其组织抑制因子(tissue inhibitors of metal proteases, TIMPs)是肝脏内调节ECM降解 与合成平衡的主要因子, 其中M M P s负责降解 ECM, 而TIMPs则通过与MMPs形成1∶1的复 合物抑制M M P s的活化及酶解活性 . M M P-2 是MMPs中的重要成员, 主要降解Ⅰ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅶ, Ⅹ型胶原和弹性蛋白、纤维连接蛋白以及变性 的Ⅰ型胶原等, 而其组织抑制因子-TIMP-2通过 抑制MMP-2, 阻止ECM的降解, 从而形成或促 进肝纤维化[3,4]. Iimuro等[5]提出, 如能增强MMPs 活性和(或)抑制TIMPs活性, 有可能对肝纤维化 的发生、发展进行调节, 从而减缓和阻断肝纤 维化的过程. 4, 5, 7-三羟基异黄酮(Genistein)是 来源于豆类植物的异黄酮类化合物, 体内、外 的研究表明其对乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃 癌和鼻咽癌等多种肿瘤细胞具有较好的抑制作 用[6-12] [2] [1]. 另外, Genistein能抑制肝纤维化大鼠肝窦[13]内皮细胞的增殖, 但其对肝星状细胞的影响尚未见有报道. 我们用Genistein的不同浓度干预 体外培养的大鼠肝星状细胞系HSC-T6, 利用噻廖明, 等. Genistein对大鼠肝星状细胞的增殖及TGF-β1、MMP-2和TIMP-2表达的影响A1 2 3 4 5 6 B 1 2 3 4 5 6 C 1 2 3 4 5 6 图 1 各组MMP-2、TGF-β1 及TIMP-2 mRNA的表达. A: MMP-2; B: TGF-β1; C: TIMP-2; 1: 50 mg/L; 2: 25 mg/L; 3: 12.5 mg/L; 4: 6.25 mg/L; 5: M 6: 对照组.231■创新盘点MMP-2 (527 bp) β-actin (240 bp) TGF-β1 (329 bp) β-actin (240 bp)TIMP-2 (262 bp) β-actin (240 bp)本研究将Genistein 作用于HSC, 观察 其对HSC增殖的 影响, 并首次以 TGF-β1、MMP-2 和TIMP-2为靶点 探讨其抗肝纤维 化的机制.表 1 不同浓度Genistein对HSC-T6的TGF-β1、MMP-2及TIMP-2 mRNA表达的影响 (n = 5, mean±SD)分组 对照组 Genistein组(mg/L) 6.25 12.5 25 50TGF-β1 0.481±0.137 0.371±0.054a 0.258±0.070 0.423±0.095aMMP-2 0.017±0.065 0.036±0.011a 0.060±0.083 0.088±0.031aTIMP-2 1.053±0.345 0.813±0.014a 0.615±0.087a 0.604±0.019a 0.728±0.106a0.227±0.068aa0.101±0.087aaaP &0.05 vs 对照组.GCATCAAATCGGACTG-3', RP: 5'-GCAAA GGGCAAACAAAGCA-3', 产物长度: 527 TIMP-2: FP: 5'-CCAAAGCAGTGAGCGAGAA3', RP: 5'-TCCCAGGGCACAATAAAGTC-3', 产 物长度: 262 PCR扩增cDNA, 条件为: 94 ℃ 预变性5 m i n, 94 ℃变性30 s, 各自退火温度 (MMP-2为55 ℃; TIMP-2、TGF-β1为52 ℃)30 s, 72 ℃延伸30 s, 72 ℃延伸10 min, 总共30个循环; 所有PCR产物在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳后, 用 凝胶成像系统拍照, Quantity One软件测定灰度 值, 灰度值以各产物与β-actin的积分吸光度(A ) 的比值表示. 