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(请教) 关于免疫组化抗原修复问题
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这个帖子发布于12年零205天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请问大家，如果用胰酶修复，应该用多大浓度，如何进行。谢谢！
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用胰酶修复，浓度一般应该用0.1%胰蛋白酶，37度消化20分钟。消化时间可根据组织固定时间长短、切片厚度、消化酶的浓度作适当的调整。修复液的量必须保证切片始终能浸泡在组织内,热修复后一定要待工作液冷却后才能将切片从工作液中取出,以便蛋白质恢复到它的自然结构。
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抗 原 修 复
抗原修复技术及其在免疫组化中的应用 福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术，是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，通过机械的方法断开因福尔马林固定的导致的抗原表位和不相关蛋白间的交联键，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复，使抗体更好的渗透，与表位结合。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施，AR-IHC已广泛应用于临床的研究中。修复方法多种，主要有加热修复和酶修复。修复方法I. 加热AR技术 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。微波加热方法 切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却30分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。高压热修复 切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0，工作液）或0.001M EDTA（pH8.0）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 煮沸热修复 切片脱蜡至水后，放入盛有0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0，工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。该方法效果较微波和高压修复差。II. 非加热AR技术非加热AR技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断组织固定形成的醛键，修复抗原。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。由于酶消化过渡会造成组织损害，应掌握消化时间。消化后应充分洗涤。 胰蛋白酶消化法 用0.1%胰蛋白酶，将切片放入湿盒内37℃温箱中消化5-30分钟。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%至0.25%。胃蛋白酶消化法 用0.4%胃蛋白酶液，37℃孵育10-180分钟即可。链霉蛋白酶消化法 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，浓度为o.1％，消化时间20min。蛋白酶K 用0.3mg/ml 37℃消化6-20mins，蒸馏水洗；95C加热3mins, 灭活残余的蛋白酶。一般用于细胞内抗原。 皂素（Saponin） 一般使用浓度为2~10ug/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。抗原修复的方法选择 抗原修复关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。不适当的抗原修复方式会导致染色弱阳性。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。不适当的抗原修复方式会导致染色弱阳性。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。用于IHC消化的酶很多，所选酶的种类，使用的浓度，PH值，消化时间及温度等均要视组织固定的不同，所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，应通过预实验摸索确定。使用酶消化的原则：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化，如fibronectin，Laminin，各型胶原等。消化时间和组织固定的长短呈正比。在用酶消化，热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法，有时会取得较为满意的结果。一般蛋白酶K和微波相结合，但应注意，可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应。以高压加热方法、微波加热方法较为稳定, 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCL较常用。AR应注意的问题加热持续时间和强度是重要的影响因素之一，修复液的温度；AR液的PH值、浓度、化学成分；片子的数量；微波的瓦数也是重要的影响因素之一。