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回答问题，赢新手礼包TRADITIONAL CHINESE MEDICINE COMPOSITE FOR PREVENTING OR TREATING FIBROSIS DISEASES AS WELL AS PREPARATION METHOD AND APPLICATION OF SAME
WIPO Patent Application WO/
Provided are a traditional Chinese medicine composite for preventing or treating fibrosis diseases as well as a preparation method and application of same. The traditional Chinese medicine composite comprises a raw material A and/or water extract or ethanol aqueous solution extract of the raw material A, and may further comprise a raw material C and/or a starter culture of the raw material C. The raw material A comprises astragalus mongholicus, auricularia auricular underw, panax notoginseng and lucid ganoderma B in a weight ratio of (9-30):(9-30):(1-9):(6-12). The lucid ganoderma B is ganoderma lucidum and/or ganoderma sinense, and the raw material C is cordyceps sinensis and/or cryptoporus volvatus. In the Chinese medicine composite, the lucid ganoderma B and/or the extract of the lucid ganoderma B may be replaced with the raw material C and/or the starter culture of the raw material C.
Inventors:
HU, Zhuowei (South of Xingbin Road, Binghai Industry Park Shaoxing Count, Shaoxing Zhejiang 3, 312073, CN)
YAN, Jun (Room 803, No. 11 Chongwenmenwai StreetDongcheng District, Beijing 2, 100062, CN)
CUI, Bing (Room 803, No. 11 Chongwenmenwai StreetDongcheng District, Beijing 2, 100062, CN)
Application Number:
Publication Date:
12/12/2013
Filing Date:
05/06/2013
Export Citation:
BEIJING WEIFENG YIMIN BIO-TECHNOLOGY LIMITED COMPANY (Room 803, No. 11 Chongwenmenwai StreetDongcheng District, Beijing 2, 100062, CN)
ZHEJIANG CIFU PHARMACEUTICALS CO., LTD. (South of Xingbin Road, Binghai Industry Park Shaoxing Count, Shaoxing Zhejiang 3, 312073, CN)
International Classes:
A61K36/481; A61P1/16; A61P9/00; A61P11/00; A61P13/00; C12N1/14
View Patent Images:
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Foreign References:
CNACNACNACN1899318ACNACNA
Other References:
GAO, YANRONG ET AL.: 'Effects of Auricularla Auricula Powder on Collagen Synthesis in Silicotic Rats and its Mechanism of Antioxidative Stress' JOURNAL OF BAOTOU MEDICAL COLLEGE vol. 27, no. 4, 2011, pages 30 - 33
XIE, XISHENG ET AL.: 'Effects of astragalus and radix notoginseng on renal interstitial fibrosis in rats' MEDICAL JOURNAL OF WEST CHINA vol. 23, no. 10, October 2011, pages 1854 - 1858
Attorney, Agent or Firm:
SHANGHAI ZHI XIN PATENT AGENT LTD. (26/F Zhijun Building, No.1223 Xie Tu Rd, Shanghai 3, 201203, CN)
1、 一种预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物， 其特征在于： 配方包 括： 原料 A和 /或原料 A的提取物； 所述的原料 A的提取物为水或乙醇水溶 液的提取物； 其中， 所述的原料 A包括黄芪、 黑木耳 uricularia auricula (L. exHooke )Underw)、三七、以及灵芝 B;所述的灵芝 B为赤芝（Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. ) 禾口 /或紫芝 ( Ganoderma sinense Zhao , Xu et Zhang) ; 所述的黄 、 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) Underw)、 三七、 以及灵芝 B之间的重量比为 9~30： 9-30： 1-9： 6~12。
2、 如权利要求 1所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的黄芪、 黑木 耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) Underw)、 三七、 以及灵芝 B之间的 重量比为 12 : 9： 1： 6； 所述的原料 A在直接使用时， 粉碎使用， 使粒径大 小较佳的过 40目筛。
3、 如权利要求 1所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的原料 A的提 取物按下述方法制得：将原料 A用 3?10重量倍数的水或 3?10重量倍数的 70v/v%?95 v/v%乙醇水溶液回流提取 2~3次， 每次提取 1?3小时， 合并 提取液， 过滤， 浓缩， 干燥， 粉碎即可。
4、 如权利要求 3所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的原料 A的提 取物在制备时为：将原料 A中各原料分别制备提取物后混合，或者将各原料 混合后再制备提取物；
当所述的原料 A的提取物在制备时将原料 A中各原料分别制备提取物 后混合， 黄芪的提取物的提取时间为 1-2小时； 黑木耳 uricularia auricula (L. exHooke) Underw)的提取物的提取时间为 1.5?3小时；三七的提取物、 以及灵芝 B的提取物的提取时间分别为 2~3小时。
5、 如权利要求 1所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的中药提取物 还含有原料 C 和 /或原料 C 的发酵培养物， 所述的原料 C 为冬虫夏草 ( Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc )禾口 /或隐孑 L菌 ( Crytoporus volvatus (Peck.) Hubbara. )。
6、 如权利要求 1 所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的灵芝 B和 / 或灵芝 B提取物被替代为原料 C和 /或原料 C的发酵培养物， 所述的原料 C 为冬虫夏草 ( Con yce^o wm Berk. )Sacc )禾口 /或隐孑 Lli Cryto/w s volvatus (Peck.) Hubbara. )。
7、 如权利要求 5或 6所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的冬虫夏 草（ Corifyce/w sinensisi erk. )Sacc )的发酵培养物为蝙蝠蛾被毛孢（H re(TM)te〃a hepiali Chen et Shen. (1985) ) 的发酵培养物； 所述的隐孔菌 ( rytopor volvatus (Peck.) Hubbara. ) 的发酵培养物为中华隐孔菌 ( rytoporus sinensis Sheng H. Wu & M. Zang ) 的发酵培养物。
8、 如权利要求 5或 6所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的原料 C 和 /或原料 C的发酵培养物的用量为重量份数 3~20，较佳的为重量份数 3~9。
9、 如权利要求 7所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的原料 C的发 酵培养物由下述方法制得： 将原料 C菌种接种至液体培养基中， 之后进行通 气培养得发酵培养物， 干燥即可； 所述的原料 C菌种为按经过二级或三级种 子培养获得的菌种。
10、 如权利要求 9所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的二级种子培 养为依次经过斜面菌种培养、 摇瓶种子培养、 一级和二级种子罐培养； 所述 的三级级种子培养为依次经过斜面菌种培养、 摇瓶种子培养、 一级、 二级和 三级种子罐培养；
当所述的原料 C为冬虫夏草时， 所述的培养的条件为 10°C?18 °C、 pH 6.0?7.5； 所述的斜面菌种培养、 摇瓶种子培养、 一级、 二级和三级种子罐 培养的培养时间分别为 30?60天、 10天、 6天、 6天、 6天和 6?12天； 当所述的原料 C为隐孔菌时， 所述的培养的条件为 20 °C?30 °C ; 所述 的斜面菌种培养、 摇瓶种子培养、 一级、 二级和三级种子罐培养的培养时间 分别为 3?10天、 6天、 6天、 6天、 6天和 1?10天。