统计学处理 应用SPSS13.0软件进行统计分 析. 数据均以mean±SD表示, 组间比较采用t 检 验, P &0.05表示存在统计学意义. 2 结果 2.1 Genistein对细胞增殖的影响 分别用浓度为 3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg/L的Genistein作用于活化的大鼠HSC-T6, 应用MTT方 法检测细胞增殖, 随着Genistein浓度的增加A 值 逐渐降低, 在100 mg/L时药物对细胞有杀伤作 用. 统计学分析结果表明, 50、25及12.5 mg/L三 个浓度组与对照组的A 值比较(0.7, 0.5, 0.9 vs 0.4468± 0.0299, 均P &0.05)有显著性差异, 3.125和6.25m g/L浓度组与对照组的A 值比较, 无显著性差 异(0.5, 0.6 vs 0.4468± 0.0299, P &0.05). 2.2 G e n i s t e i n对H S C的T G F-β1、M M P-2及 TIMP-2 mRNA表达的影响 灰度分析结果表明, 与空白对照组比较, Genistein 6.25、12.5、25、 50 mg/L组的MMP-2 mRNA表达明显升高, 差别 有统计学意义(P &0.05), 且呈现一定的浓度依赖 性; 而TGF-β1和TIMP-2 mRNA表达明显降低, 差别有统计学意义(均P &0.05), 也呈现一定的剂 量依赖效应(图1, 表1). 3 讨论 HSC的活化被认为是肝纤维化形成的中心环节. 近来研究表明, 逆转肝纤维化关键在于减少活 化的HSC数量. 活化HSC数目减少, 不仅可以使 ECM分泌减少, 而且还可影响ECM的降解, 因 此抑制活化的HSC成为抗肝纤维化的研究热点. HSC的数量是由HSC增殖和凋亡共同决定的, 从 理论上讲, 减少活化HSC数量有这些途径: (1)抑 制HSC增殖; (2)诱导HSC凋亡, 直接减少HSC数 量; (3)逆转HSC的激活, 让HSC由活化型变回静 止型等. 但研究表明抑制细胞增殖和诱导凋亡 是减少活化型HSC数量的主要途径, 因此, 抑制 HSC增殖是抗肝纤维化有效途径. Genistein是 大豆异黄酮(soybean isoflavones)的成分之一, 是232■应用要点ISSN CN 14-1260/R世界华人消化杂志日第18卷 第3期本 研 究 证 实 Genistein可能通 过增强大鼠HSC MMP-2 mRNA的 表达, 同时抑制 TGF-β与TIMP-2 mRNA的表达发 挥抗纤维化的作 用, 为Genistein的 进一步临床应用 提供理论基础.大豆中一类重要的非营养素成分, 近年来的研 究显示其具有明显的抗肿瘤作用. 有研究表明 Genistein能抑制肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞的 增殖 , 但其对HSC的影响尚未见有报道. 我们 检测了Genistein对大鼠肝纤维化细胞株HSC-T6 的影响. M M T检测结果发现G e n i s t e i n能抑制 HSC-T6的增殖, 并且随着浓度的增加而增加, 初 步证实Genistein具有抗肝纤维化作用. 目前认为ECM的过度增多和异常沉积是肝 纤维化发生的主要机制[14-16]. 在正常肝脏组织中 存在着ECM的合成与降解的动态平衡. 肝纤维 化时纤维结缔组织的形成, 是由于各种不同致 病因子导致ECM合成与降解的失衡所致. 多项 研究表明, TGF-β1是强有力的致纤维化细胞因 子, 在肝纤维化中表达明显增多, 可促进HSC的 增殖和活化, 使ECM合成增多, 降解减少, 并存 在正反馈放大效应, 促进肝纤维化的进程 [17-20]. 在我们的研究当中, Genistein干预HSC-T6后, 与对照组比较, TGF-β1的mRNA表达量明显降 低, 具有统计学意义, 且以25及12.5 mg/L抑制作 用最明显. 