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蛋白胶内消化及质谱分析集中讨论
从2D胶上挖下的点不少，可是就是无法得到理想的质谱结果，真是让人苦恼，各位做蛋白质组的同道，一起讨论一下，把您的经验和遇到的问题以及解决方案给大家介绍一下。先在此提出一些问题1，待作质谱分析的PAGE胶保存方法。2，4度保存的PAGE胶半年时间（或其它时间）后还可以做质谱分析吗？3，手工切胶时使用的工具。我是用注射器把针头前端磨平，然后硅烷化。4，切胶后是否一定需要切成1mm3的小块，如何切碎？切碎后如果被枪头吸掉如何解决？5，银染和考染凝胶块的脱色方案。脱色时间，次数，脱色液成分等6，使用碳酸氢铵缓冲液的浓度，25mM, 50mM, 100mM，经常使用哪个，感觉效果如何？7，trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量，或其它？8，如何进行消化？9，是否需要考虑溶胀凝胶用液体的体积？如果是，加trypsin的体积是多少？10，加trypsin后是否应放4度一段时间，如果是，要多长时间？11，如果加trypsin的体积太少，是否应补充碳酸氢铵buffer，以使凝胶充分溶胀？12，消化用溶液的体积是否应该超过凝胶体积？即是否应该使凝胶完全浸没在溶液中？还是只要使凝胶充分溶胀即可，而不需浸没凝胶。13，消化时间如何掌握？以使消化充分而自切峰少。14，不同来源酶的效果如何？15，从消化完的凝胶中抽提肽片段的方案。抽提溶液组成，抽提几次，抽提温度。超生对抽提帮助有多大？16，抽提溶液抽真空方案。有人建议不要将抽提液完全抽干，是否有意义？因为如果一次抽很多样品，根本无法保证抽的速度完全一致，可能有的已干，而有的还有很多液体。17，溶解抽干消化产物的方案。溶解液组成，加入量。如果作MALDI，是否可以将matrix solution直接加入抽干产物中。如果是作ESI，溶解液中使用TFA，而LC用溶液中使用甲酸，是否会对结果有影响？18，MALDI点靶方案。好了，暂时只想到这么多。各位同道可以针对以上问题提出自己的解决方案，也可以把自己的经验教训告诉大家，或者提出自己的问题。谢谢提供这个空间，使我们能在此共同学习提高。补充：可以检测到的蛋白量范围是多少？是否考染可以看到的点都可以质谱鉴定出来？银染点鉴定效果如何？是因为里做蛋白质组的人不太多，还是各位不愿把自己的经验与大家分享，或者是近期内做蛋白质组的人不常来。我先来个抛砖引玉吧。把我一些不成熟的做法给大家看看，肯定有很多疏漏之处以及有待改进的地方，请大家多提宝贵意见。1，我一般是把染好的胶用水洗几遍，然后用保鲜膜包起来，放于4C。2，我大多数胶点的质谱做得都不好，但有一次一个保存半年左右的样品竟然作出非常漂亮的ESI二级质谱。3，切胶成小块很容易被枪头吸走，所以我有时只是将凝胶切成较大块，而不切得太小。4，使用常规考染脱色方法，银染用铁氰化钾和硫代硫酸钠。但考染脱色特别慢，不知有何高招可以加快。5，NH4CO3浓度我经常使用25mM，文献中50mM和100mM也常见。Merck的产品介绍中声称可以使用无盐水进行消化。6，我一般根据凝胶大小决定Trypsin使用体积，2－5ul之间。如果凝胶没有充分溶胀，我会再加一些buffer，4C放置后再把多余的液体吸掉（不知是否有必要）。7，37C消化过夜是我最常用的选择。8，我只用过Merck的TPCK modified trypsin。现在Merck新出了重组酶，另外Promega的酶经常在文献中看到，但没用过；好像现在Sigma也出了测序级胰酶。据我所知好象做的人不多，不是不愿意分享。再说这个专题建的时间还短，希望随着来访的战友越来越多，参与讨论的人也会多起来。蛋白质2-D我已经做完了，正要接着做质谱分析，在质谱方面，我还是一窍不通，希望在此能与大家交流这方面的心得。Q:4度保存的PAGE胶半年时间（或其它时间）后还可以做质谱分析吗？A:胶上的蛋白质带只要没有扩散就可以。Q:手工切胶时使用的工具。我是用注射器把针头前端磨平，然后硅烷化。A:我是直接用刀片切的带和点。Q:切胶后是否一定需要切成1mm3的小块，如何切碎？切碎后如果被枪头吸掉如何解决？A:不一定要切成这样，我们的目的是使脱色干净，胶内蛋白尽可能被酶切。Q:银染和考染凝胶块的脱色方案。脱色时间，次数，脱色液成分等A:银染，3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O,时间15－20MIN,加水中止反应，加100％ACN 10min，然后冻干。个人觉得比铁氰化钾和硫代硫酸钠好。 考染，100mM NH4HCO3/30％ ACN,脱色干净。加100％ACN 10min，然后冻干。Q:trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量，或其它？A:看蛋白的量而定。一般为1:20，我觉得较理想。Q:加trypsin后是否应放4度一段时间，如果是，要多长时间？A:放4度是为了让酶尽量进入胶内，与蛋白充分接触。一般为1个小时。Q:可以检测到的蛋白量范围是多少？是否考染可以看到的点都可以质谱鉴定出来？银染点鉴定效果如何？A:这得看你使用哪种质谱，MALDI-TOF的灵敏度较高，而ESI的分辨率较高。现在质谱种类很多，各种质谱可以进行串连，产生了灵敏度和分辨率都比较理想的质谱，如Q－TOF.银染的小点用MALDI-TOF较好，考染的点用LC-MS/MS鉴定的蛋白较准确。暂时这么多，下次再说。我也要做质谱。