主题：【原创】全自动固相萃取-比色法测定保健食品中总皂苷
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全自动固相萃取-比色法测定保健食品中总皂苷& & & & & & & & & & & & & & & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
作者：赵晓冬目的：建立保健食品中总皂苷的含量测定方法。方法：采用Sepline全自动固相萃取装置对保健食品中的总皂苷富集,通过70%乙醇回收，以香草醛-高氯酸为显色剂，采用比色法测定。结果：比色法测定的线性范围为0.038～0.268mg，相关系数 r=0.9997; 在不同保健食品中的平均加样回收率均在98.3%～102.4%，RSD〈2.2% (n=6)。结论：本法简便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于不同类型保健食品中总皂苷的含量测定。 目前保健食品中的总皂甙测定方法尚无国家标准，大多都是按照《保健食品检验与评价技术规范 (2003年版) 》“保健食品中总皂甙的测定”方法检测，该方法采用人参皂苷 Re为对照，用香草醛比色法测定总皂苷。其显色体系为:香草醛-冰醋酸-高氯酸，但在实际操作中和据相关文献报道中，但采用该方法检测结果误差较大，尤其是不同实验室间测定结果差异更大,不利于产品的质量控制。有文献报道，卫生部食品卫生监督所2000年组织全国22个省、市、自治区省级疾病预防控制中心对这一方法进行比对试验，结果显示:离散度较大，有的浓度水平还出现离群值，各实验室间的RSD达80%，因此需要对测定方法加以改进。本文采用莱伯泰科公司Sepline全自动固相萃取提取装置 具有洗脱液流速恒定可控、大批量产品自动化处理，保证试验系统的密闭性等优点可保证结果的平行性和准确性。在对大孔树脂进行品牌筛选的基础上，定制统一规格固相萃取柱、对总皂苷测定前处理过程进行了优化，整套方法简单，数据结果离散性小，平行性得到提高。1材料与方法1.1 仪器 & UV-2450 紫外可见分光光度计(日本，岛津公司)，CP2250分析天平，AS10200ADT超声波清洗仪，TLL-DCⅡ型氮吹仪，Sepline全自动固相萃取系统（北京莱伯泰科有限公司），固相萃取柱（底层有砂芯隔板,内装XAD-2大孔树脂2.7g,Alumina-N中性氧化铝，6ml,北京莱伯泰科有限公司）。1.2 试药 人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院，含量92.7%），冰醋酸、香草醛、高氯酸、乙醇均为分析纯，水为纯化水。1.3& 供试品 上普牌西洋参含片 (厦门上普药业有限公司，批号)；天信减肥茶( 福建安溪馨隆保健品有限公司，批号:
) ；辅助降血脂片（哈尔滨久盛医药科技开发有限公司，批号:）珍迪牌黄芪阿胶口服液（南昌健民营养补品厂，批号: ）２方法与结果2.1 标准溶液制备精密称取20mg人参皂苷Re对照品置于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取10mL人参皂苷Re标准溶液（0.2mg/ml）放蒸发皿中，放在水浴挥干（低于60℃），准确加入10ml水溶解，作为标准溶液2.2& 样品溶液制备 精密称取适量样品，置于50mL容量瓶中，加水适量溶解，超声30min，放置至室温，用水稀释至刻度，摇匀， 3000r?min-1离心5min,0.45um微孔滤膜过滤。若为非乙醇类液体试样，先经0.45um微孔滤膜过滤，取精密过滤后样品1mL (根据试样含总皂苷量定) 进行固相萃取。2.3& 样品溶液吸附及洗脱&
取样品溶液上清液置于收集管中（大于2ml）, 放置于Sepline全自动固相萃取系统中，按以下步骤进行吸附及洗脱（详见图1）。2.3.1 活化：在固相萃取柱中，以2.5 ml?min-1 流速冲洗70%乙醇25ml、然后以2.5 ml?min-1 流速冲洗水25ml。2.3.2 上样：以1ml?min-1 流速加1ml样品溶液于固相萃取柱中。2.3.3 洗脱：以0.8ml?min-1 流速, 依次用25ml水，25ml70%乙醇进行洗脱，收集70%乙醇洗脱液,在收集结束时氮气吹扫管理残留洗脱液50s。2.3.4 挥干：将收集的洗脱液转入50ml的离心管中，在60℃下氮气吹干。