我们推断Genistein可能是通过抑制 TGF-β1的表达而发挥抗肝纤维化的作用. MMPs是ECM降解的主要酶系, 而其组织 抑制因子(TIMPs)通过抑制MMPs, 阻止ECM的 降解, 从而形成或促进肝纤维化. MMP-2初次发 现于小鼠转移性肿瘤细胞和兔骨细胞的培养过 程中. 较多的研究认为MMP-2在纤维化阶段升 高, 而在肝硬化和肝纤维化恢复期逐渐降低. 朱 跃科等 [21]研究发现, 在肝纤维化的形成过程中 MMP-2的基因表达、蛋白表达及酶活性均增高. MMP-2的表达与酶活性在肝纤维化逆转过程逐 渐降低, 说明MMP-2与肝纤维化的发生发展密 切相关, 而TIMP-2在肝纤维化发展过程中表达 增强, MMP-2/TIMP-2的比值下降. 在原代培养 的HSC早期, TIMP-2不表达, HSC激活后TIMP-2 表达增加. 张亚飞等 [22] 的研究发现通过抑制 TIMP-2的表达, 可间接增强MMP-2的活性, 降低 Ⅳ胶原在肝纤维化中的沉积, 减缓肝纤维化的 发展. 临床研究发现, 未经干扰素治疗的慢性丙 型肝炎患者血清中的TIMP-2水平在6 mo后显著 升高, 而经干扰素治疗6 mo后血清中的TIMP-2 水平无明显变化 [23] . 而且, 在肝硬化及原发性 肝癌未转移患者血清中T I M P-2的水平也明显 升高[24]. 在用不同浓度的Genistein干扰HSC-T6 后, 我们采用RT-PCR法检测MMP-2和TIMP-2 的mRNA表达, 结果发现, 与对照相比MMP-2的[13]表达量明显增多, 而TIMP-2表达下降. 因此我 们认为Genistein可能是通过抑制调节MMP-2/ TIMP-2的表达, 而发挥抗纤维化的作用. 总之, 我们在采用Genistein干预大鼠肝星状 细胞系HSC-T6的研究中, 发现Genistein具有明 显的抗肝纤维化作用, 这种抗肝纤维化作用可 能是通过抑制活化的HSC的增殖, 降低TGF-β1 和TIMP-2的表达, 上调MMP-2的表达来实现. 41参考文献Gressner AM, Weiskirchen R. Modern pathogenetic concepts of liver ?brosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. 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CN 14-1260/R 2010年版权归世界华人消化杂志? 消息 ?汤姆森 - 路透公布 2008 年 WJG 影响因子 2.081本刊讯 据汤姆森-路透科技信息集团发布《期刊引证报告》(Journal Citation Reports )的统计结果:World Journal of Gastroenterology (WJG )的总被引次数(TC): 10 822; 影响因子(IF): 2.081; 即年指数: 0.274; 论文数量: 1112; 半衰期: 3.1; 特征因子(EF): 0.05006. 特征因子这个指标是今年期刊引证报告里新加的一个指标. 与 影响因子不同的是, 这个指标不仅考察了引文的数量, 而且考虑了施引期刊的影响力, 即: 某期刊如果越多地 被高影响力的期刊引用, 则该期刊的影响力也越高. 正如Google考虑超链接的来源, 特征因子也充分考虑引文 的来源, 并在计算中赋予不同施引期刊的引文以不同的权重. 特征因子分值的计算基于过去5年中期刊发表的 论文在期刊引证报告统计当年的被引用情况. 与影响因子比较, 期刊特征因子分值的优点主要有: (1)特征因子 考虑了期刊论文发表后5年的引用时段, 而影响因子只统计了2年的引文时段, 后者不能客观地反映期刊论文的 引用高峰年份; (2)特征因子对期刊引证的统计包括自然科学和社会科学, 更为全面、完整; (3)特征因子的计算 扣除了期刊的自引; (4)特征因子的计算基于随机的引文链接, 通过特征因子分值可以较为合理地测度科研人 员用于阅读不同期刊的时间. 在55种国际胃肠病学和肝病学期刊中, WJG 的EF, TC和IF分别名列第6, 9, 32位. (WJG 编辑部主任: 程剑侠 )