使用低PH值AR液必须使用阴性对照片，以防止定位不准。修复缓冲液的PH值对某些抗原的修复十分重要。在修复的抗原中，金属盐可影响蛋白的结构。有人使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L柠檬酸缓冲液、0.1mol/L Tris-HCL缓冲液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修复抗原，发现其阳性强度逐渐增强。明显的抗原变性发生在70℃-90℃，但是福尔马林固定的蛋白具有更强的热稳定性。蛋白交联可能对抗原表位有保护作用。抗原修复时温度98℃为宜，避免强烈沸腾造成脱片。高温抗原修复因其机理相当复杂，对某些存在的问题很难用设计对照的方法加以解决，有些抗体在冰冻切片上呈阴性反应，但在石蜡切片用抗原修复后却能很好的显示。对某些应表达在胞浆或表达在核内的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表达在核内的抗原经过量修复会出现在胞浆内，例如P53、PcNA、Ki-67等。有些抗体(如Cytokeratin、Collagen IV、FVIII、Laminin、EGFR等)用于石蜡切片的免疫组化实验时，需要用酶对组织进行消化，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度。有些抗体(如ER、PR、Ki-67、P53、C-myc、Rb等) 用于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度。抗原修复后，切片可放在冷PBS中过夜。PBS弱碱性，会导致一些组织脱片。对ER/PR研究要慎用。用酒精等某些非交联固定剂固定也要修复。如果用Bouin's 或Gluteraldehyde固定，并在Bouin's 或Gluteraldehyde中修复，时间可以调整（7-10mins）. Bouin's是多聚甲醛，修复时间较短；Gluteraldehyde是一种超交联剂，需时较长。操作中还应注意如下问题：1、 修复液使用前恢复到室温。2、 热处理后应注意自然冷却。3、 热处理时要防止切片干燥。4、 应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法。5、 一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。6、 注意形态学结构的改变(一般经高温修复后胞浆会明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但核破坏较轻)。7、 如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA等可改善某些抗原的修复。 希望对您有所帮助，有问题我们再联系
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关于丁香园& 抗原修复对多聚甲醛固定脑组织冰冻切片免疫组化反应的影响
抗原修复对多聚甲醛固定脑组织冰冻切片免疫组化反应的影响
摘 要：目的 比较抗原修复对多聚甲醛固定脑组织冰冻切片免疫组化结果的影响。方法 成年SD大鼠用4％多聚甲醛经心腔灌注、固定后，分别经15％及30％蔗糖梯度脱水后进行冰冻切片（10μm），取相同部位切片20张，
【题　名】抗原修复对多聚甲醛固定脑组织冰冻切片免疫组化反应的影响
【作　者】李俊祥 于建云 李娟娟 高林波 江乐盛 石泉
【机　构】昆明医学院法医学院,云南昆明650031 昆明医学院脑损伤研究室,云南昆明650031 昆明医学院组织胚胎学教研室,云南昆明650031
【刊　名】中华医学实践杂志,
2005(9): 904-905
【关键词】冰冻切片 抗原修复 免疫组化
【文　摘】目的 比较抗原修复对多聚甲醛固定脑组织冰冻切片免疫组化结果的影响。方法 成年SD大鼠用4％多聚甲醛经心腔灌注、固定后，分别经15％及30％蔗糖梯度脱水后进行冰冻切片（10μm），取相同部位切片20张，用兔抗Ach-M2受体多克隆抗体和小鼠抗DA-D2受体多克隆抗体作S-P免疫组化染色。结果 经抗原修复的冰冻切片组的阳性结果比未经抗原修复组有明显提高。结论 本实验首次发现多聚甲醛固定的组织冰冻切片经抗原修复可以提高免疫反应敏感性或提升抗体效价。机制可能与多聚甲醛固定后对抗原有封闭作用有关。
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冰冻切片,抗原修复,免疫组化
上一篇：暂无关注今日：11 | 主题：241459
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【求助】多聚甲醛固定的冰冻切片需要抗原修复吗？
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这个帖子发布于6年零245天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近做一个免疫分子，表达在胞质和胞膜上，一抗用的santa cruze 1:100稀释，cy3二抗1:50稀释，结果还是没有荧光，现在不知道问题出在哪儿？难道多聚甲醛固定的冰冻切片需要做抗原修复吗？还是说需要triton x-100打孔？
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不需要，通常也不需要Triton处理。你用酶标的检测一下一抗是否能做出来？
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jq2k 不需要，通常也不需要Triton处理。你用酶标的检测一下一抗是否能做出来？谢谢，回去试试。