想请以下试剂用哪个公司最好：胰蛋白酶　　乙腈　　DTT　碘乙酰铵　碳酸氢铵　甲酸　TFA 另外，做ESI-LC/MS用什么型号的柱子？请高人指教多谢daijie6，听君一席话，胜读十年书。银染用H2O2脱色，会不会因为其氧化作用导致肽片段上的氨基酸残基被氧化，因为H2O2的氧化能力还是挺强的。您认为H2O2更好是个人习惯，还是有具体的原因？Q:trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量，或其它？A:看蛋白的量而定。一般为1:20，我觉得较理想。如何对切下胶块进行定量？在有大量样品的情况下，每个样品都要分别对待，加不同量trypsin吗？胶块大小和蛋白量不一定成比例，比如要使一个胶块充分溶胀要加10uL溶液，可是只要2ul trypsin（根据比例）。这时是否只加2ul trypsin，还是加完trypsin后再补充8ul buffer？如果要补充buffer，是等4C放置以吸收trypsin后再加，还是直接加入，然后4C放置？hillson wrote:我也要做质谱。想请以下试剂用哪个公司最好：胰蛋白酶　　乙腈　　DTT　碘乙酰铵　碳酸氢铵　甲酸　TFA 另外，做ESI-LC/MS用什么型号的柱子？请高人指教普通化学试剂可以选用Sigma公司，胰酶可从Roche或Promega获得，乙腈要用HPLC级，甲酸、TFA、NH4CO3我用Sigma的，DTT是Sigma、iodoacetylamide最早用Sigma的，现在我用acros的。ESI-LC/MS用HPLC柱子，联系质谱时他们会提供，一根柱子上万元，只做几个样品没必要买。谢谢pengkp。我已订了试剂，sigma的太慢了，我买了其他公司的。现在merk的乙腈比较便宜，400元/4L。不客气，以后多交流，目前国内做这方面的人还不多，有很多问题找不到人讨论，很是郁闷。老板对这方面也不懂，无法指导，只好自己摸索。不知你那边如何？我在北京，你是在哪儿？以后有机会多聊聊。蛋白质经酶解后的分子量范围是多少？据agilent的资料，粒径300A的柱子适合做大于4KD的肽段，80A的适合做小于4KD的肽段。但是他们的其它资料中，做质谱时用的柱子是zorbax sb300(粒径是300A）。难道酶解后的肽段大于4KD？pengkp,使用H2O2脱色时，时间不要太长，浓度不要太高。另外它的氧化也毕竟有限，对于后面的酶切来说，影响不会太大。而且H2O2脱色不会使样品的盐浓度增加，这是它的一个优点。我现在也在做质谱，碰到好些问题，想到外面去学一下，不知道有哪位知道哪里的质谱技术比较好，我听说是湖南师大，只是觉得那里离太远，郁闷中。2D胶干燥若干年后仍有人把点打出来。若近期不打，较之4度保存，干胶保真度为佳。原则是蛋白不变质。有没有用SELDI做过肽谱的?无法一一回复，建议看我们的网站．抱歉刚摸索了２DE，正准备下一步的质谱分析，来这里收获颇丰，感谢！请问西南地区哪有MALDI-TOF？请教各位：胶内酶切对试剂要求那么高，那么考染时是不是也需要优质的试剂呢？我想做colloida coomassie brilliant blue染色，请问那些甲醇、正磷酸、硫酸胺是不是也要订sigma的？leelee wrote:请教各位：胶内酶切对试剂要求那么高，那么考染时是不是也需要优质的试剂呢？我想做colloida coomassie brilliant blue染色，请问那些甲醇、正磷酸、硫酸胺是不是也要订sigma的？国产分析纯pengkp wrote:普通化学试剂可以选用Sigma公司，胰酶可从Roche或Promega获得，乙腈要用HPLC级，甲酸、TFA、NH4CO3我用Sigma的，DTT是Sigma、iodoacetylamide最早用Sigma的，现在我用acros的。ESI-LC/MS用HPLC柱子，联系质谱时他们会提供，一根柱子上万元，只做几个样品没必要买。我也打算自己做胶内酶切，目前正准备订试剂，想进一步请教：甲酸、TFA、NH4CO3、DTT、IAA、CaCl2这些是否都需要最高纯度的，因为我发现即使是sigma的产品，同样的产品种类也有很多，还有溶于 不同溶剂的，而且价格相差很大，正发愁到底该订哪一种，请高手再给详细一点的指点，谢谢！（不好意思，本人比较愚钝）再说具体一点，比如anhydrous TFA，有peptide mapping用的，100g $60.8，proteinsequencing用的，40ml $132.6，都是liquid，density1.49g/ml, distilled from chromium oxide under nitrogen, treated with aluminum oxide, then redistilled rom dithiothreitol under nitrogen,前者标了纯度99＋％，后者没标，为什么都是液体一个单位是g，一个用ml呢？到底该订哪种呢？还有，NH4CO3就用minimum 99.0％的可以不可以，还是BioChemika Ultra &99.5% ,或者puriss. meets analytical specification ，99-101%，还是 purum p.a. &99.0%刚到，有几个问题有点看法：* trypsin使用量。是根据胶块大小，还是根据估计蛋白含量。应该将胶颗粒（还是1立方mm为佳，要不影响脱色和消化的）覆盖，TRYPSIN应是过量的。*银染用H2O2脱色，时间不要太长，浓度不要太高。似乎氧化是值得考虑的问题。对不同样本（蛋白质分子），时间、浓度难掌握，分子的基团受氧化程度不一，对后面的鉴定分析有影响。有不用H2O2的方法供选择。*2D胶干燥若干年后若干年倒不是问题，问题是你要分析的目标蛋白质有无受影响。另可加甘油保存蛋白质样品（液态或干胶时）*有没有用SELDI做过肽谱的? 一年前的信息，SELDI后面的MALDI还不能做肽谱，现在是否该公司有新的仪器（能做肽谱）？？那位有信息？*若手工操作，污染很头痛的，银染时的KERATIN防不胜防，各位注意啊 *总的说，我们刚起步。2D电泳除了高通量和好看外，其工作强度/难度和灵敏度是瓶颈。许多重要的蛋白质在2D上看不到。谢了，欢迎大家指正