肝星状细胞分离培养及鉴定的试验方案_小学作文_小学...肝星状细胞的分离采用改良的 Friedman 方法,大鼠术...培养大鼠肝细胞模型丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬...(P&0.01),显著提高肝细胞活性, 促进肝细胞增殖。 ...和 survivin 蛋自表达变化在 genistein,诱导肝癌细胞...miR-185 对肝癌细胞生长增殖及侵袭迁移的影响 16…...RNA 干扰技术体外抑制肝星状细胞表皮形态发生素表达...Genistein 在调节肝癌 HepG2 细胞 Fas 基因表达及...本文就苦参的化学成分及药理作用进行了综述。 1 苦参中主要的化学成分 1.1 ...田雄英等[26]研究发现,苦参碱对大鼠肝星状细胞(HSC) 增殖有明 显的抑制作用...有助于肝纤维化形成的细胞是 A.肝细胞B.Kupffer细胞C.肝星状细胞D.细胞外基质E.胆管细胞_答案解析_2016年_一模/二模/三模/联考_图文_百度高考蛇毒神经生长因子对大鼠... 暂无评价 6页 ¥3.00 超声血流动力学联合血清....这些研究均表明, 外力的变化不仅会促进肝 星状细胞的增殖, 还会提高其胶原等胞...Genistein 对结肠癌细胞 HT-29 增殖、凋亡的影响及...金雀异黄素对 CIA 大鼠成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡...星状孢子素和金雀异黄素对人早幼粒白血病细胞系的...神经生长因子论文: 神经生长因子论文:神经生长因子及其受体 p75NTR 对肝星 状细胞作用的初步研究 【中文摘要】 1.观察 NGF 及其 p75NTR 对 HSC 增殖和凋亡的...长和增殖,诱导癌细胞凋亡,破坏癌细胞的转录和复制,...阻断纤维化细胞因子对肝星状细胞的作用,防止肝、 ...相比下,崖柏并 未被诸多热钱及玩家们炒起来。提到...清除氧自由基,抗脂质过氧化,抑制肝脏炎性因子生成及肝脏星状细胞激活,抗纤维化...建议肝衰竭时以静脉给药为主,对肝炎突发患者常见静脉滴注后改用口服的序贯疗法...
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??668????第22卷??第6期??2009年6月??论著摘要??医学研究生学报JournalofMedicalPostgraduatesVo.l22??No.6Jun.2009Percoll密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞许小兵,??李敏利,??郭婧芸,??吴文娟,??朱人敏南方医科大学南京临床医学院(南京军区南京总医院)关键词:??肝星状细胞;??密度梯度离心;??Percoll*中图分类号:??R-331??????文献标识码:??A??????文章编号:??09)06-0668-02消化内科,江苏南京210002????肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSC)活化并分泌胶原等基质成分,是肝纤维化发生、发展的中心环节[1]1.3??分离用液??前灌注原液(8??):Hepes7.2g、EDTA0.4g、葡萄糖3.6g、KCl0.4g、Na2HPO4??12H2O5.8g、KH2PO40.4g、双蒸水220m;l使用时抽取35ml及5%碳酸氢钠30ml加入185ml等渗盐水中,配置成前灌注液250ml。后灌注液:Hanks液75m、l??型胶原酶36mg、DNA酶17mg、Hepes0.36g。细胞分离液:BSA2.5g、Dnase110mg、PBS1000m。l1.4??方法1.4.1??操作步骤??将9只SD大鼠全身麻醉(腹腔注射氯胺酮10mg/100g、肝素g)后,去胸腹部毛、仰卧位固定,固定鼠尾,碘附消毒。取大十字切口,切开皮肤和腹部肌肉,下压肝组织,剪断镰状韧带至肝上下腔静脉。将9号输液针胶管插入门静脉,并固定。同时,迅速剪开膈肌,游离并结扎肝上下腔静脉,剪开游离好的肝下下腔静脉。????采用37??