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感受态细胞涂平板 什么菌落都没有长出来 做克隆实验,目的基因与pGEM-T Easy Vector连接后,和JM109感受态细胞培养,然后培养液在LB+氨卞青霉素+IPTG+X-Gal培养基上37度培养,结果没有长出来任何菌落.蓝、白斑都没有.请教可能是什么原因呢?我自己只想到有可能是感受态细胞失活,请问还有其他什么原因吗,我想多试一试!
dvtghb3001AC
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首先,确保你的连接是成功的,碰到过有师弟没加连接酶,连接失败的情况；其次,转化过程操作是否正确,看你写的东西,连接液和感受态放在一起培养是个什么情况?第三,如果要检测感受态是否失活,在第二步确保无误码的情况下,转化时加入阳性对照,拿个纯质粒同时转,如果纯质粒都不长,那感受态必然有问题.
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雪豫ShineM
宝宝2岁8个月
这个是可以吃的。长斑是因为豆角在生长的时候被虫子爬过表面而形成的氧化作用，内里是没有影响的
10-04 23:33
这个是可以吃的。长斑是因为豆角在生长的时候被虫子爬过表面而形成的氧化作用，内里是没有影响的
ai桐桐baby
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菌落PCR有关问题?我们做了转化实验,将转化后的菌涂在含Kan抗性的平板上,为什么挑取能生长的菌落做PCR没有目的条带?
美食的俘虏884
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这很正常,一般做蓝白斑挑斑会更精确,不过现在的连接酶成功率很高,不少已经达到90%以上,但仍然存在只转化了质粒而未连接成功目的条带的菌落.所以挑斑时一般要多挑几个,而且选单菌落,可以画圈圈分散开来挑斑.
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【求助】转化之后平板上面长满了菌斑，出了什么问题呢？
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这个帖子发布于12年零122天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
转化的时候感受态细胞在37度下培养了90多分钟，然后取了100u涂平板，结果今天早上发现平板上长满了菌斑，究竟是哪个环节出了问题啊。
不知道邀请谁？试试他们
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zhumengjin edited on
是不是平板里忘了加抗生素哦？^_^
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没太明白你的意思
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不加抗生素也不至于一晚上就长满杂菌呀！除非平板已经放置了很长时间！
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加了AMP啊，涂平板之前上面啥都没有，在恒温箱里放了一晚上就长满了菌斑，我看别人转化之后没有长那么多的克隆子。是不是转化效率高呢。
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不太明白你的意思。不知是质粒转化还是连接产物转化，如是质粒转化，一般转化效率都挺高，100ul涂平板长满板很正常的 ，我一般质粒转化只涂10ul就能长出不少菌落，如是连接产物转化，一般转化效率没这么高。你可以挑取转化平板上单克隆至加Amp的LB培养液中摇床培养后PCR鉴定或抽提质粒酶切鉴定一下是否你要的东西，如果是杂菌会摇不出来的。
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我的是连接产物转化，不过我涂了150ul。
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上次做克隆也是这个情况，挑克隆子做PCR之后发现全是假阳性。假阳性的问题应该是连接的时候出问题吧，不可能出在转化上？
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把你的插入片断再纯化一下，然后再在连接反应中加大插入片断的比例，应该可以解决
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嗯，上次的插入片断是PCR产物纯化，结果电泳下无条带，这次做的是有条带。插入片断和载体比例用3：1，不知道有什么方法计算两者的比例
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一般来说,转化效率没有这么高,出现这种情况有两种可能:
一,感受态细胞有突变;
二,抗生素失效.
我前两天遇到同样情况 ,质粒对照组和连接转化组几乎有同样的转化效率,平板上都长满了菌落.