您的位置： &&质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，其基本原理Joseph&John&Thomson是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。第一台质谱仪是英国科学家弗朗西斯·阿斯顿于1919年制成的。阿斯顿用这台装置发现了多种元素同位素，研究了53个非放射性元素，发现了天然存在的287种核素中的212种，第一次证明原子质量亏损。他为此荣获1922年。
种类非常多，工作原理和应用范围也有很大的不同。从应用角度，质谱仪可以分为下面几类：
有机质谱仪：由于应用特点不同又分为：
①气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）
在这类仪器中，由于质谱仪工作原理不同，又有气相色谱-四极质谱仪，气相色谱&-飞行时间质谱仪，气相色谱-离子阱质谱仪等。
②液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）
同样，有液相色谱-四器极质谱仪，液相色谱-离子阱质谱仪，液相色谱-飞行时间质谱仪，以及各种各样的液相色谱-质谱-质谱联用仪。
③　其他有机质谱仪，主要有：
基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS），傅里叶变换质谱仪（FT-MS）
无机质谱仪，包括：
①&火花源双聚焦质谱仪。
②&感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）。
③二次离子质谱仪（SIMS）
但以上的分类并不十分严谨。因为有些仪器带有不同附件，具有不同功能。例如，一台气相色谱-双聚焦质谱仪，如果改用快原子轰击电离源，就不再是气相色谱-质谱联用仪，而称为快原子轰击质谱仪（FAB&MS）。另外，有的质谱仪既可以和气相色谱相连，又可以和液相色谱相连，因此也不好归于某一类。在以上各类质谱仪中，数量最多，用途最广的是有机质谱仪。
除上述分类外，还可以从质谱仪所用的质量分析器的不同，把质谱仪分为双聚焦质谱仪，四极杆质谱仪，飞行时间质谱仪，离子阱质谱仪，傅立叶变换质谱仪等。
Joseph John Thomson/质谱
质谱技术发展很快。随着质谱技术的发展,质谱技术的应用领域也越来越广。由于质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，因此，质谱技术广泛的应用于化学，，环境，能源，，运动医学，科学，生命科学，材料科学等各个领域。质谱仪种类繁多，不同仪器应用特点也不同,一般来说，在300C左右能汽化的样品，可以优先考虑用GC-MS进行分析，因为GC-MS使用EI源，得到的质谱信息多，可以进行库检质谱仪索。毛细管柱的分离效果也好。如果在300C左右不能汽化，则需要用LC-MS分析，此时主要得分子量信息，如果是串联质谱，还可以得一些结构信息。如果是生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析，主要得分子量信息。对于蛋白质样品，还可以测定氨基酸序列。质谱仪的分辨率是一项重要技术指标，高分辨质谱仪可以提供化合物组成式，这对于结构测定是非常重要的。双聚焦质谱仪，傅立叶变换质谱仪，带的飞行时间质谱仪等都具有高分辨功能。
质谱分析法对样品有一定的要求。进行GC-MS分析的样品应是有机溶液，水溶液中的有机物一般不能测定，须进行萃取分离变为有机溶液，或采用顶空进样技术。有些化合物极性太强，在加热过程中易分解，例如有机酸类化合物，此时可以进行酯化处理，将酸变为酯再进行GC-MS分析，由分析结果可以推测酸的结构。如果样品不能汽化也不能酯化，那就只能进行LC-MS分析了。进行LC-MS分析的样品最好是水溶液或甲醇溶液，LC流动相中不应含不挥发盐。对于极性样品,一般采用ESI源，对于非极性样品,采用APCI源。
发展史/质谱
早在19世纪末，E.Goldstein在低压放电实验中观察到正电荷粒子，随后W.Wein发现正电荷粒子束在磁场中发生偏转，这些观察结果为质谱的诞生提供了准备。
世界上第一台质谱仪于1912年由物理学家Joseph John Thomson（1906年获得者、英国教授）研制成功；到20世纪20年代，质谱逐渐成为一种分析手段，被化学家采用；从40年代开始，质谱广泛用于有机物质分析；1966年，M.S.B，Munson和F.H. Field报道了化学电离源（Chemical Ionization，CI），质谱第一次可以检测热不稳定的生物分子；到了80年代左右，随着快原子轰击（FAB）、电喷雾（ESI）和基质辅助激光解析（MALDI）等新“软电离”技术的出现，质谱能用于分析高极性、难挥发和热不稳定样品后，生物质谱飞速发展，已成为现代科学前沿的热点之一。由于具有迅速、灵敏、准确的优点，并能进行分析和翻译后修饰分析，生物质谱已经无可争议地成为中分析与鉴定肽和蛋白质的最重要的手段。质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一项突破性进展。如用质谱法作为（GC）的检测器已成为一项标准化GC 技术被广泛使用。由于GC-MS 不能分离不稳定和不挥发性物质，所以发展了液相色谱（LC）与质谱法的联用技术。LC-MS可以同时检测糖肽的位置并且提供结构信息。1987年首次报道了（CE）与质谱的联用技术。CE-MS 在一次分析中可以同时得到迁移时间、分子量和碎片信息，因此它是LC-MS的补充。在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。质谱的发展对基础科学研究、、以及其它工业、民用等诸多领域均有重要意义。