2.4& 显色与测定 在上述已挥干的洗脱液中准确加入0.2ml5%香草醛冰乙酸溶液，使残渣都溶解，再加0.8ml 高氯酸，混匀后60℃水浴上加热 10min，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸 5.0ml，摇匀后，以 1cm 比色池于 560nm 波长处与标准管一起进行比色测定。2.5 线性关系考察 精密吸取“2.1”项标准溶液0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、、1.4人参皂苷Re标准溶液（0.2mg/ml），按 “2. 3”“2.4”项下方法进行前处理并测定。以吸光度值为横坐标， 以人参皂苷Re含量 (mg) 为纵坐标进行回归计算，回归方程为y =0.8，r=0.9997，结果表明，总皂苷( 以人参皂苷Re计) 在0.038～0.268mg 范围内线性关系良好。2.6& 加样回收率试验 采用加样回收率法，精密称取4类保健品适量，分别按样品量的100%的比例各6份加入对照品 ，按“2.3”项下和“2.4”项下进行测定，并分别计算回收率(见表1-表5)，结果各品种平均加样回收率均在98.3%～102. 4% ，RSD＜2.2% ，并与传统方法（手填层析柱、人工进行柱洗脱）进行比较，表明该方法准确度良好，且离散度低于传统方法。2.7 稳定性试验& &
将显色后样品分别放置 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3h， 测定吸光值。结果表明该显色体系在1 h内吸光度基本不变，1h后吸光度有所降低，故在显色后1 h内测定。2.8 样品含量测定 取4类保健食品 ，按“2.3”项下和“2.4”项下进行测定，于 560nm 波长处测定吸光度值， 根据所得到的标准曲线计算样品中总皂苷的含量(见表6) 。表6 4类保健品中总皂苷测定结果讨论3. 1 《保健食品检验与评价技术规范(2003 年版) 》保健食品中总皂苷的测定,样品采用过大孔吸附树脂，再加显色剂显色后测定吸收值。在其操作过程中，但在柱层析时，树脂活化的时间长短以及样品在过柱时，洗脱速度快慢不一，使得测定的总皂苷结果误差较大，无法确保产品质量的检测稳定。采用莱伯泰科公司Sepline全自动固相萃取提取装置具有洗脱液流速恒定可控、树脂活化时间适当延长，大批量产品自动化处理，保证试验系统的密闭性等优点可保证结果的平行性和准确性。3.2不同厂家的大孔树脂、填料松紧和载药量也对总皂苷测定影响较大，在对大孔树脂进行品牌筛选的基础上，选择Sigma公司的XAD-2大孔树脂，莱伯泰科公司定制生产统一规格固相萃取柱，简化实验前处理过程，数据结果离散性小，平行性得到提高。3.3 前处理方法的考察 本试验分析的保健品剂型有含片、胶囊 、口服液 、袋泡茶，由于样品状态不同，因此在上柱前的样品需经离心，并经微孔滤膜过滤，保证不阻塞固相萃取提取仪进样系统。3.4 测定时间的选择 由于该反应是显色反应，测定时间的差异会导致测定结果极大的不同，因此应严格控制测定时间。样品从60℃水浴中取出后，立即用冰水浴冷却2min，精密加入冰醋酸5mL，摇匀进行测定，从而保证样品显色完全，提高检测结果的准确度。由于随着时间的推移，总皂苷的吸收值会逐渐减小，经考察显色后1 h内吸收值较稳定，因此应保证检测在1 h 内完成，从而减少检测误差。
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请教 保健食品中总皂甙的测定
请问有人做过保健食品中总皂甙的测定吗？，我用这个方法测人参总皂甙，误差很大，不知哪个步骤出问题了，谁做的的可以介绍下经验吗？
附：保健食品中总皂甙的测定
1、& & & & 试样处理
1.1 固体试样：称取1.000g左右的试样，置于100ml容量瓶中，加少量水，超声30min，再用水定容至100ml，摇匀，放置，吸取上清液1.0ml进行柱层析。
1.2 人参皂苷Re标准溶液：精确称取人参皂苷Re标准品0.020g，用甲醇溶解并稀释至10ml，即每毫升含人参皂苷Re2.0mg。
2、柱层析：
& &用10ml注射器作层析管。内装3cm Amberlite-XAD-2大孔树脂。上加1cm中性氧化铝。先用25ml70%乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25ml水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0ml已处理好的试样溶液，用25ml水洗柱，弃去洗脱液，用25ml70%乙醇洗脱人参皂苷，首席洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干。以此作显色用。