11、 如权利要求 9所述的中药组合物， 其特征在于： 所述的液体培养基 为重量百分比： 蚕蛹粉 2.0%, 蛋白胨 1.5%, 玉米粉 1.8%, 蔗糖 1.6%, 磷 酸二氢钾 0.1%, 硫酸镁 0.05%, 其余为水分；
当所述的原料 C 为隐孔菌时， 所述的液体培养基较佳的为重量百分含 量：葡萄糖 0.6%-3.0%，麦芽糖 1.5%-1.8%，玉米粉 0-0.3%,蛋白胨 0.1%-0.5%， 酵母粉 0.8%-1%， KH2P04 0.1%, MgS04-7H20 0.05%,维生素 0.05%-0.1%, 琼脂 0-2·7%， pH 4.5-5.0, 其余成分为水。
12、 如权利要求 1~11任一项所述的中药组合物的制备方法， 其特征在 于： 按配方， 将各成分均匀混合即可。
13、 如权利要求 1~11任一项所述的中药组合物在制备预防或治疗纤维 化疾病的药物中的用途。
14、 如权利要求 13所述的用途， 其特征在于： 所述的纤维化疾病包括 心脏纤维化疾病、 肺脏纤维化疾病、 肾脏纤维化疾病或肝脏纤维化疾病。
Description:
预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物及制备方法和用途 技术领域
本发明属于医药领域，特别涉及一种预防或者治疗纤维化疾病的中药组 合物及制备方法和用途。 背景技术
组织纤维化是内外致病原引起组织损伤的共同后果， 也是多种感染和非 感染性炎症疾病的基本病理改变。 组织纤维增生不仅见于各种慢性肺疾病、 心血管疾病、 慢性进行性肾病、 肝硬化、 慢性胰腺炎、 系统性红斑狼疮以及 黄斑变性等， 而且能够影响肿瘤生长与转移、 促进器官移植的慢性排斥反应 发生。事实上，组织纤维化累及人体几乎所有器官和系统，是许多疾病致残、 致死的主要原因， 严重威胁人类健康。 据美国有关统计资料证明， 因各种疾 病而致死的病人中， 接近 45%可以归于各种组织纤维增生疾病。 长期以来， 抗炎药， 特别是糖皮质激素， 是治疗肺纤维化的主要药物， 然而， 糖皮质激 素的治疗不仅副作用大，效果不确切，长期使用还可能加重肺纤维化的发展。
纤维增生性疾病属于典型的由遗传、环境等多种因素参与的慢性复杂疾 病， 其发病机制是由多靶点失衡造成的， 单靶点药物难以获得足够的治疗效 果， 并且毒副作用较大。 对多种纤维化疾病模型的研究发现， 纤维化疾病是 一类 Th2免疫反应占优势的疾病， Th2免疫反应是维持机体及受损组织处于 慢性炎症状态、 促进组织发生纤维化的原凶。 Th2 细胞因子如 IL-5、 IL-13 能促进和加重器官纤维化； 相反， Thl细胞因子如干扰素 γ则具有抗纤维化 的作用。 目前，组织纤维增生性疾病仍然没有针对性有效的治疗方案。因此， 开发新的抗组织纤维化药物以提高患者生活品质和降低死亡率， 是一件迫在 眉睫的事。 发明内容 本发明要解决的技术问题就是针对的现有技术缺乏有效的预防或治疗 纤维化疾病的药物的不足， 提供一种新的预防或者治疗纤维化疾病的中药组 合物及制备方法和用途。
本发明提供一种预防或者治疗纤维化疾病的中药组合物， 其配方包括： 原料 A和 /或原料 A的提取物； 所述的原料 A的提取物为水或乙醇水溶液的 提取物； 其中， 所述的原料 A包括黄芪、 黑木耳 uricularia auricula ( L. exHooke ) Underw) , 三七、 以及灵芝 B ; 所述的灵芝 B为赤芝 Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. ) 禾口 /或紫芝 ( Ganoderma sinense Zhao , Xu et Zhang ) ; 所述的黄 、 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke ) Underw)、 '三七、 以及灵芝 B之间的重量比为 9-30： 9-30： 1-9： 6~12。
本发明中， 所述的黄 、 黑木耳 (Auricularia auricula ( L. exHooke ) Underw) , 三七、 以及灵芝 B之间的重量比较佳的为 12 : 9： 1： 6。 需要说 明的是，本发明中所说的原料 A的重量比均以原料的重量计量， 即若本发明 中药组合物配方中使用的是原料 A 的提取物， 在计算用量时也以其原料 A 的重量计量。
本发明中， 所述的黄芪、 三七本领域技术人员均知， 均为中国药典收录 名称定义的中药材。
本发明中， 所述的赤芝 ( Ganoderma Lucidum ( Leyss. ex Fr. ) Karst. )、 紫芝 Ganoderma sinense Z o , Xu et Zhang )为本领域常规所用药材， 为中 国药典收录， 其中， 所述的紫芝 Ganoderma sinense Zhao , Xu et Zhang ) 的 同物异名为紫芝 ( Ganoderma japonicum (Fr.) Lloyd )
本发明中， 所述的原料 A在直接使用时， 一般按本领域常规粉碎使用， 较佳的使粒径大小过 40目筛即可。
本发明中，所述的原料 A的提取物一般按本领域常规方法制得， 较佳的 按下述方法制得： 将原料 A用 3?10 重量倍数的水或 3?10 重量倍数的 70v/v%?95 v/v %乙醇水溶液回流提取 2~3次， 每次提取 1?3小时， 合并 提取液， 过滤， 浓缩， 干燥， 粉碎即可。
其中，所述的原料 A的提取物在制备时按本领域常规操作， 既可以将原 料 A中各原料分别制备提取物后混合， 也可以各原料混合后再制备提取物。
其中， 当将原料 A中各原料分别制备提取物后混合时，黄芪的提取物的 提取时间较佳的为 1-2 小时； 黑木耳 uricularia auricula (L. exHooke) Underw) 的提取物的提取时间较佳的为 1.5?3 小时； 三七的提取物、 以及 灵芝 B的提取物的提取时间分别较佳的为 2~3小时。
本发明中， 所述的中药提取物较佳的还含有原料 C和 /或原料 C的发酵 培养物， 所述的原料 C为冬虫夏草 ( ordyceps sinensis (Berk.) Sacc) 和 / 或隐孑 L菌 ( Crytoporus volvatus (Peck.) Hubbara. )。
其中， 所述的冬虫夏草 (Xordyceps sinensis (Berk.) Sacc) 的发酵培养 物较佳的为蝙蝠蛾被毛孢 iHiresutella hepiali Chen et Shen. (1985))的发酵培 养物； 蝙蝠蛾被毛孢（Hr??(TM) //a ?^a/ Chen et Shen. (1985))的同种异名为 中国被毛孢 iHiresutella sinensis X.J.Liu, Y.L. Guo. (1989))。
其中， 所述的隐孔菌（C ^/wn^vo/ra (Peck.) Hubbara.)的发酵培养 物较佳的为中华隐孔菌 （ to/?on<< Sheng H. Wu & M. Zang) 的发 酵培养物。
本发明中，所述的冬虫夏草发酵培养物为按本领域常规发酵方法将冬虫 夏草发酵培养获得， 较佳的由下述方法制得： 将冬虫夏草菌种接种至液体培 养基中， 之后进行通气培养得发酵培养物， 干燥即可。 所述的冬虫夏草菌种 为按本领域常规方法经过二级或三级种子培养获得的菌种。
其中，所述的二级种子培养是指依次经过斜面菌种培养、摇瓶种子培养、 一级和二级种子罐培养。 所述的三级级种子培养是指依次经过斜面菌种培 养、 摇瓶种子培养、 一级、 二级和三级种子罐培养。 所述的培养的条件为本 领域常规操作， 较佳的为 10°C?18°C、 pH6.0?7.5。 所述的斜面菌种培养、 摇瓶种子培养、一级、二级和三级种子罐培养的培养时间，较佳的分别为 30? 60天、 10天、 6天、 6天、 6天和 6?12天。
其中， 所述的液体培养基为本领域常规使用， 较佳的为重量百分比的碳 源 0.5%?5%， 氮源 0.2%?5%、 微量元素、 维生素， 补足余量的水； 更佳 的为重量百分比： 蚕蛹粉 2.0%, 蛋白胨 1.5%, 玉米粉 1.8%, 蔗糖 1.6%, 磷酸二氢钾 0.1%, 硫酸镁 0.05%, 其余为水分。
其中， 所述的通气按本领域常规操作， 一般为通入无菌空气。
其中， 所述的干燥为本领域常规操作， 较佳的为喷雾干燥。 所述的干燥 可按本领域常规， 直接将发酵培养物匀桨后干燥， 也可以先过滤得菌丝体和 发酵滤液 （或经膜分离获得有效发酵滤液） 之后分别干燥。
本发明中，所述的隐孔菌发酵培养物为按本领域常规发酵方法将隐孔菌 发酵培养获得， 同前述冬虫夏草发酵培养物的制备方法， 即较佳的由下述方 法制得： 将隐孔菌菌种接种至液体培养基中， 之后进行通气培养得发酵培养 物， 干燥即可。所述的隐孔菌菌种为按本领域常规方法经过二级或三级种子 培养获得的菌种。
其中， 所述的二级种子培养、 三级级种子培养如前所述。 所述的培养的 温度为本领域常规操作， 较佳的为 20°C?30°C。所述的斜面菌种培养、摇瓶 种子培养、 一级、 二级和三级种子罐培养的培养时间， 较佳的分别为 3?10 天、 6天、 6天、 6天、 6天和 1?10天。
其中， 所述的液体培养基、 通气、 干燥的操作同前述冬虫夏草发酵培养 物制备操作条件。 所述的液体培养基较佳的为重量百分含量： 葡萄糖 0.6%-3.0%, 麦芽糖 1.5%-1.8%， 玉米粉 0-0.3%, 蛋白胨 0.1%-0.5%， 酵母粉 0.8%- 1%, KH2P04 0.1%, MgS04-7H20 0.05%, 维生素 ^ 0·05%-0·1%， 琼脂 0-2.7%, ρΗ 4.5-5.0, 其余成分为水。
本发明中， 所述的原料 C和 /或原料 C的发酵培养物的用量较佳的为重 量份数 3~20， 更佳的为 3~9。 所述的原料 C的发酵培养物计量以原料 C的 发酵培养物重量计。 本发明中，所述的灵芝 B和 /或灵芝 B提取物还可以被替代为原料 C和 / 或原料 C的发酵培养物， 获得本发明的中药提取物。
本发明中， 所述的中药组合物还可以含有药学上可接受的载体。
本发明中， 所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体。 其中， 稀释剂如淀粉、糖粉、 糊精、 微晶纤维素、 甘露醇、 乳糖和大豆油等； 粘合剂如聚乙烯吡咯垸酮或羟丙基纤维素等； 崩解剂如羧甲基纤维素钠或低 取代羟丙纤维素等； 润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉等； 稳定剂如羧甲基纤维素 钠或环糊精等； 防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或苯甲酸钠等。 另外， 还可以在 该药物组合物中加入其他辅助剂如香味剂和 /或甜味剂如蔗糖、果糖和天冬甜 素等。 该药物组合物的活性成分是治疗有效量的上述的本发明的提取物。 该 药物组合物可采用医学领域常规的方法，将所述的活性成分与药学上可接受 的载体制成各种剂型。 用于口服时， 可将其通过常规方法包括混合、 制粒、 干燥、装胶囊或压片或分装成颗粒剂等制备成常规的固体制剂如片剂、胶囊、 软胶囊、 液体制剂、 颗粒剂、 煎膏剂、 丸剂、 悬浮剂、 分散剂或糖桨剂等。 本发明的中药组合物较佳经口服途径应用， 安全有效。 所述的中药组合物的 使用剂量根据患者的年龄和病情而定， 常用的每日剂量约为 0.g， 优选 0.01~50g， 更优选 0.1~20g， 给药次数一天一次或数次。
