高通量测序技术在测序方面的优点与应用
&技术推动了测序行业向未来迈出新的一步，高通量测序技术的出现促进了日益成熟的测序技术的发展，他在很多方面做出了突出的贡献。
一、测基因组方面：
1. re-annotation of the genome。测序难免有错误，通过反复的深度测序，可以将这种错误降低到很小。另外通过反复测cDNA library，纠正了以前splicing位点的错误。
大规模地，便宜地，快速地测物种的序列，比如果蝇的subspecies的序列，对于理解进化非常有必要。
2.&疾病相关基因以及突变的hot spot的发现。以前的测序可以通过设计很多已知基因的引物，对来自病人的很多sample的平行测序，可以发现它们突变的位点集中在哪里，然后通过其它功能实验（比如酶活变化，致癌能力）来确证。现在的测序技术可以cover whole exon。比如收集某个病症的1000个sample，通过对这些sample平行测序，有可能de novo地发现新的致病基因突变。同理，从phenotype到genotype（比如狗的个体大小，最简单的是单基因导致的），理论上如果收集足够的样本，就可以用统计去除个体差异的背景，分离到这个genotype。
3.&甲基化的pattern。通过亚硫酸氢钠处理后甲基化的胞嘧啶C不变，而普通胞嘧啶变成U的原理，可以定量地看在genome上DNA甲基化的pattern。
二、测cDNA方面：
1.&现有的技术已经基本上取代了Chip-CHIP。以前array的CHIP，在定量方面有很大的缺陷，原来差异在100倍的，反应在信号的上的差异可能只有30倍，信号饱和。现在的技术是通过hit目的片段的次数来定量的，也就是表达量越高，基因越大，被测序的次数也越多。这种定量比CHIP要准确很多。
2.&完全并且更好地取代array。比如细胞分化过程，应激反应过程……中基因表达的变化。可以通过cDNA库的测序，更加定量地，可重复地记录这个过程。有些物种的array没有商业化，如果自己设计定制array成本很高。而深度测序技术无需自己定制array就可以直接进行。在这种情况下，现在的测序技术成本已经比array要低了。
总之高通量测序技术的应用会越来越广泛，因为高通量测序能产生大量的数据做以分析和参考。这会导致哪些纯粹靠生化或者分子生物学技术的实验室将会很难生存，每个学生物的学生都必须掌握生物信息学，统计学的重要原因。高通量测序技术不仅只是来测基因组，它还可以作为readout。这个就是技术促进生物学研究的很好的例子。之后一定有更多的生物研究行业开始广泛的应用高通量测序技术。
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选择合适高通量测序公司一点建议
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从基因组、转录组、表观基因组、调控组、宏基因组等各个生物层面上对生物体进行信息解读，是理解复杂生命机理的关键。新一代测序技术的飞速发展，为我们从各个角度观测生命系统提供了可能。新一代测序技术又称高通量测序，是对第一代DNA测序技术颠覆性革命，以公司推出基于焦磷酸测序技术的454测序仪为标志，代表着新一代测序技术的推广和应用。随后的2006年，美国Illumina公司进军新一代DNA测序市场，研发出了自己测序平台—Solexa测序仪。2007年，美国ABI公司也推出了他们的第二代测序平台—SOLiD测序仪。目前这三大测序平台是普遍使用的DNA测序仪，从市场销售情况来看，illumina测序仪成为测序领域主流。每年发表的测序文章中，基于illumina测序平台占了绝大部分。
高通量测序技术的风起云涌，测序价格的一降再降，各个测序公司的激烈竞争，使得新一代测序已然成为分子生物学实验室中的平民化工具。该技术极大推动了生命科学的发展，让人们可以更方便快捷地洞察生物学的奥秘。由于仪器设备和专业的生物信息分析团队限制，很多老师的项目都只能与公司合作。现在市场上与测序相关公司近百家，虽然高通量测序本身是一项高端技术，需要一定的实力，但跟其他行业一样，也是鱼龙混杂、泥沙俱下，因此选择合适的测序方案，性价比高的测序公司对项目的顺利开展至关重要。与各位老师接触的过程中，发现了一些问题，整理一下作为给即将利用该技术老师一个参考。
首先是公司的选择。对于任何一家公司都有其优势和不足，选择时主要有两点可供参考：第一该公司是否有自己的测序平台？目前有自己测序平台的公司并不多，如果没有自己的测序平台，争取到项目后就要交给别的公司去测序，这样在测序质量和项目周期上就没法保证，有时会严重耽误项目的进程，延误文章的发表，甚至被别人抢发。光有测序平台还不成，还要看是什么样的测序平台？很多老师都有个误区，觉得测序质量各个公司都差不多，其实这样的想法是不正确的。不同的测序平台数据质量和产出量是不一样的，甚至同样的Hiseq2000测序平台，前年买的和今年买的测序仪在测序质量上都会有一定出入。可以让公司提供已完成项目的数据Q30和Q20，作为一个参考，公司自己制定其他数据评判标准与标准的Q30是两个概念，结果很漂亮但不代表真实数据质量。