& &在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2ml2%香草醛冰醋酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.8ml高氯酸，混匀后移入5ml带塞刻度离心管中，60℃水浴上加热10min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0ml，摇匀后，以1cm比色池560nm波长处与标准管一起进行比色测定。
& &吸取人参皂苷Re标准溶液(2.0mg/ml)100ul放蒸发皿中，放在水浴挥干（低于60℃），以下操作从“3.2柱层析…”起，与试液相同，测定吸光度值。
保健食品功效成分及卫生指标检验规范(2003年版)第二部分 检验方法(二十三)
CHP 2005 第一部红参项下RADIX ET RHIZOMA GINSENG RUBRA
CHP 2005 第一部人参项下RADIX ET RHIZOMA GINSENG
CP 2005 第一部西洋参项下RADIX PANACIS QUINQUEFOLII
NY/T 316-1997 西洋参制品American ginseng products
NY/T 318-1997 人参制品&&Ginseng products
NY/T 316-1997 西洋参制品American ginseng products
保健食品中人参总皂苷的含量测定方法研究
发表时间：& &来源：《医药前沿》2014年第20期供稿&&作者：张高飞 于玥 邬晓鸥 李军
[导读] 本文建立的方法简单、便捷，准确性、重复性好，可用于保健食品中人参总皂苷的含量测定。
张高飞&&于玥&&邬晓鸥&&李军
& && && &(深圳市药品检验所&&518057)
& && && &【摘要】目的 建立保健食品中人参总皂苷含量的测定方法。方法 用水提取人参总皂苷类成分，经水饱和正丁醇萃取、氨试液洗涤除杂后，试样中的人参皂苷类成分在高氯酸的作用下与香草醛反应，产生特征的紫红色，在560nm下测定吸光度。结果 人参总皂苷在0.5mg质量范围内与吸光度线呈良好的线性关系，平均回收率为95.9%。结论 本文建立的方法简单、便捷，准确性、重复性好，可用于保健食品中人参总皂苷的含量测定。
& && && &【关键词】 保健食品&&人参总皂苷&&分光光度法
& && && &【中图分类号】R93& && && && && && && & 【文献标识码】A& && && && && && && && && && & 【文章编号】（7-02
& && && &皂苷类成分是参类中的主要活性物质, 具有滋补强壮，增强免疫，抗疲劳的功效[1]，常用的检测方法为紫外分光光度法[2-5]。目前市售含参类的保健食品有片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等，均是以总皂苷含量来评价其产品的质量和功效。其测定方法大多都是按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的方法检测[6]，在实际应用中，主要存在以下问题：1、固定的树脂柱载样量与不确定的样品总皂苷含量之间的矛盾，部分样品存在柱容量超载的情况，测定结果偏差严重。2、部分样品经过大孔树脂柱除杂后，仍存在干扰比色测定的杂质。3、操作步骤欠规范，导致测定结果重现性差。本文针对总皂苷的提取方式、以及测定过程中的参数进行研究，建立了保健食品中人参总皂苷的测定方法。
& && && &1 仪器、材料与试药
& && &&&岛津UV2450紫外分光光度计；瑞士梅特勒XS105DU电子天平；上海一恒电热恒温水浴锅；人参皂苷Re(中检所，批号822，含量88.8%)；儿童装高丽红参液，舒灵胶囊，舒慰快牌胃肠液均购自市场；水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
& && && &2&&方法与结果
& && && &2.1供试品溶液的制备
& && && &固体试样：称取1 g样品，置100 mL容量瓶中，加水80 mL，超声提取30 min， 放冷至室温，用水定容至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，进行萃取。
液体试样：吸取试样10 mL至分液漏斗中(含乙醇的保健食品，水浴挥尽乙醇)，加水至约25 mL，进行萃取。