本发明还提供前述中药组合物的制备方法为按配方，将各成分均匀混合 即可。
本发明还提供前述的中药提取物在制备预防或治疗纤维化疾病的药物 中的用途。
本发明中， 所述的纤维化疾病一般包括心脏纤维化疾病、 肺脏纤维化疾 病、 肾脏纤维化疾病或肝脏纤维化疾病等在内的具有纤维增生性特征的疾 病。
其中， 所述的肺纤维化疾病通常由慢性阻塞性肺病（COPD)、特发性肺 纤维化或间质性肺炎等疾病引起或伴发。本发明中药组合物能有效治疗经典 药物性导致肺纤维化疾病模型 （博来霉素模型）。
其中， 所述的心脏纤维化疾病通常由高血压心脏病、 冠状动脉粥样硬化 性心脏病 （又称冠心病）、 扩张性心肌病、 肥厚性心肌病、 心律失常 （特别 是心房纤颤或室性心动过速）或慢性心衰等疾病引起或伴发。 本发明中药组 合物能有效治疗经典药物性导致心脏纤维化疾病模型 （阿霉素模型）。
其中， 所述的肝纤维化疾病 （肝硬化）通常由病毒性肝炎、 酒精性肝炎 或脂肪肝等疾病引起或伴发。所述的病毒性肝炎通常是指甲肝、乙肝或丙肝。
其中， 所述的肾纤维化疾病包括终末期肾病 （各种原因引起的肾衰）， 通常由可导致肾衰的肾小管、 肾小球等疾病引起或伴发。 本发明中药组合物 能有效治疗经典梗阻性肾病导致肾脏纤维化疾病模型 （单侧输尿管结扎 (UUO) 模型）。
在预防或治疗纤维化疾病时， 本发明的中药组合物可以单独使用或者 与其他没有拮抗作用的药物联合使用。
本发明中， 为方便表达及描述， 在附图说明及具体实施方式中将本发明 的中药组合物以缩写 CFZ代替。
本发明中， 上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合， 即得 本发明各较佳实例。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外， 均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、 本发明的中药组合物可以同时作用于多个靶点， 降低单靶点药物引 起的副作用， 各成分有协同作用药效治疗效果超过单组份药效的总和。
2、 本发明中药组合物在预防和逆转肺纤维化的应用中， 对于小鼠纤维 化疾病， 包括心脏纤维化疾病、 肺脏纤维化疾病、 肾脏纤维化疾病或肝脏纤 维化疾病等在内的具有纤维增生性特征的疾病具有明显的预防或治疗效果； 能显著抑制博莱霉素引起的肺纤维化： 降低肺纤维化小鼠的死亡率， 降低肺 纤维化小鼠的肺重指数； 降低肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸、 胶原的含量， 并降低与肺纤维化相关的 α-肌动蛋白 （α-SMA) 的表达， 减少肺纤维化小鼠 肺泡灌洗液中多种炎性细胞的数量；增加肺脏中抑纤维化的 Thl细胞因子的 分泌， 减少促纤维化的 Th2细胞因子的分泌， 调节纤维化肺脏的抑制性免疫 微环境。
3、 本发明的中药组合物在预防和逆转阿霉素 （DOX) 所致扩心病心室 异常重构及心肌组织纤维化的应用中， 能显著改善阿霉素所致扩心病心室异 常重构及心肌组织纤维化； 可以显著抑制左心室舒张期前壁厚度、 后壁厚度 和室间隔厚度的减小， 显著抑制舒张期左室内径的增加， 显著改善体现心脏 收缩和舒张功能的各项指标， 表现为心脏射血分数、 左心室短轴缩短率、 左 心室收缩压上升最大速率、 左心室舒张压下降最大速率增加， 降低心肌中胶 原的含量， 并降低与纤维化相关的 (χ-SMA的表达， 抗心脏组织纤维化表现为 与改变组织 Thl/Th2免疫极化方向， 增强抗组织纤维化因子的表达， 抑制促 组织纤维化因子表达关系密切。
4、 本发明的中药组合物在预防和逆转单侧输尿管结扎 （UUO) 诱导的 肾纤维化病变的应用中， 能够减轻单侧输尿管结扎所诱导的小鼠肾纤维化， 表现为减少肾组织的胶原沉积， 上调上皮细胞特征性蛋白 E-钙粘素表达，减 少活化的成纤维细胞标志性蛋白 α-SMA表达。 附图说明
图 1为预防性给予样品药物降低博莱霉素引起肺纤维化小鼠的死亡率随 时间变化关系图； 其中， 博来霉素造模后第 7天开始给予中药组合物或干扰 素 -γ， CFZ低为低剂量组（lg/kg/day)， CFZ中为中剂量组（2g/kg/day)， CFZ 高为高剂量组 （4g/kg/day); ##P&0.01 vs假手术组； *P&0.05 vs模型组。
图 2为预防性给予样品药物降低肺纤维化小鼠的肺脏胶原沉积 Masson 染色图， 及绝对胶原面积比较图； 其中， 博来霉素造模后第 7天开始给予中 药组合物或干扰素 γ， CFZ低为低剂量组 （lg/kg/day)， CFZ中为中剂量组 (2g/kg/day) , CFZ高为高剂量组 （4g/kg/day) ; ###P&0.001 vs假手术组； *P&0.05 , ***Ρ&0·001 vs模型组。
图 3为预防性给予样品药物对肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响 图； 其中， 博来霉素造模后第 7天开始给予中药组合物或干扰素 γ; CFZ低 为低剂量组（lg/kg/day)， CFZ中为中剂量组（2g/kg/day)， CFZ高为高剂量 组 （4g/kg/day) ; 置&謹 vs假手术组； *P&0.05， **P&0.01 vs模型组。
图 4为预防性给予样品药物对小鼠肺组织 a-SMA表达水平的影响图； 其中， 博来霉素造模后第 7天开始给予中药组合物或干扰素 γ， CFZ低为低 剂量组 （lg/kg/day)， CFZ 中为中剂量组 （2g/kg/day)， CFZ 高为高剂量组 (4g/kg/day) ; ##P&0.01 vs假手术组， *P&0.05 vs模型组。
图 5为预防性给予样品药物对肺纤维化小鼠的肺脏炎症影响的 HE染色 图， 及炎症对比图； 其中， 博来霉素造模后第 7天开始给予中药组合物或干 扰素 γ， CFZ低为低剂量组 （lg/kg/day)， CFZ中为中剂量组 （2g/kg/day)， CFZ 高为高剂量组 （4g/kg/day ) ; ### P&0.001 vs 假手术组； **P&0.01， ***P&0.001 vs模型组。
图 6为预防性给予样品药物对肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞 影响的数量对比图； 其中， 博来霉素造模后第 7天开始给予中药组合物或干 扰素 γ， CFZ低为低剂量组 （lg/kg/day)， CFZ中为中剂量组 （2g/kg/day)， CFZ高为高剂量组（4g/kg/day) ; ##P&0.01 , ###P&0.001 vs假手术组； *P&0.05 vs模型组。
图 7为预防性给予样品药物对肺纤维化小鼠肺组织 Thl、 Th2细胞因子 分泌的调节作用 （ELISA) 含量对比图； 其中， 博来霉素造模后第 7天开始 给予中药组合物或干扰素 γ， CFZ低为低剂量组 （lg/kg/day)， CFZ中为中 剂量组（2g/kg/day)， CFZ高为高剂量组（4g/kg/day) ; ##P&0.01 , ###P&0.001 vs假手术组； *P&0.05， ** P&0.01 vs模型组。
图 8为治疗性给予样品药物对博莱霉素引起肺纤维化小鼠的死亡率随时 间变化关系图； 其中， 博来霉素造模后第 14天开始给予中药组合物或干扰 素 γ， CFZ中 Af为中剂量治疗组 （2g/kg/day)， CFZ高 Af为高剂量治疗组 (4g/kg/day); ##P&0.01 vs假手术组； *P&0.05 vs模型组。
图 9 为治疗性给予样品药物对肺纤维化小鼠作用的肺脏胶原沉积 Masson染色图， 及绝对胶原面积比较图； 其中， 博来霉素造模后第 14天开 始给予中药组合物或干扰素 γ， CFZ中 Af为中剂量治疗组（2g/kg/day)， CFZ 高 Af为高剂量治疗组 （4g/kg/day); ### PO.001 vs假手术组， ** P&0.01， *** P&0.001 vs模型组。
图 10为治疗性给予样品药物对肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量的影 响图； 其中， 博来霉素造模后第 14天开始给予中药组合物或干扰素 γ， CFZ 中 Af为中剂量治疗组（2g/kg/day)， CFZ高 Af为高剂量治疗组（4g/kg/day); ##P&0.01 vs假手术组， ** P&0.01 vs模型组。
图 11 为预防性给予样品药物对阿霉素所致扩心病小鼠心室扩张的影响 图， 代表性心脏切片 （图 A左） 和超声心动图 （图 A右）， 左心室超声心动 图参数 （图 B、 C、 D和 E)， 左心室舒张期前壁厚度 （LVAWd)、 后壁厚度 (LVPWd)、 室间隔厚度 （IVSd) 及舒张期左室内径 （LVDd) ; #P&0.05 , ##P&0.01 vs 正常组； *P&0.05 vs模型组。
图 12为预防性给予样品药物对阿霉素致扩心病小鼠心功能的影响图； CFZ对心脏射血分数 （EF)、 左心室短轴缩短率 （FS ) 的影响 （图 A和 B) , CFZ对左心室收缩压上升最大速率 （+dP/dtmax)、 左心室舒张压下降最大速 率 （-dP/dtmax)、 心率 （HR)、 平均动脉压 （MAP) 等血流动力学指标的影 响 （图 C-F); #P&0.05, ##P&0.01 vs 正常组； *P&0.05, *P&0.01 vs模型组。
图 13为预防性给予样品药物对阿霉素致扩心病小鼠心脏组织纤维化影 响图； 心肌组织切片 HE染色 （图 A) , 心肌组织切片 Masson's染色分析心脏 组织纤维化 （图 B和 D); 免疫组化检测 α-SMA表达 （图 C和 E); ## P&0.01 vs 正常组， * P&0.05 vs模型组。 图 14为预防性给予样品药物对阿霉素致扩心病小鼠心脏 Thl/Th2平衡的 影响图； CFZ抑制转化生长因子 -β (TGF-β)表达（图 Α和 C)， CFZ促进干扰 素 γ表达（图 B和 D); CFZ增加干扰素 γ/转化生长因子 β比值（IFN-Y/TGF-P) (图 E); ## p&0.01, 漏 pO.OOlvs 正常组， **p&0.01, *** p&0.001 vs模型组。
图 15为预防性给予样品药物对阿霉素致扩心病小鼠心脏组织氧化应激 反应影响图； 超氧化物歧化酶 （SOD) 检测 （图 A), 丙二醛 （MDA) 检测 (图 B); ##p&0.01 vs 正常组， **p&0.05， ***p&0.01 vs模型组。
图 16为预防性给予样品药物对单侧输尿管结扎致小鼠肾纤维化影响图， 肾组织切片 Masson's染色和 α-SMA染色（图 A), 肾小管损伤评分（图 B), 肾 纤维化评分 （图 C), 小鼠肾外观 （图 D), α-SMA半定量评价 （图 E), 蛋白 质印迹检测 a-SMA表达（图 F); #p&0.05, ##p&0.01, ###p&0.01 vs假手术组， *p&0.05, **p&0.01, ***p&0.001 vs模型组。
