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FQ-PCR方法检测女性尖锐湿疣(CA)患者HPV的基因分型
目的 探讨女性尖锐湿疣(CA)患者感染人类乳头瘤病毒(HPV)的基因类型和分布.方法 采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测256例CA患者疣体组织或分泌物中的HPV类型.结果 HPV6、11型阳性率为93%(238/256),HPV16、18型阳性率为15.2%(39/256),HPV6、11型和HPV16、18同时阳性为10.9%(28/256).定量检测病毒载量最高为1.0×108 copies/ml,最低为2.2×104 copies/ml.结论 本地区尖锐湿疣患者感染以HPV6、11低危型为主,少数为HPV16、18高危型;荧光PCR检测技术具有灵敏度高、特异性强及检测时间短等特点,能够及时准确的为HPV患者临床治疗及预后判断提供可靠的依据.
QIN Gui-fang
作者单位：
广西壮族自治区人民医院检验科,南宁,530021
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摘要 : 随着现代生物学实验方法的快速发展和应用，关于我们的劲敌之一——癌症的研究和检测方法越来越多样，其中FQ-PCR技术占据了重要的一席之地，本文着重介绍了几种PCR技术在癌症中的应用之道。
随着现代生物学实验方法的快速发展和应用，关于我们的劲敌之一&&癌症的研究和检测方法越来越多样，其中FQ-占据了重要的一席之地，本文着重介绍了几种PCR技术在癌症中的强大应用之道。
1.单管技术的原理
单管荧光(fluorogenic quantitative PCR, FQ PCR)的反应体系中除了普通PCR所需的引物外，还有一条荧光探针，探针的5`端标记了荧光报告基团，3`端标记了荧光淬灭基团，当这条探针保持完整时，荧光淬灭基团抑制荧光报告基团发出荧光。PCR反应开始后，随着DNA链的延伸，Taq酶的5`-3`外切酶活性将荧光探针切断，荧光淬灭基团的作用消失，荧光报告基团就发出了荧光信号，荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。
2. FQ&的优点
FQ&PCR技术是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，实验的整个过程只在加样时打开1次反应管，在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量，因此也有人称FQ-PCR为实时荧光定量PCR(Real-time itative PCR)。其优点为：①FQ-PCR解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题。②避免了普通定量PCR操作过程中的污染，FQ-PCR只在加样时打开反应管1次。③FQ-PCR操作简便、快捷、结果准确，不需要普通PCR扩增后进行电泳或放射自显影观察结果，方便了临床上应用。④FQ-PCR可以对每一批扩增样本进行扩增效率的评价。对DNA做系列稀释，每个稀释浓度的DNA对数值与其Ct值做回归分析，PCR的扩增效率的计算方法为：效率=10-1/斜率。通过计算扩增效率可以对仪器、操作人员和试剂进行综合评定。
3. FQ-PCR在血液系统肿瘤中的应用
Jones CD(1)对FQ-PCR技术预测慢性髓性白血病(CML)病人的髓外增的有效性进行了评价。FQ-PCR方法检测372例临床标本和50例外周血标本p210和 p190 bcr-abl RNA 融合基因的转录水平，用看家基因对结果进行标准化，检测结果为特异性100%。敏感性研究显示，稀释到0.0001%时仍然可以检测到bcr-abl，重复性实验显示组间变异系数(CV)为12.3%，组内变异系数为13.8。实验结果显示FQ-PCR是一种非常可靠的监测bcr/abl阳性CML病人的方法。