质谱随着科学技术的进步，20世纪80年代以来，有4种软电离技术产生，分别为等离子体解吸（PD-MS）、快原子轰击（FAB ）、电喷雾（ESI ）和基质辅助激光解吸/电离（MALDI）。
质谱书籍等离子体解吸的原理是：采用的核裂变碎片作为初级粒子轰击样品使其电离，样品以适当溶剂溶解后涂布于0.5-1um 厚的或箔上，核裂变碎片从背面穿过金属箔，把大量能量传递给样品分子，使其解吸电离。在制备样品时，采用硝化作为底物使得PD-MS 可用以分析分子量高达14 000 的多和样品。快原子轰击的原理是，一束高能粒子，如氩、氙原子，射向存在于液态基质中的样品分子而得到样品离子，这样可以得到提供分子量信息的准分子离子峰和提供化合物结构信息的碎片峰。快原子轰击操作方便、灵敏度高、能在较长时间里获得稳定离子流。当用于绝大多数生物体中及其衍生物的分析时，可测分子量达6000。而且在该质量范围内，其灵敏度远高于在15000 范围内新一代全器的灵敏度。此外，Camim 等采用FAB-MS 分析从Hafnia alvei中得到的四个寡糖组分，检测到了NMR 不能观测到的寡糖、并揭示了寡糖结构的非均一性。电喷雾电离的原理是：喷雾器顶端施加一个电场给微滴提供净；在高电场下，液滴表面产生高的电应力，使表面被破坏产生微滴；荷电微滴中溶剂的蒸发；微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。为了降低微滴的表面能，加热至200～250℃，可使喷雾效率提高。FAB-MS 可以显示碎片离子，但只能产生单电荷离子，因此不适用于分析分子量超过分析器质量范围的分子。ESI 可以产生多电荷离子，每一个都有准确的小m/z 值。此外还可以产生多电荷母离子的子离子，这样就可以产生比单电荷离子的子离子更多的结构信息。而且，ESI-MS 可以补充或增强由FAB 获得的信息，即使是小分子也是如此。
质谱仪基质辅助激光解吸离子化质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS) 是19 世纪80 年代末问世并迅速发展起来的质谱分析技术。这种离子化方式产生的离子常用(time of flight，TOF)检测器检测，因此MALDI常与TOF一起称为基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。MALDI-TOF-MS技术，使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革，从此迈入生物质谱技术发展新时代。该技术的特点是采用被称为“软电离”方式，一般产生稳定分子离子，因而是测定生物大分子分子量的有效方法，广泛地运用于，尤其对蛋白质、核酸的分析研究已经取得了突破性进展。MALDI-MS 在糖研究中的应用，也显示出一定的潜力和应用前景。另外在高、、金属有机化学、等领域也显示出独特的潜力和应用前景，已经成为广大科技工作者研究于分析大分子分子质量、纯度、结构的理想工具。其广泛应用于生物化学领域，
样品导入/质谱
质谱方法的一个重要特点就是它对各种状态的样品都具有非常高的灵敏度，而且在一定程度上与待测物分子量的大小无关。但是，因为质谱仪的质量分析器安装在真空腔里，分析样品只有通过特定的方法和途径才能被引入到离子源，并被离子化，然后被引入质量分析器进行质量分析。一般把所有用于完成这种样品引入任务的部件统称为样品引入系统。而样品引入方式则可分为直接引入法和间接引入法。间接引入法又可细分为色谱引入、膜进样等。
质谱分析原理直接引入法是将低挥发性样品直接装在上，将探针送入真空腔内，然后给探针通大电流加热，使探针的温度急剧上升至数百度（一般不超过 400 ℃），样品分子受热后挥发形成蒸气，该蒸气受真空腔内真空梯度的作用被直接引入到离子源中离子化。由于温度对样品的挥发度影响较大，需精确控制温度，但这也使固体选择性进样成为可能。这种方法主要适合于较低挥发性、热稳定性好的样品。而对于难挥发和热不稳定样品，主要采用解吸电离（DI）的办法。色谱法是质谱中应用最多的样品间接引入法，这种进样系统的研究热点之一就是质谱和色谱之间的技术。GC的样品可通过直接导入到质谱的离子源。如果GC的载气流量较大，可在离子源前面加一级真空或者采用喷射式分离器来分流载气（如 He 等小分子气体）和富集待测物。LC-MS 常采用电喷雾技术从色谱流出物中提取样品同时进行样品的引入，该方法的优点在于它不需对仪器进行复杂的维护和调试，而且具有很高的灵敏度和极快的响应速度。除了经典的 GC、LC 被用于质谱样品引入外，超临界流体色谱（SFC）和毛细管电泳（CE）也可与质谱技术联用，大大扩大了样品引入的灵活性。如果采用DI技术，则、等都可用到质谱分析中来，在效率允许的情况下，可大大降低成本。
