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￥2,044.00（型号：550590）
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【体检分院】
爱康国宾北京丽都分院
北京市朝阳区将台路丽都饭店5号商业楼三层（丽都广场、丽都饭店口进）咖啡色宝迪沃）
公交：乘408、416、420、657、667、682、701、967路、991路、运通104、107路至丽都饭店下车，进入丽都饭店，商业5号楼。 地铁：10号线三元桥下车C口出，14号线望京南，步行1.5公里。
自驾：沿四元桥向东，京顺路丽都饭店路口右转前行三百米；
爱康国宾北京建国门分院
北京市朝阳区建华南路17号现代柏联大厦二层
地铁：1号线或2号线至建国门站下（C口出）步行至建华南路，南
500米路西即可
公交：可乘1、4、728、9路公交车日坛路站下车，地铁建国门站下
自驾：广播电台东至建华南路，向南500米
爱康国宾北京酒仙桥分院
乘坐408、413、424、445、656、937路至南十里居下车，
步行至东风南路，向西至东润枫景小区即可
自驾：四环亮马加油站北100米，东风南路向西800米东润枫景小区
乘坐408、413、424、445、656、937路至南十里居下车，
步行至东风南路，向西至东润枫景小区即可
自驾：四环亮马加油站北100米，东风南路向西800米东润枫景小区
爱康国宾北京宣武门分院
北京宣武门外大街甲1号，环球财讯中心D座M层
地铁：乘地铁2或4号线至宣武门下车（D出口）
公交：乘54、70、102、105、109、646路至宣武门外下车，
步行至宣武门十字路口西南角；
自驾：宣武大街西南，至中国供销集团即环环财讯中心大楼即可
爱康国宾北京西直门分院
北京市西城区西直门南大街2号成铭大厦D座5层
地铁：乘地铁4号线或2号线从西直门站C口出即到。
公交：乘80路、特12外、44、外939、604、691、694、392、387、693、21、618、562、490、84、106、632西直门外111路，105路、27路，608路西直门南，即到。
爱康国宾北京西直门分院4层
北京市西城区西直门南大街2号成铭大厦D座4层
爱康国宾北京亚运村分院
北京市朝阳区安立路西侧慧忠北里京师科技大厦第2层
地铁：大屯路东站乘坐专40路, 在中灿苑小区南门站 下车 步行至 京师科技大厦二层
公交：乘车653路, 984路, 985路, 快速公交3线, 快速公交3线区, 快速公交3线支, 特11路 到华汇商厦站下车,向西走10米京师科技大厦二层
爱康国宾北京公主坟分院
北京市海淀区西三环中路19号国宜广场三层东侧及一层大厅（新兴桥西南角）
地铁：地铁1号线(苹果园方向), 在 公主坟站 下车(D口出) 步行至 国宜广场。 公交：613路、337路、94路、40路、52路、68路、99路、373路、运通102路、414路、89路、运通120路、323路公主坟东下车步行至国宜广场即可。
爱康国宾郡王府分院（北京朝阳体检中心）
北京市朝阳区朝阳公园南路21号（朝阳公园南门东侧200米郡王府体育中心）
地铁：10号线团结湖下（C口出），十四号线朝阳公园（年底开通）转乘公交302、350、406、672、675、673等，朝阳公园桥西下车，向东200米路北。乘车路线：四环乘753、740、757、特9、运通111至公园桥南下三环乘302、406、431、499、502、672、673、729、731、750、758、976、988至朝阳公园桥西下。驾车：东三环长虹桥出口往东2公里路北（郡王府内）/东四环朝阳公园桥出口往西200米路北（郡王府内）备注：免费停车（车位有限）
爱康国宾北京爱康国宾博惠珠市口珍贝分院
北京市东城区珠市口东大街6号珍贝大厦2层
5号线磁器口站西南出口或5号线换乘7号线桥湾下车：公交线路：特7路 23路 57路 机场7线（西客站线）夜7路 夜10内环 夜10外环 110路 地铁7号线 6路 34路 35路
爱康国宾总部基地分院（北京丰台体检中心）
北京市丰台区总部基地188号一区31号楼（厦门国际银行）旁边（南四环西路）
爱康国宾北京白石桥分院
北京市海淀区中关村南大街32号中关村科技发展大厦6层
乘地铁4号线至国家图书馆站下车，或乘209路、319路、320路、332路、634路、716路、特4公交车，中央民族大学站下车即到
爱康国宾知春路分院（北京海淀体检中心 ）
北京海淀区知春路甲48号盈都大厦D座3层029室（沃尔玛超市旁边）
地铁：10号线、13号线知春路站下B口（西南口）出，盈都大厦现代阳光体检中心海淀公司（沃尔玛商场右侧三楼）。
爱康国宾北京安华桥分院
北京市西城区裕民中路12号北三环宾馆（宾馆的左边，爱康国宾，米黄色的楼5层）
乘车：乘300内、300外302、361、367、387、422、601、641、718、731、847、84、967、特8内环、特8外环、运通101、运通201安华桥西下车，北三环路北侧西行180米裕民中路，右转进入裕民中路走50米。
地铁：地铁8号线安华桥下，A口出延北三环西行400米，右转进入裕民中路走50米。
驾车：沿北三环中路辅路进入裕民中路，裕民中路行驶50到（道路右侧）
爱康国宾北京白云路分院
北京市西城区莲花池东路甲5号院1号楼白云时代大厦A座2层201-301室
公交车：3、19、9路白云桥西站下车，40、47、717、741路天宁寺桥站下车
北京爱康国宾顺平门诊部
北京市顺义区顺平路南法信段9号，顺捷大厦二层203，（汽配城斜对面、镇政府附近）
乘车：915、918、31、南法信下车即到，地铁15号线南法信下车，还需座两站公交
爱康国宾上海杨浦五角场分院
上海市杨浦区国宾路36号万达国际广场5楼
139、102、61、59、713、991、910、55、819、168、99、850、842、559、854、942、937、817、大桥三线、大桥五线、地铁10号线（五角场站）
爱康国宾上海陆家嘴分院
上海市浦东新区商城路1900号，近桃林路
地铁：6号线（源深体育中心站1号出口）
公交：81路、974路、774路、981路、971路、797路、陆川线、上川线、新川线、沪华线、申陆线、783路、630路、626路、736路、961路、791路
爱康国宾上海中山公园南延安西路分院
上海市长宁区定西路1018号2层
地铁：3号线、4号线(延安西路站）
公交：776路、946路、925线、936路、127路、96路、57路、71路、44路
爱康国宾上海曹家渡一品分院
上海市静安区康定路1437号鑫康苑2楼
忻康里站：23路、824路空调、935路空调
曹家渡站：13路空调、54路空调、316路空调、327路空调、941路空调、45路空调、136路空调、321路空调、765路空调、951路空调、世博25路
爱康国宾上海中环一品分院
上海市普陀区真光路1288号百联中环购物广场4层（观8电梯上）
真光路梅川路站：727路空调、827路空调、807路空调、947路空调
梅川路真北路站：837路空调、948路空调、876路空调、长征1路空调
爱康国宾上海西藏南路老西门分院
上海市黄浦区西藏南路768号4层
地铁：8号、9号、10号线
公交：大桥一线、782、18、18、23、318、454、715、771、802、969、24
爱康国宾上海外滩延安东路分院
上海市黄浦区江西南路29号2层
地铁：10号线（豫园站1号出口）
公交：26路、926路、320路、隧道三线、127路、17路、上川线
上海浦东八佰伴体检分院
上海市张杨路560号中融恒瑞大厦6楼西区（南泉北路张杨路路口，百脑汇旁
地铁：9号线商城路下车，地铁2号线，4号线世纪大道站下车；
公交：85路、610路、639路、794路、981路、455路（原申陆专线）、170路、573路、971路、993路、施崂专线、钦东专线、新川专线、上川专线
爱康国宾广州环市东体检分院三层
广州市环市东路496号广发花园大厦3
公车：221、287、137、301、545、133、191、209、245、810、886、549、233、280、B2、B2A、B3、B3A、B3B、B10至动物园南门站下。地铁5号线（动物园站 B、C出口）
爱康国宾广州环市东体检分院四层
广州市环市东路496号广发花园大厦4楼
公车：221、287、137、301、545、133、191、209、245、810、886、549、233、280、B2、B2A、B3、B3A、B3B、B10至动物园南门站下。地铁5号线（动物园站 B、C出口）
爱康国宾广州天河华港花园体检分院
广州市天河区东方一路华港花园20-24号3层
公交：乘坐路线B1、B2、B2A、B3、B3A、B3B、B3C、B4、B4A、B4B、B5、B6、B12、B13、B16、B17、B20、B21、B25、B27
（到华景新城站下）或B9、B11（到东方一路口站下）
爱康国宾广州花城大道南天广场体检分院五层
广州市天河区珠江新城花城大道1号5层
乘坐路线122、183、195、204、252、301、303、305、836、882、B21、51、B9（南方报社站下）或138、194、407、778、811、B22、40、44（花城大道站下），3号线珠江新城A2出口或5号线五羊邨C出口.