(FISH)的结果显示10%-15%的CML病人bcr-abl杂合子缺失，这样的病人预后非常差。FQ-PCR方法可以鉴定CML病人杂合子亚单位上的微小缺失，这种微小的缺失难于用FISH方法分辨出来。Kolomietz(2)用FQ-PCR方法对25例预后差的病人进行检测，18例无微小缺失CML病人获相对较好的治疗效果。
Hughes等(3)将1106例CML病人随机分为imatinib(蛋白激酶抑制剂)治疗组和INF-a+卡铂治疗组，用FQ-PCR检测2个治疗组病人血液中bcr-abl的转录水平，结果显示imatinib治疗组12个月后bcr-abl的转录水平降低了3个数量级，治疗效果明显优于INF-a+卡铂治疗组。CML病人bcr/abl的转录水平降低了3个数量级或无转录者，预后较好。
4. FQ-PCR在乳腺癌中的应用
Weigelt等(4)用FQ-PCR方法检测94例乳腺癌转移的病人外周血CK19、p1B、PS2 和 EGP2的mRNA水平，通过QDA将4个基因综合成一个评价指标。在77例乳腺癌骨转移的病例中发现QDA阴性病人的存活率明显高于QDA阳性病人(P=0.015 、0.0053)，QDA阳性的病人1年存活率为3%，2年的总存活率为17%，而QDA阴性的病人存活率为36%。
ANG1 和ANG2是肿瘤细胞分泌的促进肿瘤细胞生长和转移的因子，Sfiligoi(5)研究了ANG与肿瘤细胞淋巴结转移和肿瘤病人的生存率之间的关系。38例乳腺癌活检标本提取mRNA,用FQ-PCR技术测定ANG1 和ANG2基因水平，检测结果与临床病理和临床生化指标相比较，发现ANG2与腋窝淋巴结转移有高度的相关性，单变量和多变量生存分析显示，ANG2 mRNA 水平与疾病(p & 0.0001)、总存活率(p & 0.0003)呈单因素高度相关性。
5. FQ-PCR在胃肠道肿瘤中的应用
胃癌手术后的腹膜播散是胃癌复发的常见原因。Ueno(6)对124例胃癌手术病人实施腹腔灌洗，FQ-PCR技术检测灌洗液中CEA水平，结果显示CEA的Ct值与肿瘤的侵犯深度、淋巴结的转移、血管转移、肿瘤分期、存活率有高度的相关性。CEA的Ct值预测肿瘤腹膜转移的敏感性为76.9%，特异性为67.7%，而细胞学检测的敏感性只有23.1%。这些实验数据显示，FQ-PCR技术检测灌洗液中CEA水平，对预后和诊断是否有腹膜转移是一个很好的指标。
alpha4GnT是一种糖苷转移酶，它只存在于胃癌细胞中，外周血中检测不到。Shimizu(7)对37例胃癌病人和23名健康人外周血alpha4GnT的mRNA进行荧光定量检测，胃癌病人的检出率为62.2%，而健康人未检测出阳性。令人振奋的是有5例早期胃癌病人，胃癌侵犯只局限在粘膜层，alpha4GnT的mRNA的检出率达到80%。慢性胃炎、胃幽门螺杆菌感染的良性病变的alpha4GnT mRNA水平明显低于胃癌病人。这些结果表明定量检测外周血中alpha4GnT的mRNA是对胃癌的一个很好的检测指标。
肝癌的早期发现对肝癌的治疗和预后非常重要，Chuma(8)对7个早期肝癌结节和7个进展期肝癌结节的12 600个基因进行了定量分析，发现95个基因可以区分早期肝癌和正常组织，92个基因可以区分早期肝癌和进展期肝癌，其中热休克蛋白70基因(HSP70)在早期肝癌结节中明显上调，与癌前病变组织、正常组织存在明显差异(p&0.001)。
6. FQ-PCR在其它肿瘤中的应用
Gelmini(9)用FQ-PCR方法检测43例前列腺癌和16例前列腺良性增生病人的活检组织PSA，前列腺癌病人的PSA mRNA水平变异非常大，平均2.5 x 107( 2 x 104 - 2.1 x 108 )/ml，而良性增生肿瘤组织的平均拷贝数为1.3 x 106/ml,前者的表达水平明显高于后者(p = 0.006)，但是前列腺癌组织的PSA mRNA水平与外周血中PSA mRNA水平无相关性。Straub(10)用高灵敏度的FQ-PCR方法检测了129例前列腺癌根治术前后和19例前列腺良性增生的血标本中PSA mRNA水平，发现血浆中的PSA mRNA水平可以反映外周血中前列腺癌细胞的数量，对病人早期治疗和手术后病情监测及预后有一定帮助。