质谱仪近年来，随着质谱在环境分析中的普及，膜进样技术逐渐得到重视。在常见的膜进样系统中，大多采用硅聚合物制作半透膜，这种半透膜能够让某些小分子有机物通过膜壁进入系统，而样品中大量的基体、溶剂则不能透过，因此，膜进样技术（MI）特别适宜于对低含量待测物的连续在线监测，如MI-MS，可望在环境监测、工业控制等方面获得良好的应用。 在质谱仪器的校正和有机物结构鉴定中经常用到炉式或池式进样，绝大多数的商品仪器都配备了这种进样系统。该系统能够长时间提供稳定的样品浓度，方便对仪器进行校正和对待测物进行慢速扫描，从而获得精确的信号。当然，这种方法要求样品具有较低挥发性和较好的热稳定性，此外，使用该方法样品耗量较大。
离子源/质谱
在早期的质谱研究中，涉及的样品一般为无机物，检测目的包括测定原子量、同位素丰度、确定元素组成等。针对这些要求，需要采用的离子源主要包括电感耦合等离子体（ICP）、等离子体炬（MPT）和其他微波诱导等离子体（MIP）、电弧、火花、辉光放电等，几乎能够用于原子发射光谱的激发源都可用。 目前质谱的检测对象主要是有机物和生命活性物质，需要用到一些比较特殊（相对于AES 激发源）的电离源。这些电离源可分为 4 类，即（EI）、（CI）、（DI）、（SI），如下表所示。除 EI 外，每种电离源都能够同时得到大量的正离子和负离子，而且分子离子的种类跟离子化过程中的媒介（medium）或基体（matrix）有关。比如，CI 能够产生（M H） 、（M NH4） 、（M Ag） 、（M Cl）-等离子作为分子离子，也能够产生类似的碎片离子。常见的用于有机物分析的质谱电离源表 电离源 &离子化试剂& 适宜样品 电子电离（EI）&电子&气态样品化学电离（CI）&气体离子气态样品 解吸电离（DI）&光子，高能粒子&固态样品喷雾电离（SI）&高能电场热溶液 电离源产生的不同离子之间能够互相反应，使得电离的结果更加丰富而复杂。比如在EI的作用下能够产生大量的离子，内能较大的离子在与中性分子（如He）碰撞时能够产生更多的碎片离子。这种离子-分子反应一般很难进行完全，往往在得到许多碎片离子的同时还保留着部分母体离子，不过，通过增加离子内能（如调节碰撞时间，EI 能量和中性粒子数量等），可以促使这种离子-分子的反应进行完全；反之，如果降低离子内能，则可能得到稳定的该离子而不是该离子的碎片。相对 EI 而言，CI，DI 和 SI 都是软电离源。借助激光和基体辅助，DI甚至能够对沉积在某个表面的难挥发、热不稳定的固体化合物进行瞬间离子化，得到比较完整的分子离子。SI的出现解决了生物大分子的进样问题，给质谱法在生命科学领域的应用，尤其是大分子生命活性物质如蛋白质、DNA 等的测定提供了非常便捷有效的手段，其作用也因其创立者获得 2002 年的化学奖而分外受到世人瞩目。考察电离源的性能，一般需要用到的参数有信号强度、背景信号强度、、内能控制能力。
分析器/质谱
气相离子能够被适当的电场或磁场在空间或时间上按照质荷比的大小进行分离。广义地说，能够将气态离子进行分离分辨的器件就是质量分析器。在质谱仪器中，也使用或研究过多种多样的质量分析器，此处只介绍在商品仪器中广泛使用的质量分析器，即扇形磁场、飞行时间质量分析器、四极杆质量分析器、四极杆离子阱和离子回旋共振质量分析器。
氮质谱检漏仪1 扇形磁场 扇形磁场是历史上最早出现的质量分析器，除了在质谱学发展史上具有重要意义外，还具有很多优点，如重现性好、分辨率与质量大小无关、能够较快地进行扫描（每秒 10 个质荷比单位）。但在目前出现的小型化质量分析器中，扇形磁场所占的比重不大，因为如果把磁场体积和重量降低将极大地影响磁场的强度，从而大大削弱其分析性能。但是，随着新材料和新技术的不断出现，这种局面可望在将来得到改观。2 飞行时间质量分析器与其他质量分析器相比，飞行时间质量分析器（即 TOF）具有结构简单、灵敏度高和质量范围宽等优点（因为大分子离子的速度慢，更易于测量），尤其是与 MALDI 技术联用时更是如此。历史上对质荷比大于10的4次方的分子的质谱分析就是用TOF 来实现的，目前，这种质量分析器能够测量的质荷比已接近10的6次方。但相对其它质量分析器（如 ICR）而言，TOF 的分辨率和动态线性范围不够理想，比如对于分子量超过 5000 的有机物，同位素的峰就分辨的不好。但是，对大分子的质量测量精度则可达到0.01%，比传统生物化学方法（如、、等）的精度好的多。在TOF中，不同质荷比的离子必须在同一时间点以相同的初动能进入，这样才能保证漂移时间与质量的平方根成反比。为保证不同质荷比的离子在同一时间点以相同初动能进入漂移管，常采用脉冲式离子源（如采用脉冲激光辐射的 MALDI 离子源），这样基本上可保证时间的一致性；但采用这种方法产生的离子初速度仍具有很大差异，为减少这种差异，往往需对离子进行冷却，冷却时间一般为几十毫秒，经冷却的离子再引入电场进行加速，就能够基本消除速度上的差异。但在精确测量时，离子被加速后还需对其时间和空间分布进行校正，即通常所说的时间聚焦和空间聚焦。这种校正增加了TOF 测量的精确度，但同时也增加了仪器的复杂性。 3 四极杆质量分析器四极杆质量分析器的结构就是在相互垂直的两个平面上平行放置四根金属圆柱。如果把水平方向定义为 x方向，垂直方向为 y 方向，与金属圆柱平行的方向为 z 方向，在 x与 y 两支电极上分别施加±（UV cosωt）的高频电压（V 为电压幅值，U 为直流分量，ω为圆频率，t 为时间），则在四个金属圆柱之间的空间形成一个形如马鞍的交变电场。四极杆质量分析器能够通过电场的调节进行质量扫描或质量选择，质量分析器的尺寸能够做到很小，扫描速度快，无论是操作还是机械构造，均相对简单。但这种仪器的分辨率不高；杆体易被污染；维护和装调难度较大。