爱康国宾广州林和西中泰体检分院
广州市天河区林和西路161号中泰国际广场商场5层
交通线路：地铁：1号线和3号线广州东站B1出入口；
公交：乘坐路线11、41、43、45、122a、122、175、183、185、195、209、214、256、263、280、302a、302、508、551、804、808、810a、841、884、b17、b19、b20、到广州火车东站总站。
爱康国宾深圳福田分院
深圳市福田区滨河路北彩田路东交汇处联合广场QB座裙楼B201/203
途经公交车：26, 28, 52, 73, 109, 229, 235, 338, 367, 382, j1, k548, k568, 高峰专线21, 机场9线
爱康国宾深圳罗湖分院
深圳市罗湖区宝安南路3044号天地大厦1、3层
59路、336路、366路、80路、313路、207路、18路等到天地大厦站或西湖宾馆站
爱康国宾深圳科兴分院
深圳市南山区高新科技园中区科苑路科兴科学院B座3单元3A层(4楼)
209369、B814\B839、E19、E9、M229、至科苑北站下车，地铁路线：1号罗宝线深大站A4出口步行900米
深圳市福田区深南中路3039号深圳国际文化大厦4楼
爱康国宾南京鼓楼分院
南京市中央路19号金峰大厦3-3A楼
公交车：游1、1路、3路、33路、35路、38路、46路、25路、28路鼓楼北站下，16路、31路、34路、100路、67路鼓楼站下，95路、152路湖北路南站下；地铁一号线鼓楼站下4A出口。
爱康国宾南京新街口分院
南京市玄武区中山东路145号全民健身中心19F
公交1路、3路、5路、9路、25路、51路、805路新街口东站下，地铁一号线新街口下、二号线大行宫下。
南京江宁分院
南京市江宁区双龙大道1118号新都汇广场2层
公交701路、D8路、851路河定桥站下车；709路、821路、829路河定桥南站下车；704路河定桥西站下车；地铁一号线（中国药科大学方向）；河定桥下车。
爱康国宾成都外双楠分院
四川省成都市武侯区二环路西一段置信路1号置信逸都城5层
乘车路线：乘坐343,K1 ,K2,100,111,809,318到二环路少陵路口；乘坐408,42,21,151到逸都路东；
成都红照壁航天科技分院
四川省成都市锦江区人民南路一段新光华街7号航天科技大厦5层
乘车路线：乘坐118,16,213,26,300,334,45,61,78到人民南路一段下车步行64米；乘坐1,306,335到新光华街下车步行66米；乘坐104,334,43,47,62到东御街下车步行81米；
地铁路线：一，二号线在天府广场站下车（E口出），步行约7分钟；一号线在锦江宾馆站下车（C2口出），步行约4分钟。
爱康国宾成都城南分院
四川省成都市高新区天府大道中段天府三街新希望国际C座3楼
乘车路线：乘坐240、501、504、506、509到地铁天府三街站下车即可；
地铁路线：一号线直达，在天府三街（B口出）
爱康国宾成都高新分院（安生美分院更名为高新分院）
四川省成都市高新区天韵路高新国际广场D座3楼
乘车路线：乘坐118、501、504、506到天府长城站下车，步行580米即到；
地铁路线：一号线直达，在高新站下车（C口出）
成都爱康国宾骡马市分院
青羊街青龙街18号骡马国际大厦4楼
乘车路线：56、56A路公交车至青龙街三医院站下车，步行大约5分钟，55、52路公交车至人民中路二段站下车，大约步行5分钟，48路公交车至骡马市站下车，大约步行3分钟；
地铁路线：一，四号线在骡马市站下车（A口出），步行约5分钟；
爱康国宾杭州西溪分院
杭州市西湖区文二西路718号西溪创意大厦1F、2F
公交86、83、130合建村南站下车；118将村兴达苑下车
爱康国宾杭州文晖分院
杭州市下城区文晖路108号浙江物资出版大厦2层
公交74、90、179、591文晖大桥西下车；地铁1号线打铁关站 文晖路出口
爱康国宾杭州滨江江南大道分院（暂未正式营业，目前不接受散客预约）
杭州市滨江区江南大道588号恒鑫大厦裙楼2楼
公交172，107江二村站
爱康国宾福州鼓楼分院
福州市鼓楼区六一北路328号金源花园3层
东水路口站（往返路线）：9 路，11路，27 路，72路，78路，106路，118路，133路，317路，310路，130路
东 门 站（往返路线）：130路，K2 路，17路，23路，107路，62路，202路，318路，9路，27路，23路，202路，166路，318路，64路
塔 头 站（往返路线）：11路，46路，70路，72路，108路，118路，130路，310路，317路，318路，
64路，322路，508路
爱康国宾天津南京路吉利大厦体检分院
天津市和平区南京路209号吉利大厦9层
公交：3路、 35路、45路、50路、503路、600路、606路、631路、632路、641路、643路、650路、657路、659路、669路、673路、678路、840路、842路、847路、851路、869路、876路、901路、906路、954路 观光2路 校线12路滨江道站
地铁：1号线营口道站B出站口
天津围堤道峰汇广场体检分院
天津市河西区围堤道103号峰汇广场B座5楼(近友谊路)
交通线路：
48路; 48路区间; 95路; 175路; 662路; 677路; 677路区间; 698路; 855路; 872路; 908路; 963路; 968路
天津六纬路东润名邸体检分院
天津市河东区六纬路与大直沽八号路交口东侧东润名邸3号楼401
91路&840路&机场专线5路
地铁：津滨轻轨地铁9号线 东兴路站B出站口
爱康国宾天津合众分院
天津市南开区南马路与南开二马路交口中粮广场1号楼6-7层
公交： 161、168、635、657、676、840、855、865、中旺-西站专线、333内环、333外
地铁：2号线 （鼓楼站）
爱康国宾重庆黄泥磅体检分院
重庆市渝北区洋河东路1号长安丽都揽胜国际广场二层
1、长安华都站
坐110、111、141、149、151、323、354、419、421、607、617、841、868到长安华都站下
2、红土地立交北站
坐202、270、601、611到红土地立交北站下
3、红土地立交西站[否专厂]
坐110、111、149、151、202、270、323、419、461、601、604、607、611、868红土地立交西站下
4、北汽城站
坐461、604、617到北汽城站下
爱康国宾长春亚泰鸿城西域体检分院
吉林省长春市亚泰大街6988号（南湖大路与亚泰大街交汇处南岭小学对面）
公交：乘坐246路270路5路88路 到 南岭小学 下车步行73米
乘坐120路副线120路正线154路218路238路 到 亚泰大街 下车步行203米
爱康国宾常州通江南路体检分院（待开通）
常州市天宁区通江南路238号爱特大厦4层
B1/B12/B13到通江路飞龙路站下，往北300米
爱康国宾江阴临港体检分院
江阴市临港新城中央商务区CDB苏港路99号（国检大楼1-2楼）
37路、128路、118路、101路、102路口岸大厦下
爱康国宾苏州东环体检分院
苏州市工业园区东环路1408号东环时代广场2楼201
轨道交通1号线东环路站下；公交车相门新村下。
沈阳爱康国宾医院太原街分院（待开通）
沈阳市和平区太原南街236号
太原南街站：117、226、202、149、铁西二线 新华广场站：231、115、327、324、296、266、西走100米 民族南街站：135、239、261、134、257、297、预备役号 南走200米 东北汽配商贸中心(公交站)：203、206、257 、262路 东走200米
沈阳爱康国宾青年大街分院
沈阳市沈河区青年大街158号
十一纬路二经街站：287、266、296、237、109、289、168。市委站：130、214、244。地铁青年大街站C出口：1号线、2号线。
烟台爱康国宾芝罘区分院
山东省烟台市芝罘区毓璜顶北路96号
&1路、2路、5路、45路，南大行鑫荟金行下车，西行100米，十字路口南行150米。&&10路、21路、22路、42路、43路、44路、62路、80路、86路、51路，振华购物中心下车，西行300米，十字路口南行150米。
爱康国宾烟台开发区金沙江体检分院
山东省烟台市开发区长江路97号国家羽毛球训练基地
21路、201路、203路、211路，国奥天地羽毛球训练基地下车，国奥天地院内。
爱康国宾烟台莱山区港城东大街体检分院
山东省烟台市莱山区港城东大街588号第三城国际大厦副楼
10路、52路、17路、23路、K62路，广播电视台站点下车。步行176米。 19路、56路市委党校站点下车，步行100米。 广电大厦对面。
潍坊爱康国宾奎文门诊部
山东省潍坊市奎文区民生东街88号 新华路与民生街交叉口东200米路南（原凯远大厦）
乘坐22路、32路、53路、55路公交车至新华路民生街路口下车
潍坊高新爱康国宾门诊部（又称潍坊东方路分院）
山东省潍坊市高新区东方路与卧龙街交汇处
乘坐20路、环65路、环65路逆行至东方路卧龙街路口站
爱康国宾威海海港分院
山东省威海市海滨北路附36号府前商厦1层
1路、7路、9路、13路、16路、17路、22路、23路、24路、26路及观光巴士至三角花园站下车；4路、5路、10路、19路、20路、33路至鲸园小学下车向东100米右转
银川国贸体检分院
宁夏省银川市兴庆区文化西街106号国贸中心B座4层
银川市兴庆区文化西街106号，105路、35路
武汉爱康武汉青年路市博物馆分院
武汉市江汉区青年路373号市博物馆内一楼4号门
乘坐地铁2号线到汉口火车站D出口、3号线到范湖J出口下车
长沙爱康阳光门诊部
长沙市雨花区芙蓉中路三段509号中远公馆101房
公交：123、703、912、915（新建西路口）701、105、115、140、803（麻园塘）4、104、150、702、804、905、908（涂家冲站下南走200米）
爱康国宾长沙河西西中心分院
爱康国宾镜湖分院
&芜湖市黄山中路64号鼎湖1876国际旅游文化广场
2号楼F-5层
公交路线：乘9路、12路、32路、34路、28路环线、46路环线至荟萃中学；
10路、16路、26路、30路、38路外环、109路至第二人民医院；
46路环线、105路内环、105路外环至第三中学。
西安爱康经开分院
