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不同抗原含量鸡新城疫灭活疫苗的HI效价测定
优质期刊推荐鸡新城疫病毒xx08株血凝素—神经氨酸酶基因主要抗原区的原核表达及鉴定--《河南科技学院》2012年硕士论文
鸡新城疫病毒xx08株血凝素—神经氨酸酶基因主要抗原区的原核表达及鉴定
【摘要】：新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性传染病,可感染多种鸟类,尤其家禽更易感染且往往是致死的。NDV也被称之为禽副黏病毒-Ⅰ型,是副黏病毒科,腮腺炎病毒属成员之一。HN是位于NDV囊膜表面的最主要结构性糖蛋白和免疫保护性抗原之一,与病毒的毒力密切相关,在致病和免疫应答过程中发挥着极其重要的作用。
本研究利用原核表达系统为了获得具有反应原性和免役原性HN糖蛋白。截取NDVxx08株HN基因主要抗原区(523bp-1101bp),命名为tHN(579bp),通过设计特异性引物,插入EcoR Ⅰ、 Xho Ⅰ(?)(?)制性酶切位点,以pMD-HN重组质粒为模板,扩增出NDV HN基因主要抗原区tHN基因片段。将tHN基因片段克隆于pMD18-T-simple载体,构建重组克隆质粒,命名为pMD-tHN。
利用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切克隆质粒pMD-tHN,获得tHN基因片段,克隆于pET-32a(+)表达载体,构建重组表达质粒,命名为pET32-tHN。将该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),于28℃、0.1mmol/L IPTG、4h最佳诱导条件下诱导表达,以SDS-PAGE分析tHN重组蛋白表达水平。Western-blot鉴定tHN重组蛋白表达产物的特异性。以切胶回收纯化的tHN重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,制备tHN蛋白多克隆抗体,用Western-blot和间接ELISA方法鉴定其特性。
结果表明,tHN重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)内以包涵体的形式获得高效表达,其分子量约为38kDa,并且能够与NDV高免血清发生特异性反应。获得的tHN重组蛋白鼠源多抗能够识别tHN重组蛋白和NDV。
本研究利用原核表达系统获得的tHN重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,为将来建立检测NDV抗体滴度的方法、制备多肽疫苗和HN单克隆抗体奠定了基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：河南科技学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：S855.3【目录】：
目录5-8缩略词表8-10摘要10-11Abstract11-13第一章 文献综述13-27 1 新城疫(ND)13 2 NDV的生物学特性13-16
2.1 NDV的分类、形态和结构特征13-15
2.2 NDV的理化特性15
2.3 NDV的培养特性15
2.4 NDV的致病性15-16 3 NDV的基因组16-17 4 NDV基因组编码的蛋白及其结构及功能17-24
4.1 NP、P和L蛋白17-18
4.2 基质蛋白(M)18-19
4.3 V蛋白和W蛋白19
4.4 NDV囊膜糖蛋白结构及其功能19-24 5 ND的流行病学24-25 6 研究目的与意义25-27引言27-29第二章 鸡NDV xx08株HN基因主要抗原区(tHN)基因片段的克隆29-41 1 试验材料与方法29-36
1.1 菌株、载体及工具酶29
1.2 主要试剂29
1.3 主要仪器设备29-30
1.4 主要试剂配制30-31
1.5 引物设计31
1.6 NDV xx08株tHN基因片段的扩增31-32
1.7 琼脂糖凝胶电泳32
1.8 NDV xx08株tHN基因片段PCR产物的回收32-33
1.9 NDV xx08株tHN基因片段与pMD18-T-simple克隆载体连接33
1.10 NDV xx08株tHN基因片段连接产物的转化33-34
1.11 pMD-tHN重组克隆质粒的小量提取34-35
1.12 pMD-tHN重组克隆质粒鉴定35-36
1.13 NDVxx08株tHN基因片段的回收与纯化36
1.14 NDVxx08株tHN基因片段的序列分析36 2 结果与分析36-38
2.1 NDV xx08株tHN基因片段的克隆结果36
2.2 NDV xx08株tHN基因片段PCR扩增产物的回收结果36-37
2.3 NDV xx08株tHN基因片段克隆质粒的构建及鉴定结果37
2.4 NDV xx08株tHN基因片段回收鉴定37-38
2.5 NDV xx08株tHN基因片段的序列分析结果38 3 讨论38-41第三章 鸡NDV xx08株tHN基因片段的表达及鉴定41-63 1 试验材料与方法41-49
1.1 菌株、载体及工具酶41
1.2 主要试剂41-42
1.3 主要仪器设备42
1.4 主要试剂配制42-44