图 17为预防性给予样品药物对基质金属蛋白酶（MMPs) /基质金属蛋白 酶抑制物（TIMPs)平衡影响图；代表性 RT-PCR结果（图 A),前胶原 I、a-SMA、 基质金属蛋白酶抑制物 1 (TIMP1)和基质金属蛋白酶（MMP2) 的表达和分 析 （图 B-E)， MMPs/TIMPs比值 （图 F); #p&0.05, ##p&0.01, ###P&0.001 vs 假手术组； *p&0.05vs模型。
图 18为治疗性给予样品药物对单侧输尿管结扎致小鼠肾纤维化影像图 (14天）， 肾组织切片 Masson's染色图（放大 100倍， 图 A, 放大 400倍， 图 B), 肾组织切片以抗 a-SMA抗体染色观察激活的成肌纤维细胞 （图 C) 和以 E-钙 粘素染色观察肾上皮细胞（图 D)， CFZ减少肾胶原面积（图 E), 蛋白质印迹 检测 a-SMA和 E-钙粘素表达 （图 F); CFZ高为高剂量给药组 （4g/kg/day)， CFZ低为低剂量给药组 （lg/kg/day)， ##p&0.01, ###p&0.01 vs 假手术组； **p&0.01, ***p&0.001 vs模型组。
图 19为治疗性给予样品药物对单侧输尿管结扎致小鼠肾纤维化影响图 (21天）， 其中， 肾组织切片 Masson's染色 （放大 100倍， 图 A, 放大 200倍， 图 B)， CFZ减少肾胶原面积和胶原面积比值（图 C)， 蛋白质印迹检测 a-SMA 和 E-钙粘素表达 （图 D); CFZ高为高剂量给药组 （4g/kg/day)， CFZ低为低 剂量给药组 （lg/kg/day); #p&0.05 , ###p&0.01 vs 假手术组； *p&0.05， **p&0.01, ***p&0.001 vs模型组。
图 20为治疗性给予样品药物对单侧输尿管结扎致肾纤维化小鼠肾功能 影响图； 单侧输尿管结扎 14天， 结扎一侧肾和对侧正常肾、 脾重和体重分析 (图 A-F); 单侧输尿管结扎 21天， 结扎一侧肾和对侧正常肾、 脾重和体重分 析（图 G-L),肾功能以血清肌酐（图0、 E)和尿素氮（图】、 K)评价； ##p&0.01， ###p&0.01 vs假手术组； *p&0.05， **p&0.01 vs模型组。 具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明， 但本发明并不受其限制。 下列实 施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商 所建议的条件。
酉己方： 黄 1500g， 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 2000g， 三七 500g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. ) 1500g (质量比为 9: 12： 3： 9)。
制备步骤：
(1) 黑木耳提取物的制备： 黑木耳加 10倍量水提取 3次， 每次提取 1 小时， 合并提取液， 滤过， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛的细粉， 备用。
(2) 黄芪、 三七、 灵芝分别粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。 (3) 黑木耳提取物、 黄芪、 三七、 灵芝混匀后， 制粒， 干燥， 装胶囊， 即得。
实施例 2 酉己方： 黄 750g， 黑木耳 ( Auricularia auricula (L. exHooke) 2500g， 三七 750g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. ) ) lOOOg (质量比为 9: 30： 9： 12)。
制备步骤：
( 1 )黑木耳提取物的制备：黑木耳加 6倍量 95%乙醇水溶液提取 2次， 每次 1.5小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细 粉， 备用。
(2) 黄芪、 三七、 灵芝分别粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。 (3) 黑木耳提取物、 黄芪、 三七和灵芝混匀， 制粒， 干燥， 压片即得。 实施例 3
酉己方： 黄 1600g， 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 1200g， 三七 400g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. ) ) 1600g (质量比为 8: 6： 2： 8)。
制备步骤：
(1) 黄芪提取物的制备： 黄芪加 3倍量 70%乙醇水溶液提取 3次， 每 次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎成细粉， 备用。
(2) 三七提取物的制备： 三七加 5倍量 60%乙醇水溶液提取 3次， 每 次 2小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(3) 黑木耳、 灵芝粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(4) 黄芪、 三七提取物、 黑木耳、 灵芝混匀， 制粒， 干燥， 分装成颗 粒剂， 即得。
酉己方： 黄 1600g， 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 1600g， 三七 1200g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. ) ) 800g (质量比为 8: 8： 6： 4)。 制备步骤：
(1)黄芪提取物的制备： 黄芪加 5倍量水提取 3次， 每次提取 2小时， 合并提取液， 滤过， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(2) 黑木耳提取物的制备： 黑木耳加 10倍量 95%乙醇水溶液提取 2 次， 每次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛 的细粉， 备用。
(3) 三七、 灵芝粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(4) 黄芪提取物、 黑木耳提取物、 三七、 灵芝混匀， 制粒， 干燥， 装 胶囊， 即得。
酉己方： 黄 1200g， 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 3000g， 三七 100g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. ) ) 900g (质量比为 12: 3： 1： 9)。
制备步骤：
(1) 黄芪提取物的制备： 黄芪加 3倍量 7(^ %乙醇水溶液提取 3次， 每次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛的细 粉， 备用。
(2)黑木耳提取物的制备： 黑木耳加 5倍量 60 V/V%乙醇水溶液提取 3 次， 每次 2小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛 的细粉， 备用。
(3) 灵芝粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(4) 黄芪提取物、 黑木耳提取物、 三七、 灵芝混匀， 制粒， 干燥， 分 装成颗粒剂， 即得。
酉己方： H 3/4
2500g, 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 750g， 三七 750g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. ) ) 750g (质量比为 10: 3： 3： 3)。
制备步骤：
(1)黄芪提取物的制备： 黄芪加 5倍量水提取 3次， 每次提取 2小时， 合并提取液， 滤过， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(2)灵芝提取物的制备： 灵芝加 10倍量 95%乙醇水溶液提取 2次， 每 次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(3) 黑木耳、 三七粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(4) 黄芪提取物、 灵芝提取物、 黑木耳、 三七混匀， 制粒， 干燥， 压 片， 即得。
酉己方： H 3/4
3000g, 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 1200g， 三七 100g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. ) ) 1200g (质量比为 30: 12： 1： 12)。
制备步骤：
(1) 黄芪提取物的制备： 黄芪参加 6倍量 95%乙醇水溶液提取 2次， 每次 1.5小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细 粉， 备用。
(2)黑木耳、 三七、 灵芝分别粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。 (3) 黄芪提取物、 黑木耳、 三七和灵芝混匀， 制粒， 干燥， 压片即得。 实施例 8
配方： 黄芪 2000g， 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 2000g, 三七 200g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. ) ) 400g (质量比为 10: 10： 1： 2)o
制备步骤：
(1) 黑木耳提取物的制备： 黑木耳加 10倍量水提取 3次， 每次提取 1 小时， 合并提取液， 滤过， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛的细粉， 备用。
(2) 黄芪、 三七、 灵芝分别粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。 (3) 黑木耳提取物、 黄芪、 三七和灵芝混匀后， 制粒， 干燥， 装胶囊， 即得。
酉己方： H 3/4
2400g, 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 1800g， 三七 200g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. ) ) 1200g (质量比为 12: 9： 1： 6)。
制备步骤：
(1) 黄芪提取物的制备： 黄芪加 3倍量 70%乙醇水溶液提取 3次， 每 次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(2)黑木耳提取物的制备：黑木耳加 5倍量 60%乙醇水溶液提取 3次， 每次 2小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛的细 粉， 备用。