在线质谱系统4 离子阱离子阱和四极杆质量分析器有很多相似之处，如果将四极杆质量分析器的两端加上适当的电场将其封上，则四极杆内的离子将受x，y，z 三个方向电场力的共同作用，使得离子能够在这三个力的共同作用下比较长时间地呆在稳定区域内，就象一个电场势阱，因此这样的器件被称为离子阱。所以，在很多时候都认为四极杆质量分析器与离子阱的区别就是前者是二维的，而后者是三维的。 离子阱内部的离子总是在做复杂的运动，在这种复杂运动中，包含了与质量相关的特征信息。以这种特征信息为基础，发展了许多离子阱操作的新模式，大大拓宽了离子阱质量分析器的质量范围，改善了质量分辨率。虽然离子阱内离子的运动是复杂的，但就离子阱质量分析器本身而言，它具有许多独特的优点，主要是能够方便地进行级联质谱测量，能够承受较高压力（如 0.1 Pa），此外，这种质量分析器价格相对低廉，体积较小，被广泛用做色谱检测器。在质谱仪器的小型化中，离子阱的小型化取得了十分注目的成果。普度（Purdue）大学 Cooks 教授研究组的工作显得尤为突出，发展出来的圆柱型离子阱和矩形离子阱等不但克服了离子阱难以加工的缺点，而且进一步降低了成本、简化了操作，显著减轻了重量，缩小了体积，甚至可做成（mass sensor），有望在现场环境监测、、、安检、工业过程控制等领域发挥作用。5 离子回旋共振质量分析器在某种程度上，离子回旋共振（ICR）质量分析器与 有些相似。ICR具有非常高的质量分辨率，能够检测大质量离子、进行离子的无损分析和多次测量，具有很高的灵敏度和级联质谱的能力，是一种在现代质谱学领域中具有重要用途的质量分析器。为进一步提高质量分析器的质量分辨率，常见的措施是将扇形磁场和电场联用，形成双聚焦质量分析器，而 FT-ICR 的分辨率则可高达10的6次方以上。
检测器/质谱
质谱仪器的检测器有很多种，此处仅对电子倍增管及其阵列、离子计数器、感应电荷检测器、收集器等比较常见的检测器作简要评述。
质谱图电子倍增管是质谱仪器中使用比较广泛的检测器之一。单个电子倍增管基本上没有空间分辨能力，难以满足质谱学日益发展的需要。于是，人们就将电子倍增管微型化，集成为微型多通道板（MCP）检测器，并且在许多实际应用中发挥了重要作用。除了这种形式的阵列检测器外，电荷耦合器件（CCD）等在光谱学中广泛使用的检测器也在质谱仪器中获得了日益增多的应用。近年来，IPD（ion-to-photon）检测器由于它能够在高压下长时间稳定地工作，也引起了人们的极大重视。 离子计数器是一种非常灵敏的检测器，一般多用来进行离子源的校正或离子化效率的表征。对一般电子倍增管而言，一个离子能够在10的负7次方秒内引发10的5-8次方个电子，对绝大多数工作在有机物检测、生物化学研究领域的质谱仪器来说，其灵敏度已经足够。但在某些地球化学、宇宙学研究中，则需要用离子计数器来进行检测，其检测电流可以低于每秒钟一个离子的水平，一般离子源的信号至少也是离子计数器检出限的10的10次方倍。 感应电荷检测器也叫（imaging current）检测器，常与ICR 质量分析器联用。由于测量的是感应电荷（流），感应效率较低，故其灵敏度较低。但是，当它与ICR 等联用时，由于ICR允许离子的非破坏性测量和反复测量，因而 ICR 仍具有非常高的灵敏度。 （杯）是一种最为简单的检测器。这种检测器是将一个具有特定结构的金属片接入特定的电路中，收集落入金属片上的电子或离子，然后进行放大等处理，得到质谱信号。一般来说，这种检测器没有增益，其灵敏度非常低，限制了它的用途。但是，在某些场合，这种古老的检测器起到不可替代的作用。如（Indianna）大学Hieftje等制作的阵列检测器就利用了检测器的上述特点。
1 电喷雾解吸电离技术（Desorption Electrospray Ionization）质谱联用2004 年，Cooks 等报道了基于电喷雾解吸电离（DESI）对固体表面进行非破坏性检测的新型质谱分析方法。电喷雾产生的带电液滴及离子直接打到被分析物的表面，吸附在表面的待测物受到带电离子的撞击从表面解吸出来并被电离，然后通过质谱仪的采样锥进入质量分析器，获得的质谱图与常规电喷雾质谱图十分相似，可以得到单个或多个电荷的分子离子。电喷雾解吸电离技术可视为电喷雾技术与解吸技术的结合，而又类似于二次离子质谱。不同的是，解吸电离技术和二次离子质谱技术都是在真空条件下完成，而电喷雾解吸电离过程是在大气压环境下完成。由于该方法无须样品预处理，能够对吸附在固体表面的爆炸物、、蛋白质等在大气压下进行离子化，甚至能够对薄层色谱表面的分析物进行直接检测，从而实现了利用质谱方法进行快速灵敏的测定。DESI 是一种新兴的离子源，其最大的优点是能够在大气压下对物质分子进行离子化，从而实现了对待测物的灵敏、快速、高选择性在线监测。电喷雾解吸电离方法应用广泛，可用于极性化合物、非极性化合物、高分子量化合物、的测定。DESI-MS 可用于植物组织的天然产物分析，无需萃取等样品预处理过程；另外，该技术还已被用于蛋白质组学、代谢组学和诊断学、毒品检测等领域，均取得了很好的结果。值得一提的是，Cooks 课题组将DESI 与便携式质谱仪联用，并实现了对药物、植物组织、爆炸物、生化战剂模拟物、农用化学品的分析。2 电晕放电实时直接分析电离技术（Corona Direct Analysis in Real Time， CDART）2003年，科学家发明了电晕放电实时直接分析（Corona Direct Analysis in Real Time， CDART）离子化技术并成功地与带常压接口的飞行时间质谱相结合构成了新的质谱仪。采用这种质谱仪对各种气、液体和固体样品表面不作任何处理就可在大气压下直接进行实时分析，几秒钟内就可以得出结果，正好能使质谱技术满足科技领域对这些方面的迫切需求，因而被学术界认为是质谱技术发展方面的“下一次（next quantum leap）”和“革命性的离子源（revolutionary ion source）”。