西安市未央大道199号美豪酒店3层（西安市委旁）
乘坐228、230、619、318、509、207到行政中心下车，美豪酒店3楼
西安爱康曲江分院
西安市慈恩西路南段曲江六号东门1-3层（大唐不夜城旁）
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爱康国宾宁波鼓楼体检中心
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爱康国宾无锡新吴茂业分院
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绵阳高新火炬广场分院
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&&&&&&&&&&&&涉及hpv相关的癌前期的和癌的生长(包括cin)的方法和组合物的制作方法
专利名称涉及hpv相关的癌前期的和癌的生长(包括cin)的方法和组合物的制作方法
背景技术本申请要求于日提交的美国临时专利申请60/306,809的优先权,在此其全文作为参考。依据从国家癌症研究院(NCI)的授权号CA65561和CA77378以及国家健康研究院(NIH)的授权号CA16672，美国政府可拥有本发明的权利。
1.发明领域本发明一般涉及免疫学，病毒学和肿瘤学。具体来说，涉及诊断和治疗由人乳头瘤病毒(HPV)引起的癌前期的和癌的生长或损伤(包括子宫颈上皮内瘤(CIN))发生和复发的方法。
2.相关技术描述全世界女性中，子宫颈癌是第二恶性癌，占到所有女性癌症患者的15％(Parkin等，1993)。在美国，子宫颈癌是女性生殖道最为普遍的瘤之一。实验室和流行病学的研究已经集中于一些种类的人乳头瘤病毒(HPV)在子宫颈瘤发病机理中的病原学作用上(Brinton，1992；Munoz等，1992)。一般的，在超过79％的确诊患有子宫颈疾病的妇女的样品中检测出HPV的DNA。最普遍的HPV类型是HPV 16，它发现于高度鳞状上皮内损伤和癌症中(Lorincz等，1992)。流行病学研究结论支持了子宫颈瘤与HPV之间的相关性，在HPV型16中，这一关系更为显著(Morrison等，1991；Koutsky等，1992；和Munoz等，1992)。肿瘤由细胞的非正常生长形成，它通常导致入侵正常组织，如原发性肿瘤，或导致向远处组织的传播，如转移瘤。
HPV 16的E6和E7基因经常共同表达，且它们在HPV 16阳性宫颈癌的活组织的病毒转录产物中异常丰富(Wettstein，1990；Seedorf等，1987)。充分的证据表明，E6和E7可读框的共同表达对于多种哺乳动物细胞的恶性转化是必要且充分的(Munger等，1989)。而且，病毒基因组的E6和E7区域的连续表达似乎是保持恶性表型所必需的(von Knebel Doeberitz等，1988)。
一些HPV感染患者会产生子宫颈瘤，而另一些则不会。也观察到很大比例的自发消退，这表明宿主的免疫作用。引入一种细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的反应建立了针对病毒感染的主要防御机制；有时，一种病毒特异的CTL反应可起到完全的保护作用而无需抗体反应伴随(Sastry等，1992；Bevan，1989；Lukacher，1984)。基于现有文献关于抗HPV抗体，尤其是那些直接抗E7癌蛋白的抗体的广泛增长和子宫颈疾病严重性之间的关系(Cason等，1992；Hamsikova等，1994；Jha等，1993)，表明了HPV特异的体液反应可能不会对HPV相关的子宫颈疾病起到保护作用(Nakagawa等，1996)。另一方面，已经报导带有CMI缺陷个体的HPV相关子宫颈瘤的发病率增长，证明了T细胞参与控制人HPV相关的瘤的形成(Nakagawa等，1996；Tsukui等；1996；Feltkamp等，1993和Clerici等，1997)。在侵入性宫颈癌患者体内，已经观察到IL-2产生量和对于促细胞分裂剂如PHA和伴刀豆球蛋白-A的增殖反应的减少(Park等，1992)。已经描述了大量体外和体内策略从HPV-16的E6、E7肽，和LI蛋白鉴别诱导小鼠和人的T细胞活性的肽(Feltkamp等，1993；Strang等，1990；Tindel等，1991；Shepherd等，1992；Stauss等，1992；Kast等，1993)。典型地，诱导病毒特异的CTL可以通过感染表达病毒基因产物的病毒或重组病毒来实现。该病毒基因产物经加工且以肽的形式存在于受感染细胞的表面，与MHC I类分子相结合，被CTL识别(Unanue，1989)。
另外，研究也集中在引起病毒特异的CTL反应的HIV肽的鉴别和描述上。Townsend等阐明了用蛋白质中T细胞抗原决定基作为疫苗候补物质的观念，当时他们的小组证明了流感核蛋白中的短合成肽作为抗原决定基对CTL反应的作用(Townsend等，1986)。本发明者和其他人已经报导了用合成肽体内产生病毒特异的CTL(Kast等，1991；Aichele等，1990；Deres等，，1989；Sastry等，1992；Sastry等，1994；Casement等，1995)以抵抗流感，淋巴细胞脉络丛脑膜炎，仙台病毒和HIV。
超过90％的宫颈癌表达人乳头瘤病毒(HPV)E6和E7蛋白。这些独特的抗原是开发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)用于抗癌免疫疗法的理想目标。相应于HPV-16的E6和E7癌蛋白的合成肽已经鉴别出来了，它对于体内诱导HPV特异的CTL反应是有效的(Sarkar等，1995)。最近，Nakagawa等报导了在许多没有子宫颈损伤的处女和有性生活的妇女中，可检测到针对HPV-16肽和蛋白的全身T细胞增殖反应和CTL反应，而在患有疾病的妇女体内则检测不出(Nakagawa等，1997)。类似地，Tsukui等报导了对HPV抗原的TH淋巴细胞反应，尤其是IL-2的产生，在细胞学正常的妇女中比在有不同程度宫颈瘤进程的妇女中要多(Tsukui等，1996)。而且，Clerici等发现，能潜在增强CMI的TH1细胞因子(IL-2和IFN-γ)的产生在感染大量HPV的妇女体内有缺陷，并且发现CIN的进展与从TH1到TH2细胞因子产生的转变相关(Clerici等，1997)。使用长期体外刺激方案确定TH活性，Kadish等报导了对特定HPV肽的淋巴增殖反应与HPV的清除和CIN的退化有关(Kadish等，1997)。另一方面，de Gruijil等报导了针对HPV 16 E7肽的T细胞增殖反应与HPV的持续感染相关，但是抗原特异的IL-2生产与病毒清除和宫颈损伤进程均相关(de Gruijil等，1996)。
对于CIN患者的普通临床治疗方案包括切除或烧蚀治疗。然而，进一步的研究证明，有相当数量的患者会复发。目前，在接受过针对CIN的烧蚀或切除治疗的患者中，关于癌前期的或癌的生长，复发或康复状况的发生不存在明确的认识。需要更好且改进的方法来有效治疗与HPV相关的癌前期的或癌的生长和损伤疾病。
发明概述本发明基于观察到感染人乳头瘤病毒(HPV)的患者对HPV的E6和/或E7肽的细胞介导的免疫(CMI)应答与其预后相关。对于泌尿生殖道，尤其对于子宫颈的癌前期的或癌的生长的发生，表现细胞介导的免疫应答比那些不表现出细胞介导的免疫的患者危险性减少；换句话说，尤其针对E6和/或E7肽显示出阳性的细胞介导的免疫应答的患者，就发展HPV相关的癌前期的或癌的生长来说，会有良好的预后情况。或者说，一个对HPV的E6或E7蛋白质化合物显示无或低CMI反应的患者，就HPV感染结果的生理性效应而言，预后不良的危险性会更大。因而，本发明涉及鉴别患者有危险患HPV相关的高增殖性病情(包括疣，CIN和恶性肿瘤或其它癌前期的或癌的生长)的组合物和方法，；本发明尤其适于评价患者复发高增殖性病情的可能性。此处，术语“生长”和“损伤”可交替使用。并且，术语“癌前期的或癌的生长”指与HPV相关的生长。除子宫颈的癌前期的或癌的生长或损伤，这样的肿瘤或损伤也可以出现在尿生殖道，包括会阴，阴户和阴茎的瘤生长或损伤。适用于本方法的患者可以包括任何能够感染HPV病毒的哺乳动物；在一些实施方案中，患者被特定为人，男性或女性。
在一些实施方案中，本发明涉及能确定感染人乳头瘤病毒的患者发展或复发癌前期的或癌的生长的可能性的方法。在一些案例中，患者已经治疗了瘤生长。该方法包括以下步骤从患者体内获得样品，用至少一种HPV的E6或E7肽温育该样品；以及测定样品针对这些肽的细胞介导的免疫(CMI)应答。对E6或E7肽或其组合有细胞介导的免疫应答，则表明比不显示这一反应的人，复发的危险性减少。在宫颈癌的发展中频繁观察到的一种前癌生长是宫颈上皮内瘤样病变或CIN。在本发明的一些实施方案中，本发明方法可适用于处于CIN任何阶段(CIN1，CIN2，CIN3或鳞状上皮内损伤(SIL)，低度SIL(L-SIL)和高度SIL(HSIL))的患者。进一步，在其它实施方案中，该方法可以适用于患有CIN以外的更严重的高增殖性生长的患者，如恶性或癌生长。在本发明中，术语“复发”是指癌前期的或癌的生长的出现，或最初生长的再现，或最初癌前期的或癌的生长在退化，消除，或治疗之后的显现。此处，术语“温育”指将样品露置或接触含有肽的组合物。
要求保护的方法适用于人乳头瘤病毒的感染。所述人乳头瘤病毒可以是高等级或高危型，如HPV16，18，31，45，56或58。在一些实施方案中，人乳头瘤病毒是HPV16。在另一些实施方案中，人乳头瘤病毒是中危型，如HPV33，35，37，51，52，59，66或68。更进一步的实施方案中，HPV是与疣相关的低危或低等型，如类型6，11，26，40，42，43，44，53，55，62，或66。