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1.难道多聚甲醛固定的冰冻切片需要做抗原修复吗？同问。查了些资料，没有明确说。但有的AR部分在解释其原理时提到多聚甲醛。希望大侠来解释下！2.还是说需要triton x-100打孔？ 如果是4微米的切片，细胞应该已经切开了，可以不用，但用了似乎也不会对细胞产生损伤。参考这个：
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映山红 1.难道多聚甲醛固定的冰冻切片需要做抗原修复吗？同问。查了些资料，没有明确说。但有的AR部分在解释其原理时提到多聚甲醛。希望大侠来解释下！2.还是说需要triton x-100打孔？ 如果是4微米的切片，细胞应该已经切开了，可以不用，但用了似乎也不会对细胞产生损伤。参考这个：同是疑惑啊，原来做的时候很少打孔的，现在做这个分子一直没有出来阳性结果，闹心啊！
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我的冰冻切片也同样多聚甲醛固定了1个多星期，现在也是不出阳性，请大家指导，急！
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甲醛是一种蛋白交联剂，会封闭大部分抗原，所以经过甲醛固定的组织大部分是需要做抗原修复的，也有不需要修复的，但是很少。
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预实验为嘛不做一抗梯度？打孔不费事，只管做就是。而且且打孔不止可以破膜，还能溶掉多余的脂质，更有利于抗原暴露。长时间的多甲固定，还是修复一下吧。
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关于丁香园多聚甲醛固定后的冰冻切片是否需要抗原修复(抗原,冰冻切片,多聚甲醛,抗原性) - 免疫实验 - 生物秀
标题: 多聚甲醛固定后的冰冻切片是否需要抗原修复(抗原,冰冻切片,多聚甲醛,抗原性)
摘要: [多聚甲醛固定后的冰冻切片是否需要抗原修复(抗原,冰冻切片,多聚甲醛,抗原性)] 我做的冰冻切片是用多聚甲醛固定的，文献上说甲醛和多聚甲醛固定可能会破坏抗原性，但通常冰冻切片是不需要抗原修复的。那么我的标本是不是需要抗原修复呢？谢谢。 关键词:[抗原 冰冻切片 多聚甲醛 抗原性 甲醛]……
我做的冰冻切片是用多聚甲醛固定的，文献上说甲醛和多聚甲醛固定可能会破坏抗原性，但通常冰冻切片是不需要抗原修复的。那么我的标本是不是需要抗原修复呢？谢谢。
回复真正的冰冻切片是不需要任何固定液（例如中性甲醛、多聚甲醛）的。即新鲜标本速冻后在冰冻切片机上做7um厚的切片，室温晾干后放入4摄氏度丙酮中“固定”。这个“固定”与我们用的多聚甲醛是用来“固定”细胞内的蛋白质使之不再受内源性酶的左右而降解相似，但其固定的效力比福尔马林要弱一些，因此抗原不容易形成cross－link。你的情况我认为，如果你买的一抗上标明是用于“冰冻切片”则你不能使用任何福尔马林固定液固定。因为这些固定液都会或多或少的使抗原形成cross－link从而需要抗原修复的。但抗原修复不可能使得发生交链的抗原100％的恢复，总会有一些抗原发生“丢失”(即因形态改变而无法检测到）。有些一抗标明使用于冰冻切片的原因主要有：目的抗原在组织中稀少；目的抗原固定后修复仅有少数可以恢复原结构。如果抗原发生交链后修复可以恢复大部分的结构，则一抗就没有必要标明仅仅适用于“冰冻切片”了。GOOD LUCK!回复请问楼上，我的冰冻切片就是多聚甲醛固定了1个多星期，现在不出阳性，应该是形成cross－link，请问现在有没有解决的办法呢？我快急死了，用了K修复了5min，还是不管用。求指导。
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【求助】经多聚甲醛固定的冰冻切片要做抗原修复吗？
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这个帖子发布于10年零134天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做肝脏组织的冰冻切片，现4%PFA固定过夜，再30%蔗糖处理过夜，最后包埋做切片。请问1。这样处理后再做免疫荧光染色会不会受影响？还需要抗原修复吗？2。大家有没有试过这样处理后作HE染色？是否能像石蜡切片那样保持好的组织形态？3。这样处理后能做化学染色吗？是否需要抗原修复？非常迷惑，希望有经验的朋友指点一下多谢！
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野原 edited on
冰冻切片一般不需要抗原修复，石蜡切片需要抗原修复。目前进行的常规石蜡切片标本，一般均用甲醛固定。事实上经甲醛固定的部分组织细胞，免疫组化标记敏感性明显降低，其原因为：(1)在用甲醛固定过程中形成醛键而封闭了部分抗原决定簇；(2)甲醛在保存过程中会形成羧甲基，而封闭抗原决定族；(3)在用固定剂固定时，会使蛋白与蛋白之间发生交联，也可能会封闭抗原决定族。因此在染色时为取得良好的染色效果，必须对有些抗原进行预先修复。对于冰冻切片用丙酮或甲醛固定效果较好。因为你是用4%PFA固定还是要考虑做抗原修复的。修复抗原的方法很多，一常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。也有人用蒸馏水修复抗原，方法如下：将脱蜡水洗过的切片放入盛有蒸馏水的容器中，置微波炉内高中火5 min煮沸，中低火维持沸腾状态10 min。自然冷却，取出切片，滴加3%的H2O2，室温孵化15 min，PBS液洗3次，每次5 min，其它按说明书染色步骤进行。
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