质谱仪将其与离子淌度谱仪（IMS）结合则有望发展出可用于现场检测的便携式专用仪器。实时直接分析离子化源采用常压电晕放电办法使氦形成的氦原子，或者使氮气形成振动激发态的氮分子（活化氮），这些高能组分在与样品分子接触时就可通过非弹性碰撞使后者离子化，将其引入质量分析器作进一步分析，即可获得所需要的被分析样品的质谱信息。CDART 技术最初（2003年春）由美国的JEOL 公司开发成功并将其用于该公司带常压接口的 AccuTOF 质谱仪。同年（2003 年）夏美国陆军设在马里兰州的 Edgewood 化学生物武器中心即开始对其作为化学武器检测器的能力进行评估。两者（JEOL 公司和 Edgewood 中心）的研究很快证明，这一新技术可用于数百种化学物质的鉴定，其中包括化学生物武器制剂及其相关化合物（包括其前体、添加剂、反应和降解产物及解毒副产物）、、、、多肽、寡糖、合成有机化合物和金属有机化合物、毒品、爆炸品及有毒工业化学品等。样品类型则遍及多孔混凝土、沥青、人体肌肤、钱币、航班登机卡、、、、、、生物体液、树木和花草叶片、酒杯、常用实验室设备及服饰等。最近的研究更已经扩展到了像蛋白质的测定、聚合物的鉴别、橡胶中抗氧化剂的快速分析、食用油中脂肪的快速分析、粘结剂、水泥、树脂的快速分析、泥水中爆炸物的检测、西红柿表面番茄红素的测定、单个罂粟籽中鸦片的检测、辣椒中辣椒素的分布测定、葱片所释放出的不稳定化合物的检测、除草剂中痕量化合物的快速检测、桔子皮中杀菌剂的检测等等。3 电喷取电离技术（ Electrospray Ionization）陈焕文等在进行DESI-MS研究的基础上，创造性地提出了电喷雾萃取电离（EESI）技术。EESI 技术最早用于液体样品的测定，由电喷雾产生的带电液滴及离子与雾化产生的样品液滴碰撞，样品溶液中的待测物被萃取出来并电离，待测物离子由毛细管接口引入质谱仪。
质谱图随后，陈焕文等成功地开展了基于 EESI-TOF-MS 方法和活体呼吸气体为样品的方面的研究，研究结果被 Angew. Chem.杂志选中为VIP热点文章、并以封面配图的形式加速发表。实验在商品化ESI离子源上进行，气体样品由入口引入，与电喷雾产生的带电液滴及离子碰撞，待测物分子被萃取并离子化后，由毛细管引入质谱仪。因其别具匠心的设计和优异的性能，使得 EESI-MS 不仅具有质谱特有的高灵敏度和高特异性，而且能够承受各种形态的样品，而且不需要进行样品收集和分离，能够对生物样品进行活体、实时、在线分析。因此，给临床样品的快速质谱分析这一问题的解决提供了可能。从已经发表的结果来看，EESI-MS 不但能够检测呼吸气体中含有的极性分子和非极性分子，而且还能够检测挥发性和非挥发性分子。通过呼吸气体的活体在线的质谱分析，在1秒钟内即可以获得样品中所有这些分子的指纹谱图，而且可以对任何感兴趣的组分进行结构鉴定，确保了测量结果的可靠性。他们的研究结果表明，人体在极端饥饿或病理条件下将能够在呼出气体中检测到超乎寻常的大量尿素，这与体内采用蛋白质、脂肪来代替糖类供能的结果吻合，也给许多疾病的诊断提供了依据；当服用甜点后能够在呼出气体中检测到，为等的诊断和研究提供了新的途径；数据也清楚地显示了健康人和人身体对的不同反应；并且展示了通过选择性分子-离子反应来进行某一类化合物的快速测定，比如口臭患者病因的检测等。实际上，EESI-M 可看作是分子水平上的闻诊。根据科学家的评价，该项研究结果清楚地展示了如果应用质谱仪来进行活体代谢组学研究，对人类多种疾病的诊断、治疗以及对生命活动的分子细胞学机制的研究提供前所未有的有效工具。2002年诺贝尔化学奖得主、ESI技术发明人John B. Fenn 教授认为这一技术（EESI）将被广泛应用，尤其是分析化学家将满怀感激，对此，毫不怀疑。Cooks 教授认为 EESI开辟了临床诊断分析化学研究的新领域，对质谱学在临床医学方面的应用具有划时代的意义。该研究成果发表后，化学会会刊CHIMIA立即决定对其进行转载，欧美各国的众多学术期刊，包括英国Chemistry World， C&EN，科技在线，Medical News Today，Medilexicon，Hospitalsworldwide，Lab on a chip等媒体都以多种文字对此成果进行了报道，意在迅速引起各国相关行业人员的关注。
检测技术/质谱
1 低温检测器低温检测器也叫热量检测器。当粒子或离子撞击超导薄膜表面，能量累积并产生热量，表面溅射出、、和，这个过程在常温下不容易被发现。然而，在低温条件下（&3K），能够检测到由离子撞击产生的瞬间“高温”，从而提供离子速率和能量的信息。低温检测器具有100％的效率、无质量岐视、理论上无质量上限。使用电子倍增器和微通道板对大质量离子进行检测时，由于二次电子的产生会使检测效率降低，而低温检测器在高质量区响应信号不会下降。