所述样品包括能够引起细胞介导的免疫应答的细胞。在一些实施方案中，样品是血液样品或血清样品，而在其它实施方案中，样品通过灌洗，涂片或拭抹疑似感染或已感染的区域，如阴道，宫颈或阴茎的区域而获得。外周血单核细胞(PBMC)能导致细胞介导的免疫应答，且含有这种细胞的任何样品也能用于本发明的方法。在一些实施方案中，考虑来自样品的细胞在获得之后和检定之前在培养基中培养。考虑在检定之前在培养基中该样品可以培养1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多小时和多达1，2，3，4，5，6或7天，并多达1，2，3，4，5或更多星期，并且多达1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个月。也考虑细胞在检定之前在培养基中培养和/或在低于零摄氏度保藏。细胞自身或细胞培养上清液(培养液，不完整的细胞)可以用于随后细胞介导的免疫应答的分析。在一些实施方案中，先在培养基中培养细胞2-8小时(一些情况下6小时)，然后用流式细胞仪分析胞内细胞因子。在其它实施方案中，先在培养基中培养细胞2天到20天(一些情况下15天)，然后用铬释放分析以确定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。
本发明的方法涉及确定患者是否显示对HPV肽的细胞介导的免疫应答。在个别实施方案中，所述肽是E6或E7肽，意味着它们的氨基酸序列在其长度上与E6或E7多肽的连续氨基酸序列具有至少90％的相同性。具体地，考虑使用5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50或更多的SEQ ID NO19(来自HPV 16的E6)或SEQ ID NO20(来自HPV 16的E7)的连续氨基酸。考虑在一些实施方案中，仅有一个序列的肽被检测(如E6肽，或另一个实例，E7肽)，而在其他实施方案中，多序列可被检测。在一个实施方案中，E6肽和E7肽在本发明中被使用。在其它实施方案中，至少两个E6肽(指至少两个不同的E6序列)，至少两个E7肽(指至少两个不同的E7序列)，或二者同时被检测。可以考虑使用1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，13，14，15或更多的E6或E7肽，也可以是任何E6或E7肽的组合。在更具体的方式中，E6肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，P9L，P10I，Q20P，R16R，或G10S，或其组合。在特定的实施方案中，以下的E6肽将单独使用或作为包括以下一个或多个肽的混合物来使用，这些肽是K9L，E10I，C10R，Q15L，或VIOC。而在其它实施方案中，E7肽是T10Q，M9T，D9L，Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C或D20C，或其混合物。在特定的实施方案中，以下的E7肽Q19D，R9F，R9V，L9V，G10C单独或作为混合物使用。此外，以下肽中包括至少一个E6肽和一个E7肽的混合物K9L，E10I，C10R，Q15L，V10C，Q19D，R9F，R9V，L9V或G10C。在一些实施方案中，特别考虑排除上述混合物中一个或多个肽。特别考虑涉及本发明诊断方法的组合物还可适用于本发明的预防和治疗方法。
本发明方法涉及抗人乳头瘤病毒的细胞介导的免疫(CMI)应答。有不同的方法可以鉴别和评价细胞介导的免疫应答(区别于血清或抗体介导的免疫应答)。在本发明的实施方案中，测定T细胞的增殖。T细胞增殖可通过测定氚化胸苷的掺入来分析。针对至少一个E6或E7肽的SI数值范围等于或大于2.0的增殖反应被认为是阳性，它表示患者的癌前期的或癌的生长或损伤复发的危险减少。针对至少一个E6或E7肽的SI值等于或大于3.0的增殖反应表明了细胞介导的应答，因此鉴定患者癌前期的或癌的生长方面改良的预后进展。换句话说，SI低于2.0，包括SI值为零的患者被认为对E6或E7肽具有低的或没有细胞介导的免疫应答，并认为他们的癌前期的或癌的生长有增加的发展或复发危险。
细胞介导应答也可用非放射性方法如MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)染料或还原测定法，这是一种活细胞(T细胞增殖)比色分析法(daCosta等，1999)，或alamar Blue分析法，它是另外一种测定IL-2-应答性细胞的比色分析法(Gloeckner等，2001；Kwack等，2000)。
在本发明的另一实施方案中，测定细胞介导的免疫应答包括测量TH1或TH2细胞因子量。即使患者由T细胞增殖测定没有显示CMI应答，复发增长的危险性仍与TH2细胞因子的产生相关，如IL-10。对E6和/或E7肽显示产生TH1细胞因子的应答的患者，如IFN-γ和IL-2，观察到他们复发的危险性减少。在一些实例中，TH1细胞因子的量被测量，如IL-2，干扰素(IFN)γ，肿瘤坏死因子(TNF)α，或THF-β，IL-3，IL-12，IL-15，IL-16，IL-17或IL-18。在一个具体的实施方案中，测量IL-18的量。在另外的实例中，测量TH2细胞因子的量，如IL-1，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-13或IL-14。
可以通过免疫测定法测定CMI应答，如ELISA或放射免疫测定法或通过流式细胞仪。在一些实施方案中，来自患者的样品可测试不止一次，以复份样品或不同的测试。在一些实施方案中，来自患者的样品可有多份。多份样品可以是同类型的，如多份的血液样品，或者它们可以是不同类型，如一份血液样品和一份阴道拭擦样品。
适用于本发明方法的患者包括那些还没有诊断出HPV但认为有HPV的患者，曾经感染有HPV但再也没有显示感染HPV征象的患者，已知感染了HPV的患者，在宫颈或其它泌尿生殖器区域或周围有癌前期的或癌的生长，而她自己并不知道感染了HPV的患者，癌前期的或癌的生长已经成功或不成功治疗的患者，和至少一个癌前期的或癌的生长复发的患者。癌前期的或癌的生长或损伤是指生长不能控制的高增殖性细胞，包括前期瘤形成，如CIN和瘤形成(良性和恶性)，涉及鳞状上皮细胞和不确定显著的非典型鳞状细胞(ASCUS)。考虑患者有不止一个肿瘤或损伤。任何肿瘤的治疗既涉及外科(烧蚀或切除)手术，又涉及抗HPV的常规癌症治疗。这种治疗包括化学疗法，放射疗法，激素疗法，免疫疗法，施用磷酸胆碱钙，Thiovir，thiovir类似物(BioKeys)，podofilox，鬼臼脂，三氯乙酸(TCA)，或5氟尿嘧啶(5-FU)，损伤内或intransal干扰素，Imiquimid霜剂。烧蚀技术包括使用液氮，电炙或电解剖，外科切除，或激光技术。成功的治疗指完全除去任何肿瘤征象的治疗，而部分成功治疗指影响肿瘤使其大小或生长率变小，或防止肿瘤的增大，或如果有多个肿瘤，减少肿瘤生长的数量。曾经感染HPV的患者随后可以不显示HPV感染的迹象。然而，相信这样的患者仍然经受癌前期的或癌的生长复发的可能，象连续感染HPV征象的患者。
本发明的一些实施方案中，评价了患者是否确定感染HPV。具体的，也包括HPV的血清型鉴定或其成为最初确定感染的部分。进一步实施方案中，评价了患者是否有癌前期的或癌的生长，如果是癌症，评价肿瘤为良性还是恶性。
本发明的方法包括其中在治疗癌前期的或癌的生长至少一个月后，从患者获得样品的实施方案。患者可以对至少一个癌前期的或癌的生长接受治疗，如通过某些形式的烧蚀。
本发明也包括跟本发明的诊断方法一起使用的治疗方法。在本发明的一些实施方案中，癌前期的或癌的生长的复发进展危险性增加的患者被鉴别。可以采用在患者被认为具有增长的危险性之前未考虑的措施。在一些实施方案中，对没有另外被治疗的患者进行抗癌前期的或癌的生长的预防性治疗或进行经常性检查，或二者同时进行。预防性治疗是对缺乏癌前期的或癌的生长生理性病征时进行的治疗；“治疗方法”包括对患者显示的生理情况进行内科治疗。预防性治疗包括如上所述的，对HPV感染和与HPV相关的癌前期的和癌的生长治疗的使用。
在一些实施方案中，防御或减少癌前期的和癌的生长进展危险的预防方法包括用本发明公开的HPV的E6和E7肽的免疫疗法。如果患者被鉴定为对特别是E6或E7肽，或对这些肽的组合具有低的或没有细胞介导的免疫应答，那么给患者施用E6或E7的肽序列，用以引发CMI应答。这些肽包括任何E6或E7肽，尤其包括表3的全部或部分肽。并且，来自E6或E7多肽的肽，如本发明诊断方法中所论述的，也可以在预防性方法中施用。考虑患者施用含有一或多种肽序列的组合物，在一些实施方案中，还包括辅药，基于脂质体的组合物，或二者。在其它实施方案中，患者不止一次被施用肽。
在一些实施方案中，对感染了HPV的患者有一种通过用本发明方法中公开的方法鉴定患者有危险复发HPV相关肿瘤生长的防止癌前期的或癌的生长(如CIN)复发的方法；以及防止或治疗任何复发的方法。治疗方法包括外科手术(烧蚀或切除术)，以及上述常规抗HPV的癌症治疗方法。在一些实施方案中，所述方法是至少包括上述一个来自HPV的E6或E7肽的免疫疗法治疗。
此外，本发明还包括确定曾感染有HPV并治疗肿瘤生长的患者体内癌前期的或癌的生长的复发可能性的试剂盒，该试剂盒在适当的试剂容器中包括至少一个来自HPV的E6或E7肽，和能够检测针对肽的细胞介导的免疫应答的抗体。在一些实施方案中，抗体附着在不起反应的结构上，样品施加于其中，如带有孔的板。在另一些实施方案中，不起反应的结构具有膜，这种膜能粘贴或附着在该结构上。在一些实施方案中，试剂盒可用于酶联免疫斑点(ELISPOT)测定来检测，一些实施方案中，测定细胞因子分泌细胞的数量。在另一些实施方案中，试剂盒包括一种本发明公开的抗TH1或TH2细胞因子抗体。其它方式包括检测所含抗体的检测试剂。检测试剂是任何能检测另一化合物的化合物，包括能在视觉上检测的试剂，如比色检测试剂。
权利要求和/或说明书中使用“一”与术语“包括”连接可表示“一种”但也有“一或多种”，“至少一种”，“一种或更多”的意思。
本发明的其它目的，特征和有益效果将通过以下详细的描述清楚表明。然而，应该理解，说明本发明特殊实施方案的详细描述和特殊实施例仅为描述而给出，因此属于本发明精神和范围之内的各种变更和更改，本领域技术人员从这一详细描述都可清楚得到。
附图简要说明以下附图形成本说明书的一部分，并且成为本发明某方面的进一步说明。通过参考这些附图的一幅或多幅结合本发明的特殊实施方案的详细描述，本发明可以得到更好的理解。