预热的前灌注液20ml/min灌注约15min,肝表面变为黄白色时完整分离肝,并转移入超净台,使用37??预热的后灌注液(0.5mg/ml??型胶原酶、0.05mg/mlDnase1酶、Hanks液35ml),于37??水浴中循环灌流,流速为20ml/min,约15min后肝组织完全软化,即停止灌注。将肝及酶液倒入培养皿中,去除肝包膜,钳夹分离肝;是目前肝纤维化实验研究的热点。HSC分离培养技术的发展代表了近代HSC研究的进步。有研究者发现,肝间质细胞体外培养时具有分泌细胞外基质的功能[2,3]。Knook等[4]明确这些细胞为肝星状细胞,基于其细胞内富含维生素A脂滴产生的浮力,确立了肝原位酶灌注消化及密度梯度离心的分离方法,成功分离HSC。Per-coll是常用的密度梯度离心试剂,具有无毒性、形成密度梯度稳定的特点[5],本试验探索Percoll分离HSC时的合理密度梯度,取得分离HSC的最佳效果,为深入研究肝纤维化的发病机制打下基础。1??材料和方法1.1??实验动物??成年雄性SD大鼠9只,每次使用1只,体重350~400g,常规饲料喂养,正常饮水。1.2??试剂????型胶原酶、DNA酶1、Hepes、EDTA、Hanks液购自Sigma公司;Percoll购自GE公司;DMEM培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;小鼠抗人、大鼠Desmin单克隆抗体、??-SMA单克隆抗体购自武汉博士德公司,TRITC标记山羊抗小鼠IgG二抗购自南京拜奥德公司。*收稿日期:??;??修订日期:??基金项目:??南京军区南京总医院科研基金重点资助项目(批准号:)作者简介:??许小兵(1980-),男,江苏如皋人,医师,医学硕士研究生,从事消化内科专业。通讯作者:??朱人敏(1951-),男,浙江萧山人,主任医师,医学博士,博士研究生导师,从事消化内科专业。E-mai:??第6期????许小兵,等??Percoll密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞细胞约15min,形成肝细胞悬液,4??DMEM培养基约40ml稀释,200目筛网(0.22??mol)滤过,玻璃注射器芯轻轻研磨肝组织,PBS液冲洗。将细胞悬液移入2支50ml离心管中,吸管吹打混匀,40g离心4min,去沉淀,取上清550g,离心6min,取沉淀合为1管,加入DMEM重悬为50m,l550g再次离心6min,取沉淀,加入DMEM重悬为15m,l加入10ml100%Percoll工作液,混匀后,轻轻上覆25%Percoll液体约15ml及PBS液10m,l形成3层不连续密度梯度,20??900g离心20min,25%Percoll层有白色细胞带,用16号针头插入液面下此处抽吸约为5m,l加DMEM培养液至50m,l900g离心10min,沉淀重悬于约10mlDMEM+10%胎牛血清培养基中,计数细胞产量,并行锥虫蓝染色试验,判断其活力。按1??10/孔接种于6孔板,24h后首次换液,以后视情况每2~3d换液1次。如需作免疫组化等分析,可将细胞接种于内有玻片的6孔板中。当细胞融合达到80%~90%左右可进行传代。传代时按常规使用0.25%胰酶+0.04íTA。1.4.2??细胞成活率鉴定??常规锥虫蓝排斥法。1.4.3??细胞纯度鉴定??培养皿中放入盖玻片,待细胞贴壁伸展后,取出盖玻片,行Desmin免疫荧光染色法鉴定。2??结????果????采用相差显微镜观察刚分离出的HSC,细胞呈圆球形,直径较肝巨噬细胞及内皮细胞大,约10??m,在荧光显微镜下328nm紫外光激发下,可观察到自发较弱的绿色荧光,24h后,绝大多数的细胞已贴壁,多呈圆形或椭圆形;48h后,细胞开始伸展,细胞体增大呈多边形,少数已伸出伪足呈星形。7d后,细胞继续伸展,折光性的颗粒渐减少,绝大多数细胞呈星形,细胞开始增殖,部分细胞相互融合呈片状。12~14d后,增殖的细胞铺满瓶底,并可使用胰酶消化传代,5~6代后增殖能力逐渐减弱。????每只大鼠的HSC得到的数量为(2.94??0.53)??10,细胞成活率为(97.8??0.7)%,Desmin免疫荧光阳性细胞为(94.8??2.8)%;培养9d后,??