Survivin 是一种凋亡抑制蛋白，在非小细胞肺癌(NSCLC)早期呈现过度表达。Falleni[11]对86例NSCLC病人(IA and IB)定量检测Survivin mRNA水平，结果80例(96%)病人检测出Survivin mRNA表达，明显高于正常肺组织 (p = 0.008)，并且鳞状细胞癌的表达水平高于其它类型肿瘤(p = 0.0022)，FQ-PCR技术是对肺癌早期诊断的一种有效手段。
最近又有文献报道将FQ-PCR技术应用到头颈肿瘤(12)、口腔肿瘤(13)、淋巴瘤[14]等肿瘤中，得到了较好的检测结果。
7. 肿瘤相关病毒的检测
人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌的主要诱发因素，已经证实宫颈癌组织与正常组织的HPV早期基因(E7)的表达水平有显著差异，Lamarcq等(15)用FQ-PCR方法探讨宫颈脱落细胞E7基因的转录水平是否可以诊断早期宫颈癌，结果显示在高分化SIL中HPV16或HPV18的E7基因的检出率为47%，正常组织未检测到，两者存在显著差异(p&0.006),此项实验也证明E7基因可以作为宫颈癌早期筛查的指标。Dong SM等[16]对175例宫颈浸润癌，57例宫颈原位癌，60例正常对照的血浆进行传统PCR方法与FQ-PCR方法扩增HPV基因进行比较，传统方法浸润性宫颈癌的检出率为6.9%， 原位癌的检出率为 1.8%, 正常组织的检出率为1.7% ，FQ-PCR方法对浸润性宫颈癌的平均拷贝数为11163拷贝/ml,原位癌的拷贝数为8拷贝/ml，正常组织拷贝数为0，FQ-PCR方法明显优于传统PCR方法。
早期鼻咽癌可以通过放射治疗进行根治，中晚期鼻咽癌有较高的复发率。Dong(17)对170例没有转移的鼻咽癌实施统一的放射治疗方案，在治疗前和治疗后6-8周用FQ-PCR方法检测血浆中EB病毒的含量，治疗后EB病毒的含量与鼻咽癌的总存活率有高度相关性(p&0.001),对鼻咽癌复发的阳性和阴性预测值分别为87%和83%。鼻咽癌治疗后EB病毒的含量可以准确反映治疗后肿瘤的残余水平，与肿瘤病人的存活率有高度相关性。
8. 肿瘤多药耐药基因检测
肿瘤的多药耐药基因的出现使许多肿瘤患者治疗失败，以往用流式细胞仪或者免疫组化的方法检测p糖蛋白(多药耐药蛋白)是否表达，或者用PCR的方法检测mRNA,这些方法都很难实现标准化的操作和统一判断标准。FQ-PCR方法可以实现标准化的操作，并且可以直接定量出多药耐药基因(MDR)的拷贝数。Burger等(18)对59例原发性乳腺癌，以化疗为系统治疗的病人，进行了BCRP、LRP、MRP1、MRP2和MDR1基因的mRNA定量测定，结果为对化疗中度反应的病人5种基因的mRNA水平明显低于对化疗没有反应的病人。其中MDR1基因高表达组的病例分期明显低于MDR1基因低表达组(p&0.005)，而且预后差。其它4种基因也存在同样差异，但是没有明显的相关性。Tseng(19)对50对正常与头颈癌组织的MDR1 mRAN研究中发现，27例T/N&1的标本中IV、III、II和 I期的MDR1分布为59.3%、22.2%、14.8%和3.7%，MDR1水平与肿瘤标本的分期有高度相关性 (P&0.01)，FQ-PCR方法对MDR1基因的检测可以辅助病理分期，指导临床治疗。
FQ-PCR实验操作简便优势明显，并且整个过程中只需打开一次反应管， 在血液系统、乳腺癌、胃肠道等疾病和基因的检测中都有不可小觑的应用前景，实在是PCR实验人员必学必备并且需要温故知新的基本方法啊。
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