& && && &在已处理好的试样中加入20 mL水饱和正丁醇，振摇萃取3次，取正丁醇层(必要时可离心)，合并提取液，用20 mL氨试液洗涤3次，置蒸发皿中100℃水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25 mL量瓶中，甲醇定容，即得。
& && && &2.2 标准曲线的绘制
& && && &分别精密吸取人参皂苷Re标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL具塞比色管中，水浴挥干溶剂，加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸，使残渣溶解，于60℃水浴加热10 min，冰浴冷却后，精密加入冰乙酸5 mL，摇匀，于560 nm波长处测定吸光度。取供试品溶液1 mL于10 mL具塞比色管中，自“水浴挥干溶剂”起操作。
& && && &3 方法学考察
& && && &3.1线性关系
& && && &取人参皂苷Re对照品0.01804 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，作为标准溶液，精密量取标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分别置10 mL比色管中，水浴蒸干，显色，以对照品的质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程：y=4.4807x－0.0886，r=0.9997。结果表明，人参皂苷Re对照品质量在0.5 mg之间与吸光度呈良好的线性关系。
& && && &3.2 萃取次数
& && && &取舒灵胶囊、儿童装高丽红参液，按2.1制备样品水提取液，用水饱和正丁醇分别萃取3、4、5次，结果表明，萃取3次可将人参总皂苷提取完全(表1)。
& && && &表1 萃取次数比较结果
& && &&&3.3热稳定性考察
& && && &由于正丁醇沸点较高，为此对人参皂苷的热稳定性进行考察，以便选取合适的水浴温度。取人参皂苷Re标准溶液0.6 mL，分别按60℃、100℃水浴蒸干、100℃水浴蒸干后继续放置30 min处理，测定结果分别为0.663、0.658、0.653，表明人参皂苷的热稳定性良好，因此水浴温度选为100℃。
& && && &3.4显色稳定性
& && && &取人参皂苷Re标准溶液0.3 mL，显色后每隔10 min测定其吸光度，结果表明，显色后的紫红色溶液不稳定，吸光度呈下降趋势，因此显色完成后需在10 min内完成测定。
& && && &3.5重复性试验
& && && &取舒灵胶囊按2.1下方法制备6份供试品溶液，分别测定，结果表明本方法重复性良好(表2)。
& && && &表2&&重复性试验结果
& && &&&4 讨论
& && && &本方法通过采用正丁醇溶液萃取，氨试液洗涤除杂的方法富集人参总皂苷，并直接在比色管中显色，减少转移步骤，同时考察了实验过程中的萃取次数、热稳定性、显色稳定性等参数，使得分析过程更标准化，具有除杂效果好、重复性好，操作性强的特点，经过方法学考察，结果均能满足测定需求，因此可作为保健食品中总皂苷含量的测定方法。
& && && &参考文献
& && && &[1]《天然药物化学》肖崇厚 主编，上海科学技术出版社
& && && &[2]刘华刚、肖柳华、陆中海等 含人参皂苷的中药制剂含量测定研究进展[J] 广西中医学院学报 )：106-108
& && && &[3]徐国治、胡国栋、姜平等 五补液中人参皂甙含量测定[J] 甘肃中医学院学报 )：41-42
& && && &[4]黄勇、许倩兮、彭光华 藏药雪灵芝中总皂苷含量的测定[J] 中国药师 )：94-96
& && && &[5]王盛凉、徐宁银 食品中西洋参总皂甙的比色测定法[J] 食品科学 )：46-48
& && && &[6]《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版) 中华人民共和国卫生部
请参看以上文献
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我也在测定保健食品中总皂甙，遇到了问题，想向您请教一下
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有人测过保健食品中总皂苷的含量么？