(3)灵芝提取物的制备： 灵芝加 10倍量 95%乙醇水溶液提取 2次， 每 次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(4) 三七粉碎成细粉， 备用。
(5) 黄芪提取物、 黑木耳提取物、 三七和灵芝提取物混匀， 制粒， 干 燥， 分装成颗粒剂， 即得。
酉己方： 黄 1800g， 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 1800g， 三七 200g， 灵芝 (赤芝 ( Ganoderma Lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst. ) ) 1200g (质量比为 9: 9： 1： 6)。 制备步骤：
(1) 黄芪提取物的制备： 黄芪加 3倍量 70%乙醇水溶液提取 3次， 每 次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(2)黑木耳提取物的制备：黑木耳加 5倍量 60%乙醇水溶液提取 3次， 每次 2小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛的细 粉， 备用。
(3) 三七、 灵芝粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(4) 黄芪提取物、 黑木耳提取物、 三七和灵芝细粉混匀， 制粒， 干燥， 装胶囊， 即得。
酉己方： H 3/4
2400g, 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 1800g， 三七 200g， 冬虫夏草 Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc) 1200g (质量比为 12： 9： 1： 6)。
制备步骤：
(1) 黄芪提取物的制备： 黄芪加 3倍量 70%乙醇水溶液提取 3次， 每 次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(2)黑木耳提取物的制备：黑木耳加 5倍量 60%乙醇水溶液提取 3次， 每次 2小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛的细 粉， 备用。
(3) 三七、 冬虫夏草粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(4) 黄芪提取物、 黑木耳提取物、 三七和冬虫夏草细粉混匀， 制粒， 干燥， 分装成颗粒剂， 即得。
酉己方： H 3/4
2400g, 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 1800g， 三七 200g， 隐孔菌 （ to/wn<< vo/wm<< (Peck.)Hubbara.) 1200g (质量比为 12： 9： 1： 6)。
制备步骤：
(1) 黄芪提取物的制备： 黄芪加 3倍量 70%乙醇水溶液提取 3次， 每 次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(2)黑木耳提取物的制备：黑木耳加 5倍量 60%乙醇水溶液提取 3次， 每次 2小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛的细 粉， 备用。
(3) 三七、 隐孔菌粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(4) 黄芪提取物、 黑木耳提取物、 三七和隐孔菌细粉混匀， 制粒， 干 燥， 分装成颗粒剂， 即得。
酉己方： H 3/4
2400g, 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 1800g， 三七 200g， 冬虫夏草发酵培养物 1200g (质量比为 12: 9： 1： 6)。
制备步骤：
(1) 黄芪提取物的制备： 黄芪加 3倍量 70%乙醇水溶液提取 3次， 每 次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(2)黑木耳提取物的制备：黑木耳加 5倍量 60%乙醇水溶液提取 3次， 每次 2小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎、 过筛， 得过 40 目筛的细 粉， 备用。
(3) 三七粉碎、 过筛， 得过 40目筛的细粉， 备用。
(4) 黄芪提取物、 黑木耳提取物、 三七和冬虫夏草发酵培养物混匀， 制粒， 干燥， 分装成颗粒剂， 即得。
冬虫夏草菌发酵培养物的制备： 中国冬虫夏草无性代菌种蝙蝠蛾被毛孢 (Hiresutella hepiali Chen et Shen. (1985)) (浙江赐富医药有限公司出售菌种）在液体培养基上发酵， 获得发酵 上清液、 菌丝体及各种代谢物。 发酵方法为依次斜面菌种培养、 摇瓶种子培 养、一级、 二级种子罐培养、液体发酵罐中通气培养， 10~18°C， pH 6.0-7.5, 分别培养 50、 10、 6、 6、 10天。
液体培养基（重量百分比， ％)为： 蚕蛹粉 2.0， 蛋白胨 1.5， 玉米粉 1.8， 蔗糖 1.6， 磷酸二氢钾 0.1， 硫酸镁 0.05， 其余为水分， 发酵过程中通入无菌 空气。
发酵完毕后固液分离， 得到菌丝体和发酵液， 发酵液再进行膜分离 （超 滤膜， 膜孔径 300)， 收集膜截留液即得到富含有效成分的发酵滤液， 发酵滤 液浓缩后与菌丝体混合、匀桨、喷雾干燥， 即得所述的冬虫夏草发酵培养物。 实施例 14
酉己方： H 3/4
2400g, 黑木耳 (Auricularia auricula (L. exHooke) 1800g， 三七 200g， 隐孔菌发酵培养物 1200g (质量比为 12: 9： 1： 6)。
制备步骤：
(1) 黄芪提取物的制备： 黄芪加 3倍量 70%乙醇水溶液提取 3次， 每 次 3小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎成细粉， 备用。
(2)黑木耳提取物的制备：黑木耳加 5倍量 60%乙醇水溶液提取 3次， 每次 2小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩干燥， 粉碎成细粉， 备用。
(3) 三七粉碎成细粉， 备用。
(4) 黄芪提取物、 黑木耳提取物、 三七和隐孔菌发酵培养物混匀， 制 粒， 干燥， 分装成颗粒剂， 即得。
隐孔菌发酵培养物的制备：
(1) 菌种活化： 将 4°C条件下保存的隐孔菌菌种 Crytopoms sinensis ShengH. Wu&M. Zang) (浙江赐富医药有限公司出售菌种）， 通过无菌操作 移植到培养基中， 在真菌常规培养温度下培养 8天。 培养基组分和重量百分含量为 （％)： 葡萄糖 0.6， 麦芽糖 1.5， 蛋白胨 0.1，酵母粉 0.8， KH2P04 0.1 , MgS04-7H20 0.05,维生素 0.07，琼脂 2.7， ρΗ 4.8， 其余成分为水。
(2 ) 摇瓶培养： 将上述活化的隐孔菌菌丝移入内装 200mL下述培养液 的 500mL三角瓶中， 在震荡频率为 200epm、 温度为 20~30°C条件下在摇床 中震荡培养 6天。
培养液组分和质量 （％) 为： 葡萄糖 0.7， 麦芽糖 1.6， 蛋白胨 0.2， 酵 母粉 1， KH2PO4 0.1， MgS04-7H20 0.05, 维生素 ^ 0.1， pH 5.0, 其余成分 为水。
(3 ) 液体发酵培养： 在 20L发酵罐中装入 14L的下述培养液， 用压差 法移接相当于罐容量 3%摇瓶培养的隐孔菌菌丝液， 在通风量为 1 :0.1~1.0 (v/v/分钟）、 叶轮搅拌速度为 200rpm、 罐压大于 0.05kg/cm2， 温度 20~30°C 条件下发酵 10天。
培养液组分和重量百分含量 （％) 为： 葡萄糖 3.0， 麦芽糖 1.8， 玉米 粉 0.3， 蛋白胨 0.5， 酵母粉 1， KH2P04 0.1， MgS04-7H20 0.05， 维生素 Bi O.05, pH 4.5， 其余成分为水。
(4) 将上述发酵罐内的隐孔菌发酵产物采用常规过滤方法过滤得到菌 丝体和发酵上清液； 隐孔菌菌丝体滤饼在 80~90°C条件下烘干， 粉碎、过筛， 得到颗粒小于 60目的隐孔菌菌粉;发酵上清液 70~80°C旋转蒸发浓缩至密度 为 1.4克 /毫升， 再加热浓缩至稠膏状， 加入上述所得菌粉， 搅拌均匀， 烘干、 粉碎， 过 60目筛， 即得所述隐孔菌发酵培养物。
效果实施例 1 本发明的中药组合物在预防或治疗肺纤维化中的应用
1、 材料和方法
1.1主要试剂：
本效果实施例所用的中药组合物是上述实施例 9 所得的产品， 缩写为 CFZo 实验所用博莱霉素 （BLM) 购自日本化药 （日本化药株式会社）， 批 号 191140。 实验所用干扰素 -γ (干扰素 γ) 购自上海克隆生物高技术有限公 司， 批号 。
1.2实验动物：
实验所用的 SPF级 C57BL/6小鼠 （雄性， 6~8周龄， 16~18g)， 均购自 北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.3肺纤维化动物模型制备：
雄性 C57BL/6 (周龄 6~8周） 小鼠， 隔夜禁食， 戊巴比妥钠 （45mg/kg， i.p. )麻醉， 气管内注射博莱霉素（5U/kg)。 具体方案如下： 以尽量小的创伤 切开颈部皮肤， 在弯头眼科镊的协助下， 暴露气管， 使用微量进样器穿刺气 管， 向气管内注入约 50μ1博莱霉素， 迅速地旋转并直立 5分钟， 以便使博 莱霉素均匀地进入左右肺叶。整个操作在约 60°C左右的手术操作台进行。假 手术组 （Sham) 气管内注射等量的注射用生理盐水。
1.4实验分组：
( 1 ) CFZ预防肺纤维化：
为研究本发明的中药组合物在预防肺纤维化的形成中的效果，将上述制 备的动物模型在造模 7天后分组给药， 分组和给药情况如表 1所示：
表 1肺纤维化动物模型在造模 7天后分组给药的情况
(2) CFZ逆转 BLM引起的肺纤维化
为研究本发明的中药组合物在治疗肺纤维化的形成中的效果， 按上述方 法制备的动物模型在造模 14天后分组给药， 分组和给药情况如表 2所 表 2肺纤维化动物模型在造模 14天后分组给药的情况
(3 ) 测定小鼠死亡率:
从造模当天为第 0天计算， 从给药当天即第 7天或第 14天开始每天统 计各组实验动物死亡情况并进行计算，某组动物未出现死亡的生存率计算为 100%, 某组动物全部死亡的生存率计算为 0%。 造模后第 28天结束实验， 腹腔注射麻醉量 WSmg g )或致死量的戊巴比妥钠（ lOOmg.kg—1 )处死小 鼠， 进行以下 （4) ? (7) 的分析。
(4) 检测小鼠肺泡灌洗液中多种炎性细胞的数量