各不相同的四组被研究妇女的PBMC对不同E6和E7合成肽的增殖反应。第1组妇女正常(CIN(-)/HPV(-)，n＝6)，第2组妇女刚诊断为HPV相关的CIN(CIN(+)/HPV(+)，n＝31)，第3组是疗后无疾病(Recur(-)，n＝22)，且第4组是有疾病复发的(Recur(+)，n＝10)。测定来自四个不同组妇女的PBMC对来自HPV-16的癌蛋白E6或E7的肽的增殖反应。A.显示了每个患者对各种被测肽的刺激指数(SI)值，该值是根据3[H]胸腺嘧啶掺入肽处理过的样品超过培养基对照的倍数的增加来计算。B.各组对E6，E7肽或这两种肽的阳性反应的汇总。组数表示于x轴上，而阳性反应的百分数表示于y轴上。
图2A-D.第3组(Recur(-))和第4组(Recur(+))对来自HPV-16癌蛋白E6和E7的合成肽的PBMC的增殖反应。检测这些组妇女的PBMC相对对照肽(对照)的，分别针对来自HPV-16癌蛋白E6和E7的7和8肽的增殖反应。显示表现SI值的代表数据，它们分别来自第3组(图A和B)和第4组(图C和D)的两位患者。
图3.第3组妇女的PBMC对所选E6和E7肽刺激响应的TH1细胞因子生产。第3组(Recur(-))和第4组(Recur(+))妇女的PBMC在E6肽Q15L和E7肽Q19D的存在下培养两天，并且通过ELISA在各自的上清液中检测各种TH1(IL-2，IFN-γ，IL-12)和TH2(IL-4，IL-10)细胞因子的存在。经与培养基对照调节后，显示第3和4组各被测患者产生的细胞因子数量。
说明性实施方案的描述人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的主要危险因素，并且强的HPV-特异的细胞介导的免疫和CIN较小严重程度之间有关联。对于CIN患者的普通临床治疗策略包括切除或烧蚀治疗，然而随后的研究表明相当数量的患者经历了复发。目前，对于这些患者的病情复发或无病情况并没有明确的认识。对感染，没有感染和复发患者而言，对CIN的预测和治疗或预防性治疗是关键。多数治疗方法已经试验并实施，但是它们还不能排除疾病或防止疾病复发。有相当数量的患者CIN复发，但是还没有可测试复发可能性的方法。
本发明提供了一种确定CIN复发可能性的方法，该方法作为感染HPV并治疗CIN患者的预后性和生物标记物。该方法涉及检测和分析针对HPV癌蛋白肽，如E6和E7，的细胞介导的免疫应答。该方法也帮助鉴别有复发CIN危险的感染有HPV的患者。进一步，本发明利用定向传输系统，试剂盒和免疫疗法来防止CIN复发并诊断有高度危险患CIN的患者。
I.HPV在宫颈瘤形成和癌症发展阶段，人乳头瘤病毒(HPV)先被作为一种重要的辅因子鉴别出来。然而感染HPV并不足以导致宫颈癌。并不是所有感染HPV的女性都会发展成宫颈癌。妇女通常治疗在每年的巴氏(Pap)涂片中检测到的宫颈发育异常疾病。尽管存在巴氏涂片检测，流行病学研究继续暗示HPV是产生宫颈瘤和癌症仅有的最大危险因素。宫颈上皮内瘤(CIN)是由人乳头瘤病毒(HPV)引起的一种宫颈癌。HPV与宫颈癌的发展相关，尤其是HPV型16，18，31，45，56和58。它们构成HPV的高级型/高危型。中级/中危型包括HPV 33，35，37，51，52，59，66和68。其它与疣相关的低级/低危型是类型6，11，26，40，42，43，44，53，54，55，62和66。这些低级型性质上不是恶性的。HPV基因组目前以游离基因形式(不完整的，环状的)存在于CIN中，而在侵入性宫颈癌中，基因组通常完整地整合到宿主DNA中。HPV的高危型表达的E6和E7癌蛋白对于宫颈鳞状上皮的恶性转化起关键作用，因为它们能够结合然后失活两个重要肿瘤抑制基因，p53和成视网膜细胞瘤基因(Rb)。这些肿瘤抑制蛋白的失活成为HPV致癌潜力的关键因素。
A.宫颈癌的诊断和治疗人乳头瘤病毒被鉴定为与宫颈癌的发展有关，宫颈癌是宫颈上皮瘤(CIN)经若干阶段表现出恶性状况。尽管存在巴氏涂片检测，流行病学研究连续暗示HPV是发展CIN仅有的最大危险因素，许多研究继续寻找能够帮助鉴别处于CIN危险中的感染HPV的妇女的宿主和/或病毒标记物。与此同等重要的是经过治疗的患者复发CIN的可能性。对经过切除或烧蚀治疗的患者跟踪研究表明有相当数量的患者复发。因此，能够评价CIN复发可能性是非常重要的。预知复发可允许医生考虑预防或治疗的选择。
自从二十世纪八十年代初，HPV与宫颈癌相关的首次报导出现以来(zur Hausen，1994)，人们已经普遍承认了高危HPV型有助于侵袭前的上皮内损伤到癌症的启动和进展。事实上，已经注意到，在Pap涂片上明显的细胞病理中HPV感染达到顶点，其特征为相关核异型性的核周清除(Kurman等，1994)。在修订的Bethesda术语中，这些HPV改变与轻度发育不良结合定义为LSIL(Kurman和Solomon，1994)。HPV试验的有效性是复杂的，因为需要区分低危(L-SIL)和高危(H-SIL)HPV型(仅有后者引起与发育异常→癌进展相关的重要危险)，和实际的进展危险。在以前的病例中，新的针对HPV的杂种捕获检测区分了高危HPV型(Sherman等，1995；Poijak等，1999；Clavel等，2000)。除了本发明的方法，DNA图象细胞计数也可用来诊断处于宫颈损伤的患者(Lorenzato等，2001)。
1.巴氏涂片在过去的五十年中，巴氏涂片(Papaniclaou Smear，″Pap Smear″)已经成为减少宫颈癌死亡率的基础。巴氏涂片是有效的，因为它能鉴别出宫颈癌的最早期阶段。目前估算，在美国每年要做6-7千万个巴氏涂片。巴氏涂片因此成为检验宫颈癌的标准。尽管它在医学界有广泛的可接受性，但研究表明巴氏涂片筛选未能发现50-80％的低级癌损伤和甚至15-30％的高级癌损伤。
任何细胞学诊断方法的第一步是获得合适的巴氏涂片细胞来观察。在常规的巴氏涂片试验，细胞学家检测到了脱落细胞样品，它们获自宫颈内衬刮下的细胞，涂抹细胞于载玻片，并用巴氏染料染色。细胞学家在染了色的涂片上检测到异常形态的细胞，这表明存在恶性病症。术语“恶性病症”指存在发育异常，包括原位腺癌(AIS)，侵入性癌(CA)，肿瘤，或类似的恶性或肿瘤细胞。
在本发明方法中，脱落细胞样品来自有或没有恶性病症的患者。这些样品可以通过旋转宫颈取样装置获得，如沿宫颈或阴道粘膜部分的擦拭签，刮刀，或细胞刷以获得细胞样品。合适的样品应含带有鳞状和/或腺细胞的宫颈内膜细胞。
脱落细胞样品通常涂于载玻片，在载玻片表面形成一薄层样品。然而，手工操作观察细胞异常或自动化分析细胞学物质可以通过在样品载玻片上制备“单层”细胞来优化。“单层”的定义实质上是均匀分布的细胞物质的二维的层，主要由单个细胞和小细胞簇组成。
当进行巴氏涂片检测时，妇科学家从宫颈表面收集到脱落细胞，并把它们置于载玻片上，交给细胞学家进行进一步检测。然后细胞学家观察置于载玻片上的细胞，并寻找异常细胞。如果发现异常细胞，则认为该巴氏涂片为阳性。如果没有异常细胞，则认为该巴氏涂片为阴性。对于早期宫颈癌检测，巴氏涂片筛选通常作为一种实用并经济的方法。在本发明中，通过Virapap/Viratype分析(TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)来确定HPV阳性。
2.阴道镜检巴氏涂片处理设计为初期筛检之用，而阴道镜检查及其相关方法通常用于确定巴氏涂片异常，癌症等级和潜在癌损伤。自从1925年阴道镜检查被引进以来，它作为经巴氏涂片检测有宫颈异常可能性患者的后继诊断方法，已经被广泛认识。通常认为利用阴道镜检查评价巴氏涂片异常的患者是非常有效的，因此它已成为西方社会对这种病情的医疗标准。在美国每年估计会进行4百万次阴道镜检查。
3.荧光分光镜检查另一种检测癌前期的和癌的生长或损伤的方法是荧光分光镜检查，其能快速的，非侵袭性的，定量探测出组织变为肿瘤时，其生物化学和形态学变化。肿瘤组织改变了的生物化学和形态学状态反射为可测量的荧光的特性。美国专利6,258,576和6,135,965论述了宫颈鳞状上皮(CIN)损伤的诊断并特别引入作为参考。
3.癌前期的和癌的生长的治疗治疗意指肿瘤生长的消除，减少或延迟效果。癌生长可通过切除或烧蚀方法治疗。除了下面将要详细描述的免疫疗法之外，也可以在本发明方法中使用以下治疗或预防方法。
i)化学疗法癌症疗法还包括基于化学和放射治疗两者结合的多种组合疗法。组合的化学疗法，如顺铂(CDDP)，卡铂，甲基苄肼，盐酸氮芥，环磷酰胺，喜树碱，异环磷酰胺，苯丙氨酸氮芥，苯丁酸氮芥，白消安，亚硝基脲(nitrosurea)，放线菌素D，红比霉素，阿霉素，博来霉素，plicomycin，丝裂霉素，鬼臼亚乙苷(VP16)，他莫昔芬，雷洛昔芬，雌激素受体粘合剂，紫杉醇，gemcitabien，诺威本，法呢基蛋白转移酶抑制剂，反铂(transplatinum)，5氟尿嘧啶，长春新碱，长春灭瘟碱和氨甲蝶呤，或上述药物的任何类似物或衍生物变异体。
ii)放射疗法其它导致DNA损伤的因素并广泛使用的方法包括通常所说的γ射线，X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞定向的输送。还包括其它形式的DNA损伤因素，如微波和UV照射。所有这些因素很可能影响大范围的DNA损伤，前体DNA，和DNA的复制和修复，以及染色体的装配和维持。X射线的剂量值从每日在50至200伦琴持续一段时间(3至4周)到伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量值改变范围很大，并且它依赖同位素的半衰期，放射的强度和类型，以及肿瘤细胞的吸收。
当用于细胞时，此处的术语“接触”和“暴露于”描述的是治疗的或诊断的肽或多核苷酸，或化学疗法或放射性疗法的试剂被送达靶细胞或直接与靶细胞并列放置的过程。为了获得细胞致死或停滞，两种试剂以有效杀死细胞或防止其分裂的结合总量送达细胞。
iii)基因在另外一个实施方案中，次级治疗采用基因疗法，其中治疗性多肽在本发明的嵌合多肽之前，之后或同时施用。嵌合多肽与编码以下基因产物的第二载体结合的传输会在靶肿瘤上产生联合的抗高增殖性效应。或者，可以使用编码两个基因的单个载体。本发明包括多种蛋白，包括细胞增殖诱导物(如生长因子受体)，细胞增殖抑制剂(如肿瘤抑制剂)，和细胞死亡调节剂。
iv)烧蚀方法多数患有癌症的人一般都要进行一些类型的手术，包括预防性的，诊断性或分级的，治疗或减轻性的手术。治疗手术是对癌前期的或癌的治疗方法，它可与其它疗法结合应用，如本发明所述的，化学疗法，放射性疗法，激素疗法，基因疗法，免疫和/或另外的疗法。