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最近在测知母提取物中总皂苷的含量，所用方法参考《保健食品检验与评价技术规范》，但是感觉测定结果与实际有所差异，不知道有哪位做过的，给点建议，万分感激！！
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才开始接触保健品，高深，学习学习
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总皂甙（以人参皂甙Re计）这种是需要经验的，很多细节上的问题吧
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小女生 发表于
总皂甙（以人参皂甙Re计）这种是需要经验的，很多细节上的问题吧
恩，第一次测，操作起来很麻烦
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ckk1987 发表于
恩，第一次测，操作起来很麻烦
多检测几次就好了
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皂苷还是比较稳定的
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小女生 发表于
总皂甙（以人参皂甙Re计）这种是需要经验的，很多细节上的问题吧
哈哈 这不是锈锈嘛~
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可能出现的情况有以下几种：1 吸附不完全（填柱步骤）。2洗脱不完全（流速控制）。3挥发温度过高（挥干乙醇步骤）。4溶解不完全（加高氯酸溶解步骤）。5移液不完全（转移移到试管步骤）。先说这么多，仔细说的话就太多了。。。多做几次就了解了。这是实验方法上可能出现的问题，剩下的就是人员、仪器等问题了。
小JB日本，屁大点儿地方，还想侵略中国，作死呢吧！
钓鱼岛是中国不可分割的国土！！
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minebmw7 发表于
可能出现的情况有以下几种：1 吸附不完全（填柱步骤）。2洗脱不完全（流速控制）。3挥发温度过高（挥干乙醇 ...
谢谢，这几个方面我都有注意！
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smile_hx1989 发表于
哈哈 这不是锈锈嘛~
是不我不该放我自己照片的
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小女生 发表于
是不我不该放我自己照片的
要放的 要放的~
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保健食品中总皂苷的测定方法来源于《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版） 第306页“保健食品中总皂苷的测定”，该方法为保健食品中总皂苷测定的“官方方法”，但在实际测定中，也存在一些问题。通过参考文献并结合实际试验操作，其进行了改进，以使其更符合实际检测的需要，具体如下：
1）减少了部分溶液的配制量，以达到节约成本，减少浪费的目的。如将香草醛溶液由原来需要配制100mL减少至配制25mL。其实，25mL的量已足够试验使用。
2）将原使用注射器作为层析管改成使用玻璃层析柱，以方便和规范试验仪器和实验操作，保证试验的精密度和准确度。
3）由于原试验使用0.2mL香草醛溶液溶解转移蒸发皿中的残渣，而在实际操作中，如此小的用量很难完全转移残渣，造成试验误差。所以将试验的整体取样量扩大1倍，香草醛溶液的使用量也相应由原来的0.2mL增加到0.4mL，这样的用量基本可使蒸发皿中的残渣溶解和转移完全，减少了试验操作的误差。
4）由于有些保健食品中总皂苷的含量较高，使得按原取样量以比色法对总皂苷进行测定的过程中，其吸光度可过高，达到2——3左右，与要求的吸光度值在0.3—0.7这个合理的范围内差距较大。所以，对保健品的取样量进行适度的增减，以使吸光度范围在0.5—0.6左右，以提高了检测的准确度。
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15个保健食品功效成分或标志性成分检测方法(征求意见
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【求助】关于保健食品中总皂苷测定的若干问题（高手帮忙！！！）