实验结束当日， 戊巴比妥钠（45 mg/kg， i.p. )麻醉， 小鼠进行颈部解剖， 暴露气管进行插管。 第一次灌注 0.5ml生理盐水， 大约可回收 0.3-0.4 ml灌注 液；第二次灌注 lml生理盐水，大约可回收 0.65-0.8 ml灌注液。3500 rp/min 4°C 离心 20min， 第一次上清用于检测细胞因子分泌情况； 合并两次细胞， 用 lml 含有 1%BSA的 PBS重悬细胞沉淀， 取 ΙΟμΙ重悬液进行细胞计数， 应用血细胞 分析仪进行分析。
回收的灌洗液 4°C， 1500r离心 10分钟， 回收上清置于 -20 °C等待进行细胞 因子检测； 用 lml含有 1%BSA的 PBS重悬细胞沉淀， 取 ΙΟμΙ重悬液进行细胞 计数。 应用血细胞分析仪进行分析。
检测小鼠肺泡灌洗液中细胞因子的含量： 上述收集的肺泡灌洗液用 ELISA法检测细胞因子白介素 -12ρ70、 干扰素 -γ、 白介素 -4、 转化生长因子 -β 的含量， 实验所用细胞因子 ELISA检测试剂盒购自 eBioscience公司， 货号： 88-7314， 88-7121， 88-7944， 88-7344， 具体操作按照说明书上的操作步骤 进行。
( 5 ) 肺纤维化病理评价：
博莱霉素所致纤维化实验病理形态学分析：取动物右侧下叶肺组织， 4% 多聚甲醛固定后石蜡包埋。 在包埋肺组织的蜡块最大横截面切片， HE染色 观察基本病理改变，并根据 HE染色的结果进行炎性分级观察，标准如下 (0~5 级）： 0级： 正常组织。 1级： 极小的炎症改变。 2级： 轻微到中等的炎症改 变， 没有明显的肺组织结构的破坏。 3级： 中等程度的炎症损伤 （肺泡膈膜 增厚）。 4级： 中等程度要重度的炎症损伤， 形成组织团块， 或者局限性肺炎 区域破坏肺组织正常结构。 5 : 严重的炎症损伤， 局部区域肺组织结构严重 破坏引起管腔闭合等。
Masson染色观察纤维化状况， 并根据 Masson特殊染色的结果， 应用彩 色病理图文分析系统 Spot Advanced 3.0获得高清晰的免疫组化染色的病理 图片（200倍）。使用 Image-Pro Plus软件测量出每个视野染色后的着色面积。 每组分析 8~10个标本， 每个标本随机取 12个视野， 取均值代表一个动物胶 原组织在肺组织内的相对含量和表达强度。 通过非参数方差分析比较各组 "视野下胶原绝对面积" 以及 "胶原相对面积" （通过非参数方差分析比较 各组 "视野下胶原绝对面积" ）。
(6) Western Blot分析：
取适量组织， 加入裂解缓冲液（含 0.1mM EDTA、 0.1mM EGTA、 10mM KC1和 lOmM HEPEs以及 50mM NaF， 0.1M Na3V04, 0.1M Na3P04, 蛋白酶 抑制剂 Ιμηιο?/L 的抑蛋白酶肽 （Aprotinin )、 胰蛋白酶抑制剂 （Trypsin inhibitor),苯甲基磺酰氟（PMSF)、亮肽素（Leupeptins)和二硫苏糖醇（DTT) 匀桨后，冰上放置 15min， 间或振荡；迅速加入 10% NP-40混匀， 4°C、 12000 rpm， 离心 5min。 取上清， 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度， 调节蛋白浓度至相 同用于 Western Blot分析。 Western Blot实验中使用 Amersham显色液（华美 公司 NBT/BCIP 染色试剂盒 IK5030 ) 显色， 经 Western-blot 分析软件 ( gelPro32 ) 测出各条带的光密度值分析。
( 7 ) 羟脯氨酸测定：
羟脯氨酸在胶原蛋白中占 13.4% , 在弹性蛋白中占极少量， 其他蛋白中 均不存在， 因此通过羟脯氨酸检测胶原蛋白的含量。 检测动物左肺全叶羟脯 氨酸的含量， 评价肺纤维化的情况。 具体方法如下： 取动物左侧全部肺叶， 记录湿重， 生理盐水超声匀桨制备成 10%的组织匀桨， 取约 150μ1的匀桨上 清液， 加 500μ1碱水解液， 涡旋混匀后， 120度 O. lKpa条件下碱水解法处理 40min (方法参照南京建成生物工程技术有限公司试剂盒说明书）， 按照说明 书（氯胺 T法）进行羟脯氨酸测定， 调 pH值后定容， 活性炭处理后取上清。
3、 实验结果
统计分析： 实验结果用平均值 ±SE表示， 使用方差分析 ANOVA, 各组比 较后有差异后选择适宜的检验方法进行多组样本均值的两两比较。统计学分 析的结果 p&0.05认为有差异， p&0.01认为有显著性差异。
本发明采用 C57BL/6小鼠经气管注射博来霉素造成的肺纤维化动物模 型， 检测 CFZ对博来霉素所致肺部炎症和肺纤维化的调节作用： 博来霉素损 伤小鼠后 0~7天内开始给予药物， 为预防性给药； 而博来霉素损伤后第 8~14 天开始给予药物， 为治疗性给药。
3.1、 CFZ预防 BLM诱导的肺纤维化：
首先在造模后第七天开始给药， 观察 CFZ预防肺纤维化的效果。
结果表明， 造模后第 28天博来霉素引起的肺纤维化模型小鼠生存率在 42%左右， 预防性给予 CFZ , 中剂量和高剂量可显著的增加动物的生存率 (p&0.05 ) , 低剂量治疗有增加动物生存率的趋势， 但与模型组相比没有显 著性差异 （见图 1 )。 与假手术组相比， 模型组动物肺脏胶原表达、 纤维化指 数、 羟脯氨酸含量及 α-SMA (肌成纤维细胞活化的标志蛋白 α-平滑肌肌动蛋 白） 表达均显著增加； 预防给予 CFZ后， 中剂量组及高剂量组对肺脏胶原沉 积、 纤维化指数、 羟脯氨酸含量及 (X-SMA表达均显著降低 （见图 2?图 4)。
3.2、 CFZ预防降低炎症反应， 调节纤维化肺脏的抑制性免疫微环境 博来霉素损伤肺脏引起的纤维化小鼠的肺脏中， 肺泡有大量的炎性细胞 浸润， 炎症病理指数显著增加； 预防给予 CFZ后， 肺泡炎性细胞浸润显著减 少， 炎症病理指数显著降低（/?&0.05 )。 由于 CFZ具有免疫调节作用， 我们检 测了肺脏灌注液中炎性细胞因子的分泌情况（图 5 )。 结果显示， 与假手术组 相比， 模型组动物灌洗液中 Thl型细胞因子 IL-12p70和干扰素 γ分泌显著减少 (/?&0.01 ) , Th2型细胞因子 IL-4和 TGF-β分泌显著增加 （/?&0.01 ); 预防给予 CFZ后， 各剂量组均显著增加 Thl型细胞因子分泌， 减少 Th2型细胞因子的分 泌， 显示 CFZ具有调节肺纤维化时抑制性免疫微环境的作用 （见图 5?图 7)。
3.3、 CFZ逆转 BLM引起的肺纤维化
本发明进一步在博来霉素损伤后第 14天， 给予 CFZ进行治疗， 观察 CFZ 对肺纤维化的逆转作用。 由于 CFZ低剂量组在预防给药中未能取得良好效 果， 因此， 治疗时仅设置中剂量组及高剂量组。
结果显示， 给予 CFZ进行治疗， 中剂量和高剂量可显著的增加动物的生 存率 （ρ&0.05 ) (图 8 )。 与假手术组相比， 模型组动物肺脏胶原表达、 纤维 化指数以及肺脏羟脯氨酸含量均显著增加； CFZ治疗后， 中剂量治疗组及高 剂量治疗组肺脏胶原沉积、 纤维化指数和羟脯氨酸含量均显著降低（见图 8~ 图 10)。
结论： 本发明采用 CFZ对纤维化肺脏免疫微环境进行调节， 预防给药和 治疗给药均可显著抑制博莱霉素引起的肺纤维化， 降低肺纤维化小鼠的死亡 率； 减少肺部炎症， 增强肺脏中抑纤维化的 Thl型细胞因子分泌， 减少促纤 维化的 Th2型细胞因子分泌， 调节纤维化肺脏的抑制性免疫微环境。 实验结 果证明， CFZ在肺纤维化疾病方面具有一定的治疗前景。
效果实施例 2 本发明的中药组合物在心脏纤维化中的应用 1、 材料和方法
1.1、 阿霉素 （DOX) 诱导的心肌病模型小鼠制备
实验所用 ICR野生型小鼠购自维通利华公司 （北京） ， 所进行动物实验 均经过动物管理协会批准进行。雄性 SPF级 ICR小鼠， 10周龄， 体重 26-30克， 小鼠经 75%酒精腹部消毒后， 单次腹腔注射阿霉素 （10mg/kg) 造模。 14天 后动物表现出明显的心功能减退和心衰症状， 以及明显的心脏结构、 细胞形 态及组织病理学改变， 表明心肌病模型制备成功。
1.2、 动物实验分组设计
如表 3所示，将 ICR小鼠按体重均衡随机分为 5组。于造模前 1周以及造模 后 2周每天灌胃给予 CFZ低剂量 （lg/kg) ， CFZ中剂量 （2g/kg) 或 CFZ高剂 量 （4g/kg) (本效果实施例所用的中药组合物是上述实施例 9所得的产品实 施例 9 ) 。 第 14天实验结束， 利用超声心动检测系统及血流动力学系统分别 检测小鼠心脏结构与功能， 收集心脏组织与血清备用。 正常对照组与模型组 在相同时间注射等体积的生理盐水。
表 3 CFZ预防阿奇霉素引起扩心病实验分组
1.3、 超声心动检测和血流动力学检测
实验结束时， 小鼠按 50mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉后， 对 其胸腹部进行脱毛处理， 仰卧位固定与超声检测台， 使用 VisualSonics Vevo 770 (VisualSonics, 加拿大） 超声系统进行检测： 先用 10M Hz超声探头对 小鼠心脏长轴方向进行 B型超声监测， 确定左心室乳头肌位置后， 再转为心 脏短轴方向进行监测，并记录其 10~20个心动周期的 M型超声变化图；用 Vevo 770软件分别测量舒张末期左室前壁厚度 （LVAWd ) 、 左室后壁厚度 (LVPWd) 、 室间隔厚度 （LVSd) 、 左心室内径 （LVDd) 、 短轴缩短率 (Fractional Shortening, FS ) 、 射血分数 （Ejection Fraction, EF) 等各项心 脏结构和心功能指标。 次日进行血流动力学检测， 麻醉方法同前， 仰卧位固 定， 颈部正中切口， 分离右侧颈总动脉， 用 PE10导管进行插管至左心室， 连 接血管与压力换能器。 MPA2000生理信号采集仪记录心室内血流动力学的改 变， 计算出反映左室收缩功能的血流动力学指标 -左心室收缩压最大上升速 率 （+dP/dtmax) 以及反映左室舒张功能的指标-左心室舒张压下降最大速率 (-dP/dtmax) 。
1.4、 病理组织学分析
心脏经 4%多聚甲醛固定， 石蜡包埋、 延矢状方向进行切片； 病理切片 经 HE或 Masson's染色后正置显微镜下观察，分别记录心脏整体结构并确定心 脏胶原沉积情况判断纤维化程度， 应用高清晰彩色病理图文分析系统 Spot Advanced 3.0获得高清晰的病理图片 （200倍放大） 。 使用 Image-Pro Plus 5.1 测量每个视野 Masson's染色后胶原着色面积。每组分析 6-8个标本， 每个标本 随机选取 10个视野， 取均值代表一个动物胶原组织在心脏组织内的含量和表 达强度。 通过非参数方差分析比较各组 "胶原相绝对面积" 。
1.5、 免疫组织化学检测心脏组织细胞因子和相关蛋白的表达
免疫组织化学染色检测心脏组织干扰素 γ、 TGF-β (Cell Signaling, MA)、 α-SMA (博士德公司） 表达变化， SP 试剂盒 （SP9001 或 SP9003 ) 和显色 剂 DAB (ZLI-9032) 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。采用 SABC 方 法， 主要步骤包括： 常规脱蜡、 水化； 3 %过氧化氢去除内源性过氧化物酶； 胰酶组织抗原修复； 正常血清封闭； 加一抗 4°C过夜； 加入生物素化二抗， ABC 复合物， DAB 显色； 透明， 封片。 阳性染色为胞桨棕色颗粒， 阴性对 照以 PBS 或正常山羊血清代替一抗。