液质联用这种能够对离子能量检测的方法有助于对离子化机理的研究。2002年出现商品化的采用超导隧道结检测器的阵列低温检测器，对 m/z400，000 大分子进行检测，灵敏度达 fmol 水平。但是，这种检测器需要工作在极端低温的环境下，在一定程度上限制了其推广应用。2 微球板检测器Tremsin 和 Naaman 等研制出基于微通道板检测原理的微球板检测器（MSP）。直径约为 20～100 微米的玻璃微球经特殊材料处理后，烧结形成薄的、多孔玻璃板，这样在玻璃板两个表面之间就可形成不规则通道，离子撞击玻璃板表面产生二次电子被加在两表面间的高压加速，通过弯曲的通道时，再次撞击其他微球表面产生更多的电子，经多次循环产生后，电子流在玻璃板的另一侧得到检测。与微通道板相比，微球板有更高的检测效率。使用微通道板时，当离子撞击在通道之间的表面，不产生电子；而使用微球板时，接收离子的表面为多个球表面，这极大地提高了检测效率。另外，与微通道板相比，微球板的成本要低的多。
质谱仪Guilhaus 等将微球板检测器与正交飞行时间质量分析器联用时，单个离子的脉冲宽度为800ps（）。3 其他Birkinshaw和Langstaff等人研制出由微通道板和阳极阵列组成的检测体系。阳极阵列是基于芯片技术的互补型金属氧化物半导体器件，由 18 微米宽的带和相应电路组成，可用来检测微通道板产生的脉冲电流。与普通微通道板相比，信噪比、灵敏度、分辨率得到一定提高，而计数速率没有得到改善。Sinha 和 Wadsworth 等报道了基于电荷耦合器件（CCD）的阵列检测器，作者将电荷耦合器件中对光子敏感的器件换成金属氧化物半导体器件，可直接用于离子的检测，灵敏度较高，可检测 5 个离子。Fuerstenau 等将主动象素传感技术用于离子的检测，将可用于电荷收集的金属带代替互补型金属氧化物半导体器件中的光电二极管。与电荷耦合器件不同，互补型金属氧化物半导体器件中的每个象素在电路中都有独立的放大功能。
进入 21 世纪，现代科学技术的发展对分析测试技术提出了新的挑战。与经典的化学分析方法和传统的仪器分析方法不同，现代分析科学中，原位、实时、在线、
质谱应用非破坏、高通量、高灵敏度、高选择性、低耗损一直是分析工作者追求的目标。在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。电喷雾解吸电离技术、电晕放电实时直接分析电离技术和电喷雾萃取电离技术的提出，满足了时代的需要，满足了科学技术发展的要求，为复杂样品的快速质谱分析打开了一个窗口。是近年来新型质谱仪的研究热点之一，便携式质谱仪的研究主要集中在离子化技术、质量分析技术方面，检测器多采用 Detech 公司和 SGE 公司的商品化检测器。为适应离子化技术、质量分析技术的快速发展，开发高性能离子检测技术已迫在眉睫，而低噪音、高稳定性、宽质量范围、较低的质量岐视、长寿命、低成本将是离子检测技术发展中所要追求的目标。质谱和光谱、核磁共振等方法是并列关系，目前很少有交叉领域。实际上，质谱和这些经典谱学方法之间的交叉，也是应该值得重视的研究领域。
作者及简介/质谱
&吴莉.电感耦合等离子体—质谱/发射光谱法测定生物样品、中药及水样中的微痕量元素[D]. 四川大学，2007&何艺桦.基于CCD的小型光谱分析仪器与化学发光新技术[D]. 四川大学，2007&，，郭玉生. ICP-AES法测定中药中钙[J]光谱学与光谱分析，2004，.&庄美华，朱辉忠，蔡伟星，葛振祥. 应用ICP-MS分析汽油中微量的砷、汞、铅[J]，2005，&，藤川阳子. 激光熔蚀-电感耦合等离子体质谱法测定底泥沉积物中的总汞[J]光谱学与光谱分析，2004，，，. 微波消解试样法测定香菇和黑木耳中痕量锗[J]分析试验室，2002，&黄志勇，吴，，庄峙厦，. 高效液相色谱/电感耦合等离子体质谱联用技术用于元素形态分析的研究进展[J]分析化学，2002&，林守麟，胡圣虹. 氢化物发生进样与ICP-MS检测方法的联用[J]光谱学与光谱分析，2002，&梁沛，陈浩，胡斌，李彬，，王小如. 电感耦合等离子体质谱测定中草药中痕量稀土元素的研究[J]分析科学学报，2002，，刘刚，，潘元海，郑永章，童坚. 氢化物发生-电感耦合等离子体质谱联用技术研究[J]分析化学，2003，&姜颖，徐朗莱，贺福初. 质谱技术解析磷酸化蛋白质组[J]生物化学与生物物理进展，2003，黄珍玉，于雁灵，方彩云，. 质谱鉴定磷酸化蛋白研究进展[J]质谱学报，2003，&何坚，杨芃原，庄峙厦，王小如，，宋浩威，于文佳，魏俊飞，周振，A.F.Dodonov. 高分辨电喷雾离子源三级四极杆-飞行时间质谱仪的研制[J]仪器仪表学报，2003，. 蛋白质组与生物质谱技术[J]质谱学报，1998，& Quetel，C. R，Vogl，J.，Prohaska，T.，Nelms，S.，Taylor，P. D. P.，De Bievre，P. Comparative performance study of ICP mass spectrometers by means of U isotopic measurements .Fresenius J. Anal. Chem，& :148-155 . &Guo，X. M，Sturgeon，R. E.，Mester，Z.，Gardner，G. J. UV light-mediated alkylation of inorganic selenium .Appl. Organomet. Chem，2003， :575-579 . &Jitaru，P，Infante，H. G，Adams，F. C. Multicapillary gas chromatography coupled to inductively coupled plasma-time-of-flight mass spectrometry for rapid mercury speciation analysis .Anal. Chim. Acta.
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