第二是公司是否有强大的生物分析团队？有时花了不菲的价格，测了一堆数据，却无法完成后续数据挖掘分析，将其转化成可靠的结果，只能困在电脑里面，眼看着数据资源的优势在一点点流逝而毫无办法。曾经碰到一个老师，测了上百张生物芯片的数据，却没有给分析出结果，守着一堆数据不断找公司进行后续挖掘。生物信息分析不是简单的跑跑流程，靠某一软件进行简单基因功能预测，这样得出的结果到底有多大的可信度，没人敢保证。比如基因组从头测序，目前有很多公司提供该项服务，但真正有实力做好这项工作的公司有几家？从公司有无从头测序文章，文章发在什么杂志上就能知道这家公司是否有雄厚的生物信息分析功底，是否可以做相关项目。
其次是价格的衡量。无论什么样的交易，价格永远是核心问题中的核心。俗话说，一分钱一分货，便宜的但不一定是好的。比如说同样的4Gb转录组测序分析，不同的公司价格相差很多，这是为什么？站在老师的角度，可以考虑一下几点。样品检测是否使用了目前标准的四种检测方法，并将检测报告及时发送给老师？测序文库构建是否采用了illumina Truseq RNA/Samll RNA Sample Pre Kit及其推荐的配套试剂，而不是使用其他试剂公司提供的配套试剂？比如说有的公司会说建库按照illumina Truseq RNA指定方法进行建库，这里面就存在着问题，可能是采用了illumina Truseq RNA的protocol，但并没有采用原装试剂。如果样品的质量和建库质量无法保证，会从数据源头上导致低丰度转录本信息的丢失和数据偏好性。替代试剂的采用虽然降低了成本，但同时也降低了测序质量。4Gb的数据质量是clean data还是Raw data。clean
data是指除去了接头及低质量序列的数据，跟raw data完全两码事。同样，后面生物信息分析要看公司提供的仅仅是简单跑流程，还是根据科研目标，选择分析软件，调整参数，对结果提出合理的解释，给出最出色的问题解决方案。
最后是后续服务。合同没有签时，可能将老师当上帝，小心伺候着。但一旦签了合同，打了项目款，后面就没有了保证。最后结题报告发给老师，如何解读报告以及相关问题，可能连人都找不到了，因此后续服务也是非常重要的一点。
以上是自己工作时的一点感悟，希望能够给各位准备或者打算做高通量测序老师和同学一些参考。我会随时更新这篇博文，将相关问题罗列出来，在做相关项目时少走或者不走弯路。
原文链接：/blog-139.html
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|个人分类:|系统分类:|关键词:生物技术 创新创业 分子诊断 多重PCR
上周在旧金山的JP摩尔根医疗大会上拜会了十多个风投公司和诊断公司的主管们。在和其中一个大型诊断技术公司的主管讨论的时候他们画了这样一张图：他们认为，现在的分子诊断市场是定量实时qPCR为主，多重PCR(mPCR)开始引起大家的重视，可是早晚会被高通量测序（NGS）所替代。所以，他们在选择技术平台的时候就有两条道路：直接进入NGS，还是经过mPCR过度一下？我觉得这个认识有个误差，他把NGS和mPCR对立起来了或者对等起来了。从表面上看，PCR和NGS都是检测DNA分子，好像是一样的，可是实际上不是那么回事。分子诊断需要有三个主要步骤：核酸提取（标本处理），信号扩增，信号检测。而NGS实际上是一个高通量的，高精确度的检测平台，并没有完成信号扩增和标本处理等步骤。而没有信号扩增在许多诊断来说都是不行的。我以前讨论过，各种诊断实际上玩的都是信噪比，疾病相关的信号在病人标本中总是躲藏在背景噪音里面，而如何能快速，准确，便宜地去掉噪音，检测到信号，就是诊断的真谛了。就拿癌症的个体化医疗来说，需要检测几个，几十个基因里面的几百个突变，然后根据突变谱来决定用什么药。所以那几百个突变就是信号，而整个基因组DNA就是背景噪音。更复杂的是，突变有时仅仅在一小部分细胞中有。所以如果你把病人标本拿来，不做任何信号扩增就去测序，得到的绝大多数信息是正常细胞基因组的信息。在这么强大的背景噪音下，检测的特异性和敏感性就都成问题。不但如此，因为花费大量的人力和财力来做测序得到的99.99%都是无用的信息，相当于高通量地产生垃圾。所以，即使有NGS，人们还是离不开PCR，更离不开mPCR. 除非是三代测序，做单细胞全基因组测序，而且能预先拿到疾病特异性的单细胞标本。那又是一个新的问题和挑战。换句话说，NGS不是要淘汰mPCR, 它更需要mPCR喂它充满疾病信号的文库来测序。如何更好地用mPCR配合NGS才是值得探讨的问题。从去年十月份伴随Illumina公司在亚洲走了几个国家路演以后，我就在思考如何把iCubate技术平台，PPI等技术和NGS接轨的问题。在此之前，我们已经开始销售用iCubate为免疫组库测序自动建库的卡盒，美国，台湾，韩国，日本，中国都有客户。现在我们正在开发其他targeted sequencing panel, 比如结肠癌相关的突变等。而我们的最终目的，是研发出一套软件，把人类基因组所有外显子扩增的引物都设计好，让用户自己挑选基因，合成引物，放到我们卡盒中就成为他们的产品，下接NGS平台（主要是Illumina的几个测序平台，也可以用Life的）。总之，不能简单地认为NGS可以淘汰PCR或者多重PCR。不能忘记，诊断永远是在玩大海捞针的游戏：信号是针（突变），背景噪音是大海（基因组）。
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