1.6、 心脏组织丙二醛 （MDA) 及超氧化物歧化酶 （SOD) 检测 预防性给予 CFZ实验中，通过检测 MDA和 SOD的活性， 评价心脏组织氧 化应激水平和清除氧自由基的能力。 新鲜心脏组织匀桨， 离心取上清， 考马 斯亮蓝法蛋白定量； MDA及 SOD测定方法按试剂盒 （南京建成生物有限公 司） 说明。
3、 实验结果
统计分析： 实验结果用均值±标准误 （X±SE)表示， 经参数或者非参数 方差检验， 经比较 p&0.05认为有统计学差异， p&0.01认为有明显统计学差异。
其中， 预防性给药即在造模以前给予药物治疗， 治疗性给药即造模以后 给予药物治疗。 本效果实施例均为预防性给药实验。
3.1、 CFZ抑制 DOX致扩心病小鼠心室扩张
心室异常重构作为扩心病的主要临床表现之一，主要表现为左心室或双 心室异常扩大， 心室壁变薄。对扩心病发病机制的研究认为细胞凋亡丢失和 组织间隙胶原过度沉积参与其中。
我们利用 VasualSonics超声心动检测系统， 记录左心室舒张期前壁厚度 (LVAWd) 、 后壁厚度 （LVPWd) 、 室间隔厚度 （IVSd) 及舒张期左室内 径（LVDd) ， 结果发现 DOX 诱导扩心病后第 14天， 模型组小鼠出现明显的 左心室扩张和心室壁变薄等病理改变， 而 CFZ lg/kg、 2g/kg可以显著抑制 LVAWd, LVPWd和 IVSd的减小， CFZ lg/kg 则可以显著抑制 LVDd 的增加 (图 11， B-E) ， CFZ 4g/kg 的效果并不明显。 随后我们通过对小鼠整体心 脏纵切 HE染色也发现，模型组小鼠心室的确发生明显重构， 给予 CFZ lg/kg、 2g/kg可以显著改善扩心病小鼠心室扩张和心室壁变薄等病理改变（图 11A)。
3.2、 CFZ 抑制 DOX致扩心病小鼠心功能障碍
我们利用 VasualSonics超声心动检测系统及 MPA2000 血流动力学监测 系统， 记录心脏射血分数（EF) 、 左心室短轴缩短率（FS) 以及左心室收缩 压上升最大速率 （+dP/dtmax) 、 左心室舒张压下降最大速率 （-dP/dtmax) 、 心率（HR)、 平均动脉压（MAP )等血流动力学指标。 结果发现， 给予 DOX 后 14 天， 模型组动物 HR和 MAP 有所下降， CFZ 各剂量组均未对该两项指 标产生影响（图 12E， F ) ； EF、 FS P+dP/dtmax 能够反映心脏的收缩功能， 而 -dP/dtmax 则是反映心脏舒张功能的重要指标。 给予 DOX后 14 天模型组 动物表现出左心室收缩和舒张功能的显著下降， CFZ各剂量可以显著改善体 现心脏收缩和舒张功能的各项指标，表现为 EF、 FS、 +dP/dtmax、 -dP/dtmin增 加 （图 12A-D) 。
3.3、 CFZ 抑制 DOX致扩心病小鼠心脏组织纤维化
为了考察 CFZ对于 DOX 引起的扩心病小鼠心脏组织纤维化的影响。 我 们对心脏组织切片进行 Masson's 染色， 结果发现： 给予 DOX 14 天后， 小鼠 心脏组织胶原显著增加， 且多发生于血管组织周围， 形成严重心脏纤维化， 正常组小鼠心脏组织中几乎未见特征性的阳性染色， 而 CFZ预防组胶原染色 则明显少于模型组， 血管周围胶原沉积也明显较模型组少 （图 13A、 B ) 。 半定量分析结果显示模型组胶原面积为正常组的 6倍 （vs 正常， p&0.01 ) ； 与模型组比较， CFZ具有明显的减轻心脏组织纤维化作用， 经 2g/kg 和 4g/kg 两个剂量 CFZ给药后动物心脏组织沉积的胶原面积比模型组分别减少了 40% 和 32.4% (图 13D ) 。 我们随后还检测了活化的成肌纤维细胞特征性蛋白 a-SMA的表达。 从免疫组化切片可以看到， 正常组心脏组织少有 a-SMA 染 色； 给予 DOX后 14天， 模型组心脏组织有大量的 a-SMA强阳性着色， 用药组 也有一定程度的 a-SMA阳性着色， 但强度均明显弱于模型组 （图 13C) 。 半 定量分析结果显示模型组 a-SMA 的表达为正常组的 6.7倍 （vs Normal, p&0.01 ) ； 与模型组比较， CFZ 能够明显地减轻心脏组织 a-SMA的表达， lg/kg、2g/kg和 4g/kg各剂量 CFZ给药后动物心脏组织 a-SMA的表达比模型 组分别减少了 52.5%、 52.6%和 44.7% (图 13E) 。 上述结果提示 CFZ能够抑制 DOX 引起的心脏组织纤维化。 3.4、 CFZ 改善 DOX致扩心病小鼠心脏免疫微环境紊乱
在临床上终末性心功能衰竭的病人往往表现为免疫抑制状态， 心脏组织 中 Th2细胞因子占主导地位， Thl/Th2 显著降低是其主要免疫病理学特征， 适当补充 Thl型细胞因子可以有效改善心肌局部免疫抑制。 因此我们检测了 CFZ对心脏组织免疫状态的调节作用。
我们用免疫组化的方法检测了心脏中 Thl 型细胞因子干扰素 γ和 Th2 型 细胞因子 TGF-β 的表达， 发现在给予 DOX 后 14 天时， 心脏中 TGF-β 的表 达明显增高， 而干扰素 γ表达改变并不明显， 干扰素 y/TGF-β 的比率发生明 显下降； 各剂量 CFZ均可以显著降低 TGF-β 表达， 增加干扰素 γ 表达 （图 14A-D) ， 从而增加干扰素 γ/TGF-P表达比率 （图 14E) 。
3.5、 CFZ抑制 DOX致扩心病小鼠心脏组织氧化应激反应
氧化应激是 DOX导致心脏组织损伤的重要特征， ROS在纤维化的发生中 也起到推波助澜的作用， 它一方面可以损伤线粒体， 诱导凋亡， 加重心肌细 胞的损伤； 另一方面它可以通过诱导促纤维化细胞因子如 TGF-β等促进纤维 化的发生。 超氧化物歧化酶 （SOD) 能清除超氧阴离子自由基， 它不仅是机 体对抗氧化应激损伤的主要酶类分子， 也是对抗组织纤维化的有力因素。 丙 二醛 （MDA) 是机体产生的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸所形 成的脂质过氧化产物， 心脏组织中 MDA的含量能够反映心脏中内脂质过氧 化的程度， 并间接体现组织局部氧化应激状态及细胞损伤程度。
通过检测心脏组织匀桨中 SOD的活力和 MDA的含量， 我们发现： 给予 DOX后 14 天， 小鼠心脏组织中 SOD活力明显下降， MDA含量明显升高， 然 而各剂量 CFZ均可以显著抑制 SOD活力的下降与 MDA含量的升高，并呈现剂 量依赖关系 （图 15A， B) 。
效果实施例 3 本发明的中药组合物在预防或治疗肾脏纤维化中的应用
1、 材料和方法
1.1、 实验动物： SPF级 C57BL/6小鼠 （雄性， 8周龄， 18±2g)购自北京 维通利华实验动物技术有限公司， 动物合格证号 SCXK (京） 。 所 有动物饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物中心， 恒温恒湿， 自由饮 食。
1.2、 主要试剂： 本效果实施例所用的中药组合物是上述实施例 9所得的 产品， 缩写为 CFZ。 组织 RNA提取 Tirzol试剂盒购自 Invitrogen公司。 丙二醛 (MDA) 试剂盒以及超氧化物歧化酶 （SOD) 试剂盒购自江苏南京建成生 物有限公司。 血清肌肝 （Cretinine) 及尿 （Urea) 素氮试剂盒购自中生北控 生物技术股份有限公司。 其它常规化学试剂均为 Sigma公司产品。
1.3、 肾纤维化动物模型制备： 雄性 C57BL/6 (周龄 8周） 小鼠， 禁食过 夜， 戊巴比妥钠 （45mg/kg， i.p. ) 麻醉。 仰卧位固定， 腹部手术部位剃毛， 消毒， 腹正中线切口， 依次切开皮肤、 肌肉暴露腹腔。 在左后腹壁辨认左侧 肾脏及输尿管， 将左侧输尿管在上 1/3部位用组织钳托起， 4-0丝线两点结扎， 两点间距离约 5mm， 剪断输尿管， 关闭腹腔， 依次缝合肌肉皮肤。 假手术组 手术步骤同模型组， 分离输尿管不做结扎。
1.4、 实验分组：
( 1 ) CFZ预防肾纤维化形成
CFZ动物于造模前 7天开始给药 （3g/kg)， 假手术组 （Sham) 以及模型 组动物同时按照 O.lml/lOg的标准给予溶剂水。 各组分别于造模后第 1， 3， 5， 7， 10和 14天处死动物， 取材 （每个时间点每组 8-10只动物）， 分组设计表 4。
表 4 CFZ预防肾纤维化实验分组
(2) CFZ逆转肾纤维化形成实验分组
实验 1 : 造模后分别于第 1， 3， 5， 7， 10和 14天处死动物， 取材 （每个 时间点每组 8-10只动物）。
实验 2: 动物按体重随机分为四组： 假手术组、 模型组、 CFZ高剂量组 和 CFZ低剂量组。 CFZ药物组动物于造模后第 4天开始给药 （高剂量组 4g/kg, 低剂量组 lg/kg)。 假手术组以及模型组动物同时按照 0.1ml/10g的标准给予溶 剂水。 各组分别于造模后第 14及 21天处死动物 （每个时间点每组 13-15只动 物）， 取材。 分组见表 5。
表 5 CFZ逆转肾纤维化实验分组
(3 ) 肾纤维化病理评价及免疫组化
a、 单侧输尿管结扎 （UUO) 所致肾纤维化实验病理形态学分析 取动物左侧肾皮质组织， 4%多聚甲醛固定后石蜡包埋。 HE染色观察基 本病理改变， Masson染色观察纤维化状况， 并根据 Masson特殊染色的结果由 第三方单位（中国疾病预防控制中心辐射安全所北京康宝科技服务部）进行 病理分级观察。 标准如下： 0级， 无纤维化； 1级， 轻度 （+)， 纤维化面积低 于 20%; 2级， 中度（++)， 纤维化面积在 20%~50%之间； 3级， 重度（+++)， 纤维化面积超过 50%。
B、 免疫组织化学
免疫组织化学染色检测肾皮质0^^/[ 、10?^1、？ 1-1 (8&1^ cruz,USA)、 Phospho-p38 MAPK和 Phospho-Smad3 (Cell signaling Technology, USA) 的表 达， SP试剂盒 (SP9001 , SP9003 ) 和显色剂 DAB (ZLI-9032) 由北京中杉 金桥生物技术有限公司提供。 采用 SABC方法， 主要步骤包括： 石蜡切片常规脱蜡、 水化； 胰酶抗原 修复； 3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶； 0.5%Triton透膜； 正常血清封闭； 加一抗 4°C过夜； 加入生物素化二抗 37°C孵育 30min， ABC复合物室温孵育 20min， DAB显色； 苏木素复染、 透明、 封片。 阳性染色为胞桨或胞核棕色 颗粒， 阴性对照以 PBS或正常山羊血清代替一抗。
应用高清晰素彩色病理图文分析系统 Spot Advanced 3.0获得高清晰的免 疫组化染色的病理图片 （200倍）。 使用 Image-Pro Plus 5.1测量出每个视野染 色后的着色强度。 每组分析 4-6个标本， 每个标本随机取 20个视野， 取均值 代表一个动物肾组织蛋白表达强度， 并用非参数方差分析进行统计学分析。
2、 统计分析：
实验结果用均值±标准误（ ±SE)表示， 经参数或者非参数方差检验， 经比较 p&0.05认为有统计学差异， p&0.01认为有显著性差异。 病理学分级资 料的统计使用卡方检验， 经比较 p&0.05认为有统计学差异， p&0.01认为有显 著性差异。
2.1、 CFZ预防 UUO诱导的肾纤维化