有疗效的手术包括切除术，该手术中所有或部分的癌前期的或癌的组织被物理割除，切离，和/或破坏。肿瘤切除术指至少物理切除至少肿瘤的部分。除了肿瘤切除术，手术治疗包括激光手术，冷冻手术，电外科手术和基因错录受控的手术(Mohs’surgery)。进一步考虑本发明可联合表面癌，前期癌或附带一定正常组织的除去而使用。
切除癌细胞，组织或肿瘤的所有和部分后，在体内会形成一个腔。通过灌注，直接注射或在该区域局部施用另外的抗癌治疗来完成治疗。这样的治疗可以重复，如每1，2，3，4，5，6或7天，或每1，2，3，4和5周，或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个月。这种治疗也可以改变剂量。
v)其它药剂也考虑其它药剂与本发明的方法结合使用来改进治疗效果。这些附加药剂包括免疫调节试剂，影响细胞表面受体和GAP连接的增量调节的药剂，抑制细胞增长的和分化药剂，细胞粘附抑制剂，或增加高增殖性细胞对细胞凋亡诱导剂敏感性的药剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子，干扰素α，β，γ；IL-2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1，MIP-1β，MCP-1，RANTES，以及其它趋化因子。进一步还包括通过对高增殖性细胞建立自分泌或旁分泌效应，细胞表面受体或它们的配体，如Fas/Fas配体，DR4或DR5/TRAIL，的增量调节能加强本发明的细胞凋亡诱导能力。通过增加GAP连接数目增加细胞间信号传导会提高相邻高增殖性细胞群体的抗高增殖性效应。在其它实施方案中，细胞生长抑制的或分化的药剂可以与本发明联合使用以提高该方法的抗高增殖效应。还考虑使用细胞粘附抑制剂提高本发明的疗效。考虑的细胞粘附抑制剂有粘着斑激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他汀。此外还包括增加高增殖性细胞对凋亡的敏感性的其它试剂，如抗体c225可以结合本发明使用来提高疗效。
激素疗法也可与本发明方法或上述其它任何癌症疗法结合使用。激素疗法可用于治疗某些癌症如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌或宫颈癌，以使某些激素，如睾丸素或雌激素的水平降低或阻止其作用。这种疗法通常与至少一种其它癌症疗法结合使用，作为一种治疗方法或减少转移的危险性。
v)抗病毒剂感染HPV的患者可以单独使用抗病毒剂治疗或与抗癌疗法结合治疗。“抗病毒剂”指一类组合物，它能防止或抑制病毒感染；防止或抑制病毒感染进展；减少病毒的浸染性；防止，抑制或减少病毒感染的生理学症状；防止或减少病毒活化的发生率；抑制病毒宿主细胞；诱导宿主细胞凋亡；从全身或局部清除病毒；诱导病毒失活；或上述作用的任意结合。
抗HPV剂包括施用如下药物，磷酸胆碱钙，Thiovir，thiovir类似物(BioKeys)，坡多非洛，鬼臼脂，三氯乙酸(TCA)，5氟尿嘧啶(5-FU)，损伤部内或intransal干扰素，或Imiquimid霜剂。其它试剂公开于美国专利6,245,568、6,238,659，和6,214,874。
II.蛋白和肽的选择、合成和应用本发明中，肽被应用于诊断和治疗的方法。这些肽与HPV16癌蛋白相关。
A.蛋白质组合物在某些实施方案中，本发明涉及的新的组合物，其至少包括一种如以下肽序列的蛋白质分子SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19以及多肽SEQ ID NO20和SEQ ID NO21。此处，“蛋白质分子”，“蛋白质组合物”，“蛋白质化合物”，“蛋白质链”或“蛋白质物质”通常包括，但不限于，一种多于200个氨基酸的蛋白质或从一个基因翻译来的全长内源性序列的蛋白质；多于约100个氨基酸的多肽，和/或来自约3至约100个氨基酸的肽。上述所有的“蛋白质”术语可在此交替使用。
在某些实施方案中，至少一种蛋白质分子包括的氨基酸长度是，但不限于，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220，230，240，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725，750，775，800，825，850，875，900，925，950，975，，，，，或更多氨基分子残基，以及其中任何可变范围。本发明的肽包括4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或直到包括100个来自SEQ ID NOS1-21的相邻氨基酸。SEQ ID NOS1-10的肽来自HPV的E6多肽，SEQ ID NOS11-19的肽来自HPV的E7多肽。SEQ ID NOS20和21分别是来自HPV癌蛋白E6和E7的多肽。HPV 16中E6的GenBank编号为AF327851(SEQ IDNO26)，HPV16中E7的编号为U76404(SEQ ID NO27)，它们都特别引入作为参考。根据表3可知，特别考虑作为本发明一部分的肽包括以下的E6肽K9L(SEQ ID NO26的氨基酸18-26)，E10I(SEQ ID NO26的氨基酸23-34)，C10R(SEQ ID NO26的氨基酸37-46)，Q15L(SEQ ID NO26的氨基酸43-57)，VIOC(SEQID NO26的氨基酸49-58)，P9L(SEQ ID NO26的氨基酸66-74)，P10I(SEQ ID NO26的氨基酸102-111)，Q20P(SEQ ID NO26的氨基酸97-116)，R16R(SEQ ID NO26的氨基酸131-146)，G10S(SEQ ID NO26的氨基酸141-150)，或其组合。根据表3，进一步可知，特别考虑作为本发明的一部分的肽包括如下E7肽T10Q(SEQ IDNO27的氨基酸7-15)，M9T(SEQ ID NO27的氨基酸12-20)，D9L(SEQ ID NO27的氨基酸14-22)，Q19D(SEQ ID NO27的氨基酸44-62)，R9F(SEQ ID NO27的氨基酸49-57)，R9V(SEQ IDNO27的氨基酸66-74)，L9V(SEQ ID NO27的氨基酸82-90)，G10C(SEQ ID NO27的氨基酸85-94)，D20C(SEQ ID NO27的氨基酸75-94)，或其组合。
此处，“氨基分子”指任何本领域技术人员公知的氨基酸，氨基酸衍生物或氨基酸类似物。在某些实施方案中，蛋白质分子的残基是连续的，不存在任何非氨基分子中断氨基分子残基的序列。在其它实施方案中，所述序列可以包括一个或多个非氨基分子部分。在特定的实施方案中，蛋白质分子的残基序列可以被一个或多个非氨基分子部分中断。
因此，术语“蛋白质组合物”包括氨基分子序列，该序列含有存在于天然合成蛋白质中20个普通氨基酸的至少一个氨基酸，或包括但不限于下表1所示的至少一个修饰的或非常见的氨基酸。
在某些实施方案中，蛋白质组合物包括至少一种蛋白质，多肽或肽。进一步的实施方案中，蛋白质组合物包括一种生物相容的蛋白质，多肽或肽。此处所用的术语“生物相容的”指以这里描述的方式和剂量施用或用药到给定的生物体时，不产生明显的不适反应。生物体包括，但不限于，这样的不适或不利反应例如显著毒性或不利的免疫反应。在优选的实施方案中，含有生物相容的蛋白质，多肽或肽的组合物通常是哺乳动物蛋白或肽或合成的蛋白或肽，它们基本上不含毒素，病原体或有害免疫原。
蛋白质组合物也可由任何本领域公知的技术制备，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质，多肽或肽，从天然源料中分离蛋白质化合物，或化学合成蛋白质物质。不同基因的核苷酸和蛋白质，多肽和肽序列已经公开了，并可由本领域普通技术人员从计算机数据库获得。其中一个数据库是美国国家生物技术信息中心Genbank和GenPept数据库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。可以用本发明公开的技术或本领域公知的技术对这些已知基因的编码区域进行扩增和/或表达。
在某些实施方案中，蛋白质组合物可以为纯化的。通常“纯化的”指经分级分离除去不同的其它蛋白质，多肽，或肽的某一特定蛋白质，多肽，或肽组合物，并且该组合物基本仍保持其活性，并可测定，如通过本领域普通技术人员公知的，针对特殊的或目的蛋白质，多肽或肽的蛋白质测定。
事实上可以使用含有任何蛋白质，多肽或肽的成分用于本发明的组合物和方法。然而，蛋白质物质优选为生物相容性的。在某些实施方案中，考虑形成更粘的组合物有利于组合物更加精确或更易施用于组织，并在整个过程中保持接触组织。在这种情况下，考虑使用肽组合物，或更优选地，使用多肽或蛋白质组合物。粘度范围包括，但不限于，大约40至100泊。在某些方面，优选粘度为80至100泊。
B.肽的选择，合成和使用根据与现有文献中描述的已知T细胞表位相关的两亲性结构和信息，选择与HPV 16的E6和E7癌蛋白相应的肽序列。
本发明的肽可以按照常规方法在溶液中或固体支持物上合成。各种自动合成器可以通过商业获得并按照已知的步骤使用。通常，长度小于100个残基的小的合成的肽序列通常通过逐步的固相合成法制备。这种固相合成法利用不溶性树脂支撑低聚物的生长。预定包含目的聚合物的亚基序列在支持物上依次共同反应。在起始反应中末端氨基酸直接或通过连接剂连结在固体支持物上。该末端残基依次与一系列进一步的残基如氨基酸类或阻断的氨基酸部分反应，以得到通过该末端残基附着在固相物上的生长的寡聚体。在合成方案的每一步，未反应的反应物被洗掉或从与固相接触中除去。这一循环以预选残基序列一直持续直到所需聚合物完全形成，但仍保持与固相接触。然后从固相支持物上切割该聚合物并纯化有待使用。上述的常规合成方案是由R.B.Merrifield发明并用于制备某些肽(Merrifield，1986)。这些肽可以在改良的Vega 250自动肽合成器中合成(VegaBiochemicals，Tucson，AZ)或利用Houghten提及的“口袋法”(″bagmethod″)合成(Houghten，1985)。也可参见，如Stewart和Young，(1984)；Tam等，(1983)；和Barany和Merrifield(1979)，这些都在此处引入作为参考。