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这个帖子发布于9年零358天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人采用以下方法检验某保健食品口服液中的总皂苷含量，目前有几个问题需要请教：1、标准中Amberlite-XAD-2大孔树脂使检验成本升高很多，是否可用D101大孔树脂替代？2、本品中含有西洋参及黄芪，用人参皂苷Re是否能准确地标示其含量？3、大孔树脂在干燥的情况下会失去活性，而氧化铝一般采用干法装柱，本测定方法怎样进行装柱？4、测定的平行样结果不平行可能由哪些原因造成？具体方法如下：1试剂
1.1 Amberlite-XAD-2大孔树脂，Sigma化学公司、U. S. A.。1.2正丁醇
分析纯。1.3乙
分析纯。1.4中性氧化铝
层析用，100-200目。1.5人参皂甙Re
购自中国药品生物制品检定所。1.6香草醛溶液
称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100mL。1.7高氯酸
分析纯1.8冰乙酸
分析纯1.9人参皂甙Re标准溶液：精确称取人参皂甙Re标准品0.020g，用甲醇溶解并定容至10.0mL，即每毫升含人参皂甙Re2.0mg。2仪器
2.1比色计2.2层析柱3实验步骤3.1试样处理3.1.1固体试样：称取1.000g左右的试样 （根据试样含人参量定），放100mL容量瓶中，加少量水，超声30min，再用水定容至100mL，摇匀，放置，吸取上清液1.0mL进行柱层析。3.1.2液体试样：含乙醇的补酒类保健食品，吸取1.0mL试样放水浴挥干，用水浴溶解残渣，用此液进行柱层析。
非乙醇类的液体试样：吸取1.0mL试样（假如浓度高、或颜色深，需稀释一定体积后再取1.0mL）进行柱层析。3.2柱层析：用10mL注射器作层析管，内装3cmAmberlite-XAD-2大孔树脂，上加1cm中性氧化铝。先用25mL70%乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0mL已处理好的试样溶液（见3.1），用25mL的水洗柱，以洗去糖份等水溶性杂质，弃去洗脱液，用25mL70%乙醇洗脱人参皂甙，收集洗脱液于蒸发皿中，放水浴挥干。以此作显色用。3.3显色：在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL5%香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣都溶解，再加0.8mL高氯酸，混匀后移入5mL带塞刻度离心管中，放在60℃以下的水浴上加温10min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0mL，摇匀后，以1cm比色池于560nm波长处与标准管一起进行比色测定。3.4标准管：吸取人参皂甙Re标准溶液（2.0mg/mL）100ml放蒸发皿中，放在水浴挥干（低于60°C），或热风吹干（勿使过热），以下操作从“3.2柱层析…”起，与试样相同。测定吸光度值。
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还是没人办帮啊，真的很急，高手在哪里啊？
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lisafone 本人采用以下方法检验某保健食品口服液中的总皂苷含量，目前有几个问题需要请教：1、标准中Amberlite-XAD-2大孔树脂使检验成本升高很多，是否可用D101大孔树脂替代？2、本品中含有西洋参及黄芪，用人参皂苷Re是否能准确地标示其含量？3、大孔树脂在干燥的情况下会失去活性，而氧化铝一般采用干法装柱，本测定方法怎样进行装柱？4、测定的平行样结果不平行可能由哪些原因造成？1.这个，好像是不可以2.不能3.谁告诉你大孔树脂要干装，谁又告诉你氧化铝不能湿装？4.平行样结果不平行是因为操作不平行造成的，不会有别的原因
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谢谢楼上，能否详细指正一下，这个方法是湿法装柱的吗，但湿法装柱要求洗脱液必须保持在柱体之上，10ml注射器能达到吗？
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