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感受态细胞不是现做的，在－20度保存了较长时间。上次用M13扩之后发现插入片断没有连接进去，扩出来的条带很小。
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这一批平板别人做也是如此吗？如果是的话，就要怀疑抗生素失效。失效有两种可能：一是时间太长，二是倒平版时，培养基温度还高就把抗生素加进去了（我曾有一阵就掌握不好“火候”，温度高了抗生素失效，温度低了培养基就凝了:P）
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转化时要设几个对照，1、阴性对照，感受态细胞直接涂在Ap平板上，看看长不长2、做连接反应时，将不加外源片段的空载体片段做一个自连反应，并同时做转化，看看自连的多不多。
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biowind 这一批平板别人做也是如此吗？如果是的话，就要怀疑抗生素失效。失效有两种可能：一是时间太长，二是倒平版时，培养基温度还高就把抗生素加进去了（我曾有一阵就掌握不好“火候”，温度高了抗生素失效，温度低了培养基就凝了:P）平板应该没问题，师姐做的时候长的挺好的。
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fzzb209 转化时要设几个对照，1、阴性对照，感受态细胞直接涂在Ap平板上，看看长不长2、做连接反应时，将不加外源片段的空载体片段做一个自连反应，并同时做转化，看看自连的多不多。 假阳性就是载体自联还是外源片断没有插入载体。？
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fzzb209 转化时要设几个对照，1、阴性对照，感受态细胞直接涂在Ap平板上，看看长不长2、做连接反应时，将不加外源片段的空载体片段做一个自连反应，并同时做转化，看看自连的多不多。 假阳性就是载体自联还是外源片断没有插入载体。？
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对了，我用的是T载体，T载体据说不容易自联。
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重新做一次试试
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我的情况是这样的，DNA是从活性污泥提取的总DNA，通过古菌特异引物将古细菌特异性片断扩增出来，PCR扩增产物纯化之后做连接（4度连接16小时以上），转化涂平板，挑菌落。然后用M13引物确定连接是否成功。师姐也用同样的试剂盒做连接，不过做的是单菌DNA片断的连接，培养基，感受态细胞（不过我做的时候在冰箱里放了很长时间）都是她配制的，并且在她的克隆实验里获得了成功。为什么我每次做克隆的时候平板里的菌斑都在疯长，数量很多。分布很秘。不知道我的问题出在哪里，连接？转化？还是感受态细胞保存太久了？？
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这就是菌斑恶心的照片。
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感受态细胞培养时间有点长了：一般45到60分钟即可！
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感受太发生突变是什么意思？是指能耐受抗性？怎么会这么杨的？望指教1
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感受太发生突变?不太可能吧，从平板上看到像是阳性对照，所以80%的可能的发生了自身连接，连接前作去磷酸化了吗？
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请问怎么做去磷酸化啊？
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我的T载体用的是PROMEGA的一个PEGM-T VECTOR的东西，怎么用公司的产品也会自脸这么严重，我要不要加大插入片断的量？
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pcr产物纯化一下连接.2)
连接的时候t载体少加一点.3)重新做amp抗性平板,电转,感受态细胞应该没有问题我放了2年的感受态克隆照样做的很好!
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我用PGEM-T结果长得全是白斑，而且转接试管培养在抗性下可以长，但是试剂和抽不出东西，碱裂解法得到的全是很大的片断，将近10000bp。这是怎么会是？
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你的感受态放在－20度不合适，怎么也要放在－80啊。感受态细胞培养时间有点长了：一般45到60分钟即可！并且长那么多一定是感受态有问题！换换感受态试试吧！！！
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平板里面的AMP应该没有失效,因为师姐用的也是这一批的平板.
感受态有问题,为什么会在AMP上长那么多呢?还有,如果是载体自联的话,为什么会有那么多的菌斑出现呢.为什么不自联的话就没有那么多的菌斑?? 还有,我的平板在37度下放了14个小时,是不是放的时间太长了呢.
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平板在37度下放了14个小时
时间并不长,我放过17-18小时的.建议换感受态和抗生素平板再做次看看,我做的第二次转化后的阳性克隆又很少,每个平板上才一个,怀疑还是不成功,鉴定结果不明确.我也遇到这样的问题,欢迎多多交流!!QQ:
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平板在37度下放了14个小时
时间并不长,我放过17-18小时的.建议换感受态和抗生素平板再做次看看,我做的第二次转化后的阳性克隆又很少,每个平板上才一个,怀疑还是不成功,鉴定结果不明确.我也遇到这样的问题,欢迎多多交流!!QQ:
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我想你应该做一个菌落PCR，和质粒PCR看看有没有连进去，说不定里面有连进去的菌落呢？！
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