符合所述所选区域的短肽序列，或重叠肽的文库，通常由6至35到50个氨基酸组成，能容易地合成，并且然后通过设计用来鉴定反应肽的筛选方法进行筛选。本发明包括SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19和SEQ ID NO20，SEQ ID NO21中至少含有4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或多达约100个连续的氨基酸残基的肽。
本发明使用的组合物可包括一种经修饰能增强其活性或使其具有生物防护性的肽。如美国专利5,028,592(引入本申请作为参考)中公开的，生物防护性肽与非防护性肽相比在给病人施用时具有某些优点，防护性肽通常显示出增强的药理学活性。
用于本发明的组合物也可包含包括有所有L-氨基酸，所有D-氨基酸，或其混合物的肽。使用D-氨基酸可以对天然存在于人体的蛋白酶具有额外的抗性并且具有较少的免疫原性，因此预期能具有较长的生物半衰期。
III.蛋白质纯化来自HPV的肽和蛋白质可以通过多种方法纯化。通常，“纯化”是指经分级除去各种其它的蛋白质，多肽或肽的特定的蛋白质，多肽或肽组合物，该组合物基本仍保持其活性，可通过如下文所述的蛋白质测定，或通过本领域普通技术人员公知的方法评估目的蛋白质，多肽或肽。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个水平上包括，粗分级细胞成分与多肽和非多肽部分。从其它蛋白中分离出多肽后，可利用层析和电泳技术对目的多肽进一步纯化，达到部分或完全纯化(纯化至均质)。尤其适合制备纯肽的分析方法是离子交换层析，排阻层析；聚丙稀酰胺凝胶电泳；等电聚焦电泳。尤其有效的纯化肽的方法是快速蛋白液相层析或甚至是HPLC。
本发明的某方面涉及纯化，在特定的实施方案中，实质上涉及纯化编码的蛋白质和肽，尤其来自E6或E7癌蛋白的肽。本发明使用的术语“纯化的蛋白质或肽”是指一种可从其它组分分离的成分，其中蛋白质或肽纯化到相对于其天然状态的任何程度。因此纯化的蛋白质或肽也指离开其天然环境的蛋白质或肽。
通常，“纯化的”指经分级分离去除各种其它成分的蛋白质或肽组合物，这些组合物实质上仍保持其表达的生物活性。而术语“基本纯化的”的使用，指蛋白质或肽形成该组合物的主要成分，如占该组合物的蛋白质的约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％或更多。
根据本发明公开的内容，本领域技术人员将了解定量蛋白质或肽的纯度的不同方法。这些方法包括，如确定一个活性级分的特定活性，或通过SDS/PAGE分析评估一个级分中的多肽数量。评估一个级分纯度的优选方法是算出这个级分的特定活性，将其与初提取物中的特定活性相比较，从而算出纯度，此处通过“纯化倍数”(-fold purificationnumber)估值。当然用来体现活性值的真实单位有赖于纯化之后选择的特定分析技术，以及表达的蛋白质或肽是否显示可检测的活性。
各种适用于蛋白质纯化的技术是本领域技术人员公知的。这些技术包括，如，用硫酸铵，PEG，抗体等沉淀，或通过加热变性，然后离心；层析步骤如离子交换，凝胶过滤，反相，羟磷灰石，和亲水层析；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术和其它技术的结合。正如本领域所公知的，可改变实施各纯化步骤的顺序，或可省略某些步骤，仍能得到基本纯化的蛋白质或肽的合适方法。
通常不需要总是提供最纯净状态的蛋白质或肽。事实上，在某些实施方案中，基本不纯的产物也具有可利用性。部分纯化可以联合使用较少的纯化步骤，或使用相同常规纯化方案的不同形式来完成。如，利用HPLC装置进行阳离子交换柱层析分离相比利用低压层析系统的同样技术通常会导致更高级别的纯化。显示相对较低纯化程度的方法对于蛋白产物的总回收或保持所表达的蛋白的活性是有利的。
已知多肽的迁移随着SDS/PAGE的不同情况而变，有时会很明显(Capaldi等，1977)。因此在不同的电泳条件下，须知纯化的或部分纯化的表达产物所表现的分子重量会不同。
高效液相层析(HPLC)表征为具有非凡的峰分辨率的非常快速的分离。这是通过使用非常精细的微粒和高压来保持足够的流速达到的。分离可以在大约几分钟或至一小时内完成。此外，只需要很少量的样品，因为微粒非常小且填充密实，柱床体积中只有很小的部分是空隙体积。而且样品的浓度也不需要很高，因为谱带很窄，样品仅有很小的扩散。
凝胶层析或分子筛层析是基于分子大小的一种特殊类型的分离层析方法。凝胶层析法分离技术所依据的理论是，所述柱由含有小孔的惰性物质微粒制成，当溶液通过或路过孔隙时，柱根据分子大小将大分子物质从小分子物质中分离出来。只要微粒制成的物质不吸收分子，决定流速的唯一因素就是分子大小。因此，只要性状相对不变，分子按照减小的大小顺序从柱中洗脱。对于分离不同大小的分子，凝胶层析是最好的，因为该分离不依赖其它所有因素，如PH，离子强度，温度等。并且该方法不存在吸收，较少有区带扩散，洗脱体积与分子量简单相关。
亲和层析是一种依赖于被分离物质与它能特定结合的分子之间的特定亲和力的层析操作。这是一种受体-配体型相互作用。柱材料通过将其中的结合伙伴之一共价结合到不溶基质上而合成。然后柱材料能特定吸附溶液中的物质。通过将条件改为不发生结合的情况而发生洗脱(如改变PH，离子强度和温度)。
用于纯化含糖化合物的特殊型亲和层析是凝集素亲和层析。凝集素是能结合各种多糖和糖蛋白的一类物质。凝集素通常通过溴化氰连结到琼脂糖上。“偶联葡聚糖的伴刀豆球蛋白A”是第一种应用并已广泛应用于分离多糖和糖蛋白的这类物质，其它凝集素包括扁豆凝集素，用于纯化N-乙酰葡糖胺残基小麦胚芽凝集素和盖罩大蜗牛(Helixpomatia)凝集素。凝集素自身用带有糖配体的亲和层析方法纯化。乳糖已用于从蓖麻子和花生中纯化凝集素；麦芽糖用于从扁豆和刀豆中提取凝集素；N-乙酰-D半乳糖胺用于从大豆中纯化凝集素；N-乙酰葡糖胺从小麦胚芽中结合凝集素；D-半乳糖胺用于从蛤和L-岩藻糖从莲中结合凝集素。
基质应是一种自身不以任何明显度吸收分子并具宽范围的化学，物理和热稳定性的物质。配体应以不影响其结合性的方式被偶联。配体也应提供相对紧密的结合。洗脱该物质时应尽可能不损伤样品或配体。最常见的亲和层析之一是免疫亲和层析。适合用于本发明的抗体的生产在下文中论述。
IV.核酸A.筛选DNA在本发明中，核酸筛选不仅用于筛选受感染的样品，而且用于发现疾病复发的可能性。依赖核酸杂交的筛选方式使得可能从任何生物体中分离任何基因序列，只要有适合的探针。与一部分编码目的蛋白质的序列相应的寡核苷酸探针可以用化学法合成。这需要知道短的寡肽的氨基酸序列。编码蛋白质的DNA序列能从遗传密码中推出，然而必须考虑该密码的简并性。当序列简并时有可能进行混合加成反应。包括变性双链DNA的异质性混合。对于这种筛选，杂交作用最好在单链DNA或变性的双链DNA上进行。杂交是在检测cDNA克隆中尤为有用，其中cDNA克隆源于存在有极少量与目的多肽有关的mRNA序列的来源。换句话说，通过利用避免非特异结合的严紧杂交条件，有可能使得，如允许通过将靶DNA杂交混合物中与它完全互补的单个探针而自显影特定cDNA(Wallace等，1981)。使用13到100个核酸的探针或引物，尤其是长度介于17至100个核酸的，或在本发明的一些方面，多达1至2千个碱基对或更长的探针或引物，可以形成既稳定又有选择性的双链分子。通常优选具有连续长度多于20个碱基的互补序列的分子，以增强所得杂交分子的稳定性和/或选择性。通常优选设计用于杂交的核苷酸分子具有一个或多个含20至30个核苷酸或所需更长的互补序列。这样的片段容易制备，如通过化学方法直接合成或通过将选择性序列引入重组载体重组制得。
因此，本发明的核酸序列根据其能力可用于选择性形成具有DNA和/或RNA的互补序列的双链分子，或为从样品中扩增DNA或RNA而提供引物。根据使用需要，希望使用各种杂交条件获得探针和引物对靶序列的不同等级的选择性。
对于需要高选择性的应用，典型地希望使用相对高度严紧的条件形成杂交物。例如，相对低盐和/或高温条件，如提供0.02M至约0.10M的NaCl浓度和约50℃至约70℃的温度。这种高度严紧的条件几乎不允许(如果存在的话)探针或引物与模板或靶链之间的错配，特别适合分离特定基因或检测特定mRNA转录。通过附加增加量的甲酰胺，可以致使条件更加严紧。
对于某些应用，如定点诱变，须知优选使用较低严紧性的条件。在这种情况下，虽然杂交链的序列并没有完全互补，也会发生杂交，只是在一个或多个位置错配。通过增加盐浓度和/或降低温度，条件会变得不严紧。如，中等严紧程度的条件是0.1至0.25M的NaCl浓度在约37℃至约55℃，而低严紧度条件可以提供约0.15M至约0.9M的盐浓度，和约20℃至55℃范围的温度。杂交条件可依据需要的结果方便的控制。
在其它实施方案中，杂交可以在下述条件下进行，如50mMTris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2，1.0mM二硫苏糖醇，温度在约20℃至约37℃之间。其它使用的杂交条件包括约10mMTris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，温度范围在约40℃至约72℃之间。
在某些实施方案中，使用本发明确定的核酸序列结合适当的方法(如标记物)确定杂交是有利的。各种适当的指示剂为本领域公知，包括发荧光的，放射性的，酶的或其它配体的，如亲和素/生物素，这些试剂能用于检测。在优选的实施方案中，宜使用荧光标记物或酶标记，如尿素酶，碱性磷酸酶或过氧化物酶，而不使用放射性的或其它对环境不利的试剂。在使用酶试剂的例子中，已知比色指示物能够提供可看得见的或可分光光度检测的检测试剂，从而检测同含互补核酸的样品的特定杂交。