-SMA阳性细胞为(71.2??4.8)%。76??669??3??讨????论????HSC活化、增殖、分泌各种细胞因子及细胞外基质,在肝纤维化发生、发展过程中起关键作用。原代HSC的分离、培养是进行肝纤维化研究的基础,HSC的数量较少,约占肝细胞总数的5%~8%,大鼠HSC与肝实质细胞比值约为13??100。有实验者早期曾采用增加维生素A摄取法,以提高HSC产量,后期发现,随着年龄增加HSC内维生素A脂滴增加,因而采用了更大及年长大鼠(350g以上),HSC[6-8][6]产率得以增加。因此,实验采用了较大的大鼠,以期取得HSC高产量。在实验过程中,影响HSC产量及存活率的因素有:??合理密度梯度;??与其他细胞黏附量;??混杂细胞碎片量;??分离总时间;??适当的酶消化时间。????Percoll作为常用梯度离心分离介质之一,常用于骨髓细胞的分离培养[9,10],较Nycodenz等碘化物经济实惠,同时,因其黏滞度低,梯度形成更为迅速、稳定,易于洗脱,但国内类似实验中使用较少。Ralf等[11]认为,HSC分布于密度梯度1.025~[5]1.035g/ml密度层次中,本实验前期参考了Hakan测定的不同浓度Percoll的实际密度表,使用不同的Percoll密度梯度进行HSC分离,发现25%~40%Percoll不连续的密度梯度既保证了更好的细胞纯度,最大可能减少混杂肝巨噬细胞及肝窦内皮细胞,避免了复杂的淘洗过程,使分离过程简化,又保证HSC的产量无明显减少。????HSC易与肝细胞、细胞碎片黏附,因此,在实验过程尽量减少细胞间黏附。本实验过程中使用含牛血清清蛋白及DNA酶离心分离液的产量。????前期实验中比较了不同的加样方法,发现底部加样较好。细胞悬液与100%Percoll充分混匀,放置在梯度离心底层,在低速离心过程中,细胞逐步漂浮至相应密度梯度层,而细胞碎片等沉积于底层,减少了细胞碎片的混杂,增加了HSC产量????翁山耕等[13][5][12],反复吹打细胞悬液,避免HSC和肝细胞黏附,有效提高了HSC。在实际应用中发现,链霉蛋白酶灌注消化的程度难以把握,遂省略了链霉蛋白酶E灌注,而直接用低速离心法来去除肝细胞。本实验(下转第672页)??672??医学研究生学报参考文献:2009年6月??第22卷??蛋花汤为主。脑卒中患者的护理还要取得家属的支持和配合,并指导家属以乐观的态度去面对患者的疾病。患者出院后,建议家属每天至少给患者吃5种以上的蔬菜和水果,每周至少吃3次鱼,每天控制食盐在5g以内,常喝牛奶和适量淡绿茶,不食腌制品、油炸品、辛辣刺激性食物,不食动物内脏等高油脂食物。3??结????语????成功的心理护理是脑卒中患者康复期护理的基础,完善的饮食护理是康复期护理的关键,功能锻炼是提高生活质量的主要手段,对重症患者并发症的预防是康复期护理能否顺利进行的保障。脑卒中患者要达到完全康复是一个长期的过程,只要合理采用上述措施,制订切实可行的计划,生活要有规律,并加强恢复期功能锻炼,保持乐观的心情,就可有效地缩短康复期。[7,8][1]??史??莉.神经内科病人的心理护理体会[J].蛇志,):732-733.[2]??程??娟,叶??静.46例侧脑室肿瘤患者手术前后的护理[J].医学研究生学报,):559-560.[3]??李金萍,郑瑞红,吴晶晶,等.轻度锥体外系征与老年人日常生活能力的关系及护理对策[J].医学研究生学报,):510-512.[4]??范??欣.中风偏瘫患者的康复护理体会[J].内蒙古中医药,):37,47.[5]??王碧清.中风患者的康复护理[J].柳州医学,):183-184.[6]??胡明英,李??华.150例脑中风患者的护理体会[J].医学理论与实践,):163-164.[7]??赵爱武,张??瑞.中风后遗症的临床观察与护理[J].中华中西医杂志,):455-457.[8]??李??琳,孙??琳,刘??云.老年病房实施人性化护理的体会[J].医学研究生学报,):893-894.(责任编辑:张??锐)(上接第669页)采用上述方法,同时采用肝体外灌注,提高了灌注的效率,实验时间大为缩短,4h左右可完成全部分离工作,保证了细胞的成活率。????