本实验采用经典的 UUO诱导肾纤维化模型。由于输尿管结扎造成小鼠尿 路阻塞， 手术后 7天阻塞肾从外观上可见色泽变浅， 发白， 肾盂膨胀积水， 肾皮质变薄； 14天时变化更加明显。 给予 CFZ治疗组小鼠肾脏色泽偏红润， 肾皮质较模型组厚 （图 16D)。 UUO后 7天， Masson's染色病理检查发现肾皮 质明显变薄， 多数肾小管扩张、 萎缩肾间质有大面积胶原沉积， 14天时肾结 构损伤更加明显， 肾实质组织受到间质胶原的挤压， 结构破坏 （图 16A)。 CFZ组小鼠肾组织间质胶原沉积明显少于模型组， 结构相对完整。 病理评分 结果显示 CFZ具有明显的抗肾纤维化的作用， 经 CFZ治疗后动物肾组织纤维 化评分显著低于未治疗模型组， 肾小管损伤程度也明显轻于模型组（图 16B, C)。
成肌纤维细胞是活化的成纤维细胞， 特异性的表达 a-SMA; 此外纤维化 时上皮细胞可获得间充质细胞表型即 ΕΜΤ, 也表达 a-SMA。二者是细胞外胶 原的主要来源， 在很大程度上可反映组织纤维化的程度。 我们使用 Western Blot法检测肾组织 α-SMA的表达时发现， 假手术组肾脏表达极低水平的 α-SMA, 这说明在正常情况下， 肾脏极少有活化的成纤维化细胞。 UUO显著 诱导了 α-SMA的表达， 随造模时间的延长， 这一作用愈加明显： UU07天时， 模型组肾脏 α-SMA的表达为假手术组的 7倍； UUO 14天时则增至假手术组的 13倍； 而经 CFZ治疗后 UUO小鼠肾组织 a-SMA表达大幅减少， UU0 7天时， 较同时间点模型组肾脏 α-SMA表达低 2.4倍， UUO 14天时较同时间点模型组 肾脏 a-SMA低约 3倍 （图 16F)。 肾组织免疫化学染色结果显示， UU0 7天， 肾组织表达 a-SMA的细胞显著增加，染色集中于肾小管上皮细胞周边及肾间 质细胞； 14天时阳性染色更加明显， 呈弥散分布。 CFZ治疗组 a-SMA的阳性 染色面积明显少于模型组 （图 16E), 结果与 Western Blot结果一致。
对纤维化标志蛋白前胶原 I及 a-SMA的 mRNA表达情况分析结果显示，在 正常肾脏， 前胶原 I的水平较低， 纤维化时则大幅升高； UU0 7天及 14天， 前 胶原 I在肾组织的表达较假手术组分别上升了 10倍和 7倍 （vs 假手术， p&0.05 CFZ在 UUO 7天显著降低前胶原 I的表达， 14天时对其 mRNA表达无 明显作用 （图 17A， B)。 在假手术组， a-SMA的 mRNA有一定的基础表达； UUO显著诱导了 a-SMA的 mRNA表达， 在 UUO 7天时， 与前胶原 I的变化趋 势相同， 为假手术组的 1.4倍 （p&0.05 ); 但 14天时与假手术组比无差异； 而 CFZ在 UU07天及 14天均降低了 a-SMA的 mRNA表达水平 （vs 模型组， p&0.05 ) (图 17A， C
纤维化的形成最终是由于细胞外基质合成和降解失调导致的， 细胞外基 质生成增加而降解减少， 大量的胶原组份在细胞外沉积， 导致纤维增生和疤 痕形成。组织中降解细胞外基质的主要酶类包括基质金属蛋白酶（MMPs)， 而它的抑制物 （TIMPs) 负向调控其作用， 二者之间的平衡在一定程度上决 定了细胞外基质合成和降解之间的平衡， 在纤维化的发生中意义重大。 因此 我们检测了在肾纤维时发挥主要作用的 MMP家族成员 -MMP2及其抑制物 TIMP-1的 mRNA表达情况。 在假手术组小鼠肾组织， MMP2及 TIMP1均表现 出较低的表达水平。 UUO大幅度地诱导 MMP2及 TIMP1的 mRNA表达， 与假 手术组比较， MMP2在 UUO后 7天和 14天分别增加 17.6倍和 12.2倍； TIMP1在 UUO后 7天和 14天分别上升 5.5倍和 3.5倍。 CFZ对于 TIMP1的 mRNA表达具有 显著的抑制作用， 对 MMP2则没有表现出明显的抑制作用 （图 17A， D， E) 。 从比值上看， CFZ增加了 ΜΜΡ2/?ΜΡ1的比值（图 17F) ， 提示 CFZ在基质合 成和降解环节可能通过调整 MMPs/TIMPs平衡发挥抗纤维化作用。
2.2、 CFZ逆转已确立的肾纤维化
从前面的实验我们已可以断定， UUO 3天即可以诱导明确的肾纤维化改 变。 因此我们选择 UUO第 4天开始药物治疗， 观察 CFZ是否具有逆转肾纤维 化的作用。
UUO后 14天， Masson's染色病理检查发现肾皮质明显变薄， 多数肾小管 扩张、 萎缩肾间质有大面积胶原沉积， 高倍镜下观察胶原主要沉积于肾小管 基膜、 肾小囊、 系膜、 肾血管周边区域。 假手术组几乎未见特征性的阳性染 色， CFZ治疗组胶原染色明显少于模型组， 间质区域也明显较模型组小 （图 18A， B)。 半定量分析结果显示 （图 18E) 模型组胶原面积为假手术组的 20 倍（vs假手术组， p&0.001 )， 与模型组比较， CFZ具有明显的减轻肾纤维化 作用， 经不同剂量 CFZ治疗后动物肾组织沉积的胶原面积比模型组分别减少 了 56.2% (高剂量组， vs模型组， p&0.001 )和 42.3% (低剂量组， vs模型组， p&0.001
我们检测活化的成肌纤维细胞特征性蛋白 α-SMA及肾小管上皮细胞特 征性蛋白 E-钙粘素的表达。 从免疫荧光切片可以看到， 假手术组肾组织少有 a-SMA染色； UUO后 14天， 模型组肾组织有大量的 (X-SMA强荧光着色， 用药 组也有一定程度的 α-SMA荧光着色， 但亮度明显弱于模型组 （图 18C)。 E- 钙粘素是上皮细胞的特征性蛋白， 当上皮细胞发生 EMT时， 这种蛋白的表达 会降低， 因此它也是肾小管上皮细胞发生 EMT的标志性蛋白。从免疫荧光切 片上我们可以看到， 假手术组肾组织有强的 E-钙粘素荧光， 染色集中于肾小 管上皮细胞边缘， 可见比较完整的基底膜。 UU014天后， E-钙粘素荧光强度 极弱， 肾组织结构不完整。 CFZ治疗组有较亮的荧光染色， 肾组织结构较模 型组完整， 一些肾小管尚保存有完整的基底膜结构 （图 18D)。
为进一步确证此结果， 我们用 Western blot法检测了二种蛋白的表达。得 到的结果与组织病理学结果一致，经 UUO诱导后二种蛋白在肾组织的表达呈 现明显相反的变化趋势， UUO后 a-SMA显著增加， 而 E-钙粘素表达有明显的 减少； 药物治疗则逆转了上述改变， 在 a-SMA表达趋于正常的同时 （图 18F 上）， 维持了 E-钙粘素的基础表达 （图 18F下）， 其中高剂量组作用更明显， 这也提示 CFZ对肾小管细胞具有保护及修复功能。
在 UU0 21天，模型组胶原面积与 14天相比变化不大，但 CFZ治疗后胶原 面积仅为 3%左右， 比 UUO 14天时治疗组 7%左右的胶原面积更有所减少（图 19C 从低倍镜下观察，模型组肾组织受到胶原的严重挤压，结构已不完整， 而尽管 CFZ治疗组肾脏由于机械损伤所造成的肾小管损伤并未得到缓解， 肾 小管均表现为扩张状态， 但肾脏结构相对较完整， 基底膜清晰可见（图 19A、 B)。 从 a-SMA及 E-钙粘素的表达来看， 模型组肾组织有大量的 a-SMA表达， CFZ治疗组 a-SMA表达明显减少（图 19D上）； 模型组 E-钙粘素的表达则大幅 降低， CFZ对 E-钙粘素的表达有轻度的上调作用 （图 19D下）。
2.3、 CFZ抑制肾纤维化作用导致肾功能改善
为了观察药物在改善纤维化的同时是否对肾功能有改善作用， 我们首先 计算了双侧肾与体重的比值。 各组左肾 （结扎侧） 与体重比值在 UUO 14天 及 21天时均无改变 （图 20B， H)。 而未结扎的右肾 （对侧肾） 与体重的比值 则显示出较明显的差异。模型组右肾 /体重比在结扎后与假手术组比较明显增 大， 这是一种代偿性增大， 与现有已知文献的结果相一致。 CFZ治疗组右肾 /体重比相对于模型组有所减小，提示治疗组左肾功能要优于模型组（图 20A, G)。 双侧肾重比值也呈现相同的变化特点 （图 20C， Do 血生化结果进一步 证实 CFZ治疗组肾功能要优于模型组。 UUO后， 小鼠血清肌肝及尿素氮水平 均上升， 14天时尿素氮水平与假手术组相比已有显著差异， 此时， 药物作用 尚不明显 （图 20D-E)。 UUO 21天， 模型组小鼠血清肌肝和尿素氮水平均显 著高于假手术组， 提示肾脏的清除功能发生障碍； 而 CFZ治疗组小鼠二种生 化指标均低于模型组， 并趋于正常 （图 20J-K)。 这也验证了前人的结论， 肾 功能与纤维化程度成反比， 逆转纤维化则有助于改善肾功能。
此外我们还检测了脾脏重量， 14天时各结扎组小鼠脾脏较假手术组有明 显增大， 给药组与模型组无差别。 21天时脾重 /体重比各组均无明显差别（图
效果实施例 4本发明中药组合物对博来霉素所致肺纤维化治疗作用
本发明实施例 1-10制得的中药组合物共设 11组， 具体组别及给药方案 见表 6。 实验方法同效果实施例 1。 实验结果记录于表 7中。 观察原料按不 同配比获得的中药组合物， 以及干扰素 γ长期给药对博来霉素所致肺纤维化 的作用。
表 6本发明中药组合物对博来霉素所致肺纤维化治疗作用
实施例 7 20 4g/kg， 造模后第 14天至第 28天 p.o.
3/4 0 实施例 8 20 4g/kg， 造模后第 14天至第 28天 p.o.
3/4 0 实施例 9 20 4g/kg， 造模后第 14天至第 28天 p.o.
3/4 0 实施例 10 20 4g/kg， 造模后第 14天至第 28天 p.o.
3/4 0 表 7博来霉素所致小鼠肺纤维化和各种药物治疗作用
Ρ&0.05 vs 正常组， #Ρ&0.05， ##Ρ&0.01 vs模型组
由表 7中羟脯氨酸含量结果提示， 本发明实施例 1-10均具有较好的对 博来霉素所致肺纤维化治疗作用，其中，实施例 9是一个疗效更好的配伍组。 效果实施例 5本发明中药组合物对博来霉素所致肺纤维化药效对比试验
本发明实施例 11-14制得的中药组合物对比试验中共设 6组， 组别及给 药方案见表 8。 实验方法同效果实施例 1。
表 8本发明中药组合物给药方案 组别 小鼠数目 给药剂量及给药方案 给药途径 溶剂 正常组 15 等量溶剂， 造模后第 14天至第 28天 p.o. H20 模型组 20 等量溶剂， 造模后第 14天至第 28天 p.o. H20 干扰素 γ 20 15万 IU/kg， 造模后第 14天至第 28天 i.v. N.S 实施例 9 20 4g/kg， 造模后第 14天至第 28天 .o. H20 实施例 11 20 4g/kg， 造模后第 14天至第 28天 .o. H20 实施例 12 20 4g/kg， 造模后第 14天至第 28天 .o. H20 实施例 13 20 4g/kg， 造模后第 14天至第 28天 .o. H20 实施例 14 20 4g/kg， 造模后第 14天至第 28天 p.o. H20 其中实施例 1 1-14分别使用冬虫夏草及其发酵培养物， 或隐孔菌及其发 酵培养物分别替代灵芝及其提取物，考察是否具有相同的对抗博来霉素所致 肺纤维化的作用， 实验结果记录于见表 9。
表 9博来霉素所致小鼠肺纤维化和各种药物治疗作用
P&0.01 vs 正常组， ##P&0.01vs模型组
由表 9中羟脯氨酸含量结果提示， 本发明实施例 1 1-14均具有较好的对 博来霉素所致肺纤维化治疗作用。
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