通常，考虑这里描述的探针或引物在杂交溶液中作为试剂使用，如在PCRTM中，用于检测相应基因的表达，也用于利用固相的实施方案。在涉及固相的实施方案中，测试的DNA(或RNA)被吸收或粘贴到所选择的基质或表面上。该固定的单链核酸然后在所需条件下与所选的探针进行杂交。这种条件的选择取决于特定的环境(如取决于G+C的含量，靶核酸的类型，核酸的来源，杂交探针的大小等)。根据具体目的应用来优化杂交条件是本领域技术人员是公知的。洗脱杂交分子去除非特异性结合的探针分子后，检测杂交，和/或通过确定结合标记的数量来定量。典型的固相杂交方法已经公开于美国专利5,843,663、5,900,481和5,919,626中。其它可在本发明实践中使用的杂交方法公开于美国专利5,849,481、5,849,486和5,851,772中。说明书这部分确定的这些或其它相关参考部分在此引入作为参考。
B.合成DNA当目的多肽产物的氨基酸残基全序列已知时，合成DNA序列是经常选择的方法。当目的多肽产物的氨基酸残基全序列未知时，不可能直接合成DNA序，选择的方法是合成cDNA序列。分离目的cDNA序列的标准程序是形成由质粒或噬菌体携带的cDNA文库，该文库获自富含于供体细胞的mRNA的逆转录，该供体细胞具有高水平的基因表达。若使用聚合酶链反应技术合成时，即使稀有的表达产物也能被克隆。在多肽氨基酸序列的主要部分已知的情况下，可以使用同靶cDNA中推定存在的序列的相同的已标记的单链或双链DNA或RNA探针序列的进行DNA/DNA杂交，这种杂交对已变性为单链形式的cDNA的克隆的拷贝进行。
1.生物芯片在各种支持物上分离生物分子阵列(称为生物芯片)的方法已经发展并已用于DNA合成，测序，突变研究，基因表达分析和基因发现中。生物芯片可在本发明中使用，因为它能使我们鉴定出病理状态的标记，在此是HPV感染，其可能具有后续诊断学价值。
生物芯片的使用涉及将标记的分子或分子集合杂交在生物芯片上固定的靶。标记的分子通常是细胞或组织的mRNA的cDNA拷贝。在这种情况下，每种不同类型的cDNA的拷贝数反映了在最初分离物中相应mRNA种类的拷贝数。通常，杂交到在生物芯片固定的靶上的强度与cDNA浓度成比例，因而杂交密度的测量能够推算出最初分离物中mRNA的相对数量。不同mRNA分离物中相同mRNA的相对数量能通过比较两个样品之间的对该相同靶点的杂交密度来确定。这些测量方法可用于鉴别能具有后续诊断价值的特定细胞类型或病理状态。或者，在给定的疾病中，特定mRNA的突然增加可能表明药物攻击的可能目标，这样提供了新的治疗目标。
C.核酸扩增反应核酸分子可通过使用多种技术检测，包括扩增反应。本发明包括使用这种扩增反应来检测细胞介导的免疫应答或鉴别感染HPV和/或有癌前期的或癌的生长的患者。如，细胞介导的免疫应答能通过本发明公开的TH1或TH2细胞因子的RT-PCR检测。
1.聚合酶链反应(PCRTM)根据标准操作方法(Sambrook，1989)，用作扩增模板的核酸从生物样品包含的细胞中分离。核酸可以是基因组DNA或部分或整体的细胞RNA。当使用RNA时，需要将RNA转变为cDNA。
在允许选择性杂交的条件下，选择性杂交相应于KATP通道蛋白质或其突变体的核酸的引物对与分离的核酸相接触。此处定义的术语“引物”包括在依赖模板的过程中能够引发新生核酸合成的任何核酸。一般，引物是长度为10至20个碱基对的寡核苷酸，但也可使用更长的序列。引物可以单链或双链形式供给，但优选单链形式。
一旦杂交，核酸引物复合物就接触一个或多个促进依赖模板的核酸合成的酶。多轮扩增，也称为“循环”被实施直到产生足够数量的扩增产物。
下一步，检测扩增产物。在某些应用中，检测可通过可视的方法进行。或者，检测可涉及通过化学发光法，引入放射性标记物的放射性闪烁法或荧光标记法或甚至通过电或热脉冲信号的方法(Affymax工艺)间接识别产物。
许多依赖于模板的方法可以用来扩增存在于给定模板样品中的标记序列。最著名的扩增方法是聚合酶链反应(称为PCRTM)，该方法已在美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159中详细描述了，此处都完全引入作为参考。
简要地，在PCRTM中，制得互补于标记序列的相反互补链区域的两条引物序列。过量的脱氧核苷三磷酸与DNA聚合酶(如Tap聚合酶)加入到反应混合物中。如果标记序列存在于样品中，引物将结合标记物，且聚合酶将通过增加核苷酸使引物沿着标记序列延长。通过提高和降低反应混合物的温度，延伸的引物会从标记物中分离出来形成反应物，过量的引物将结合标记物以及反应物，并且重复该过程。
为了量化mRNA扩增数量或从目的mRNA制备cDNA，可以采用反转录酶PCRTM(RT-PCRTM)扩增过程。反转录RNA为cDNA的方法是公知的并描述于Sambrook等，1989。可选择的反转录方法利用耐热的，依赖于RNA的DNA聚合酶。这些方法描述在日提交的WO90/07641中，此处引入作为参考。聚合酶链反应是本领域公知的方法。
2.其它核酸扩增反应另一个扩增方法是连接酶链反应(″LCR″)，公开于EPA No.320308，此处全部引入作为参考。在LCR中，制备两个互补探针对，在靶序列存在下，各对将结合靶序列相反的互补链使得它们相邻。在连接酶存在下，两个探针对将连成单个序列。通过温度循环(如同在PCR中)，结合的连接序列从靶上分离，然后作为“靶序列”连接过量的探针对。美国专利4,883,750描述了类似于LCR的方法以结合探针对到靶序列上。
Qbeta复制酶也可用作本发明的另一种扩增方法，该方法描述于PCT申请PCT/US87/00880中，此处全文引入作为参考。该方法中在RNA聚合酶存在时，将具有互补于靶的区域的RNA的复制序列加入到样品中。聚合酶将拷贝该复制序列，其然后被检测出。
本发明还可使用了等温扩增方法扩增核酸，该方法使用限制性内切核酸酶和连接酶完成靶分子的扩增，所述靶分子在酶切位点的一条链上包含核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸。
链置换扩增(SDA)是进行核酸等温扩增的另一方法，包括链置换和合成的多次循环，即切口平移。类似的方法，称为修复链反应(RCR)，包括在扩增的靶区域中退火若干探针，然后在仅有四种碱基中的两种碱基存在时发生修复反应。另外两种碱基可作为生物素化的衍生物被加入以便于检测。类似的方法也应用于SDA中。靶特异性的序列也可用循环探针反应(CPR)检测。在CPR中，具有非特定DNA的3’和5’序列和特定RNA的中间序列的探针与样品中存在的DNA杂交。杂交后，就用RNase H处理反应，且探针的产物鉴定为消化后释放的不同产物。原始模板退火到另一个循环探针上，并重复反应。
还有另外的扩增方法可用于本发明，这些方法公开于英国申请和PCT申请PCT/US89/01025中，它们都全部引入本文作为参考。开始使用时，“修饰的”引物用于PCRTM类的，依赖模板和酶的合成。引物可通过标记捕获部分(如生物素)和/或检测部分(如酶)来修饰。随后的使用中，过量的标记探针加入样品中。靶序列存在下，探针结合并被催化切割。切割后，靶序列完整释放以结合过量的探针。标记探针的切割显示了靶序列的存在。
其它的核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR Gingeras等人，PCT申请WO 88/10315，在此引入作为参考。在NASBA中，制备用于扩增的核酸可通过标准苯酚/氯仿提取，临床样品热变性，用裂解缓冲液处理和小自旋柱分离DNA和RNA或氯化胍提取RNA。这些扩增技术涉及将具有靶特定序列的引物退火。聚合之后，DNA/RNA杂交体被Rnase H消化，而双链DNA分子再次加热退火。在任一条件下，单链DNA通过添加第二靶特定引物完全双链化，之后进行聚合。然后双链DNA分子通过RNA聚合酶如T7或SP6多重转录。在等温循环反应中，RNA反转录为单链DNA，然后该DNA转变成双链DNA，于是再次用RNA聚合酶如T7或T6转录。不论合成产物是截短的或完整的，都能指示靶特定序列。
Davey等(EPA No.329 822，此处全文引入作为参考)公开了一种核酸扩增方法，其包括循环合成单链RNA(″ssRNA″)，ssDNA，和双链DNA(dsDNA)，该方法可用于本发明。ssRNA是第一引物寡核苷酸的模板，它通过反转录酶延长(依赖RNA的DNA聚合酶)。然后通过核糖核酸酶H(RNase H，一种特异于与DNA或RNA配对中的RNA的核糖核酸酶)的作用将RNA从所得DNARNA双链体中去除。得到的ssDNA是第二引物的模板，也包括在其与模板的同源序列5’端的RNA聚合酶启动子(以T7 RNA聚合酶为例)的序列。该引物然后通过DNA聚合酶延长(以E.coli DNA聚合酶I的大″Klenow″片断为例)，得到的双链DNA(″dsDNA″)分子具有和最初引物之间的RNA相同的序列，此外在一端含有启动子序列。通过适当的RNA聚合酶，该引物序列可用于制备该DNA的许多RNA拷贝。这些拷贝然后再进入循环中导致非常迅速的扩增。用适当选择的酶，这一扩增能在等温条件下进行而不需在每个循环中添加酶。因为这一过程的循环本质，起始序列可选择为DNA或RNA形式之任一。
Miller等(PCT申请WO 89/06700，此处完全引入作为参考)公开了一种核酸序列扩增方案，该方案基于杂交启动子/引物序列到靶单链DNA(″ssDNA″)，然后转录该序列的许多RNA拷贝。该方案不循环，即不从合成的RNA转录物产生新模板。其它扩增方法包括″RACE″和″单侧PCR″(Frohman，1990，引入作为参考)。
基于两个(或多个)寡核苷酸连接的方法也可以用于本发明的扩增步骤中，该方法在含有得到的“双-寡核苷酸”序列的核酸存在的情况下扩增双-寡核苷酸。
D核酸检测经过任何扩增后，需要从模板和/或过量的引物中分离扩增产物。核苷酸的检测可用于鉴别细胞介导的免疫应答，和感染HPV和/或有癌前期的或癌的生长的患者。
在一个实施方案中，扩增产物通过琼脂糖，琼脂糖丙稀酰胺或聚丙稀酰胺凝胶电泳用标准方法分离(Sambrook等，1989)。可从凝胶中切下并洗脱来分离的扩增产物。用低熔点琼脂糖凝胶，分离带可通过加热凝胶取出，然后提取该核酸。
核酸分离也可利用本领域公知的层析分离技术。本发明的实例中可使用许多种层析技术，包括吸附层析，分配层析，离子交换层析，羟磷灰石层析，分子筛层析，反相层析，柱层析，纸层析，薄层层析，气相层析和HPLC。
在某些实施方案中，