实验过程中为尽量减少细胞受损,我们反复摸索了酶灌注消化的合理时间,发现约15min酶灌注消化后肝组织即能完全软化,立即使用4??DMEM培养基重悬细胞,终止消化,后续流程中全程使用培养基,虽增加了培养基用量,但大大提高了HSC成活率。????总之,改良Percoll密度梯度离心方法分离、培养大鼠HSC有效且可靠,为进一步进行HSC研究奠定基础。参考文献:[1]??ScottL.Friedman,hepaticstellatecells:protean,multifunction-a,landenigmaticcellsoftheliver[J].PhysiolRev,):125-172.[2]??GalambosJT,HollingsworthMA,FalekA,etal.Therateofsynthesisofglycosaminoglycansandcollagenbyfibroblastscu-lturedfromadulthumanliverbiopsies[J].ClinInvest,):107-114.[3]??VossB,RauterbergJ,PottG,etal.Nonparenchymalcellscult-ivatedfromexplantsoffibroticliverresembleendothelialandsmoothmusclecellsfrombloodvesselwalls[J].Hepatology,):19-28.[4]??KnookDL,SeffelaarAM,deLeeuwAM.Fat-storingcellsoftheratliver.Theirisolationandpur?ication.[J]ExpCellRes,):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　percoll分离液原理_生物学_自然科学_专业资料。) 原理 Percoll 是一种包有乙烯...密度梯度时可在低离心力(200～ 1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离... 　在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理 ,采用密度梯度离心方法 (连续性和...肝星状细胞的分离采用改良的 Friedman 方法,大鼠术前禁食 12～16h,自由饮水。... 　鼠肝星状细胞分离方法汇总_临床医学_医药卫生_专业资料。1、 大鼠原代肝星状细胞...分两份分别加入已铺好梯度的 Percoll 顶层 17、 Percoll 的密度梯度分 3 层... 　外周皿中提取人淋巴细胞(PBMC)的方珐主要有:Ficoll 密度梯度离心珐,percoll 分层液珐 我主要使用的是 Ficoll 密度梯度离心珐,给你介绍下 Ficoll 密度梯度离心珐:... 　肝星状细胞的分离制备 1)肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法,大鼠术前禁食...Percoll密度梯度离心分离... 3页 1下载券 肝星状细胞 4页 免费 大鼠肝星状... 　分离样品;而等密度离心法中,梯度液的初始最大密度...细胞浮选转头、管式转头、血球比测定转头、细胞淘洗...Percoll、Metrizamide、 Nycodenz、Ludox、Dextran 等等... 　葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和 Percoll 不连续密度梯度离心法等是根据细胞的...分离小鼠单个核 细胞时比重为 1.080; 分离大鼠单个核细胞时比重为 1.084～1... 　实验二 Percoll 不连续密度梯度沉淀法分离纯化 NK 细胞 实验原理 Percoll 是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒,是一种新型密度梯度离心分离剂。 渗透压很...