1.5 NDV xx08株tHN基因片段重组表达质粒的构建44-45
1.6 NDV xx08株tHN基因片段的序列分析45
1.7 pET32-tHN重组表达质粒在E.coli BL21(DE3)中诱导表达45-46
1.8 pET32-tHN重组表达质粒表达产物的SDS-PAGE分析46-47
1.9 tHN重组蛋白诱导表达条件的优化47
1.10 tHN重组蛋白诱导表达产物的可溶性分析47-48
1.11 tHN重组蛋白的切胶回收纯化48
1.12 tHN重组蛋白的Western-blot鉴定48-49
1.13 纯化tHN重组蛋白浓度测量49 2 NDV xx08株tHN重组蛋白鼠源多克隆抗体的制备及鉴定49-51
2.1 tHN重组蛋白鼠源多抗的制备49
2.2 tHN重组蛋白鼠源多抗的鉴定49-51 3 结果与分析51-57
3.1 pET32-tHN重组表达质粒的构建51-52
3.2 pET32-tHN重组表达质粒的序列测定与分析52
3.3 pET32-tHN重组表达质粒表达产物SDS-PAGE分析结果52
3.4 tHN重组蛋白最佳诱导表达条件优化结果52-54
3.5 tHN重组蛋白可溶性分析结果54-55
3.6 tHN重组蛋白的切胶回收纯化结果55-56
3.7 tHN重组蛋白的Western-blot鉴定结果56-57
3.8 纯化tHN重组蛋白浓度测量结果57 4 NDV xx08株tHN重组蛋白鼠源多克隆抗体的制备及鉴定57-59
4.1 tHN重组蛋白鼠源多抗制备57
4.2 tHN重组蛋白鼠源多抗鉴定57-59 5 讨论59-63
5.1 tHN重组蛋白表达及鉴定59-60
5.2 HN蛋白的B细胞抗原表位60-61
5.3 影响HN蛋白抗原表位的因素61
5.4 表位多肽与多肽疫苗61-63全文结论63-65参考文献65-75附录75-79致谢79
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京公网安备75号鸡恒定链功能片段跨物种增强小鼠对新城疫F2抗原免疫作用的研究--《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2014年05期
鸡恒定链功能片段跨物种增强小鼠对新城疫F2抗原免疫作用的研究
【摘要】：【目的】研究恒定链(Invariant chain,Ii)功能片段作为载体的跨物种免疫增强作用及其潜在机制。【方法】构建基于鸡Ii功能片段与新城疫病毒抗原表位F2的嵌合体(Ii-F2、Cyt/Tm/Ii-key/F2/AP、Tm/Ii-key/F2/AP、Ii-key/F2/AP、Ii-key/F2),将其定向克隆至原核表达载体pET-32a中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并用IPTG诱导表达,嵌合体融合蛋白纯化后免疫小鼠,用ELISA法测定血清抗体效价。同时,分别构建含鸡Ii和小鼠MHCⅡ类分子基因的真核表达载体,并将其共转染COS7细胞,通过激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的共定位。【结果】用F2与Ii-key等Ii功能片段连接的融合蛋白免疫的试验组小鼠的抗体效价,较单独用F2抗原肽免疫的对照组小鼠产生的抗体效价提高了1.5~3倍。显微观察发现,鸡Ii和小鼠MHCⅡ分子在细胞内可以共定位。【结论】Ii具有跨越物种限制增强免疫的作用。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：S852.43【正文快照】：
肽疫苗具有特异性强、安全、有效等特点,目前已经应用于癌症、糖尿病等疾病的治疗[1-2],构建具有增强抗原递呈免疫载体的嵌合体肽疫苗无疑是一种提高治疗效果的有效方法。恒定链(Invariantchain,Ii)是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,呈非多态性[3-4],作为MHCⅡ类分子伴侣蛋白,在递呈外源
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京公网安备75号Patent CNA - 一种鸡新城疫株病毒及其分离方法 - Google PatentsCN AApplicationCN Nov 7, 2012Apr 26, 2012Apr 26, 2012.8, CN
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(3) , 一种鸡新城疫株病毒及其分离方法
本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一种鸡新城疫株病毒及其分离方法，代号为SDM01株并提供了其分离制备方法，发明人对该毒株进行了生物保藏，保藏编号CCTCC NO：V201109；通过SPF鸡胚传代，进行了生物学特性试验如血凝性、血清中和试验、动物回归试验和外源病毒检查，试验结果证实该病毒为新城疫病毒。通过鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定、6周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定，证实该新城疫病毒为强毒力毒株。通过对分离毒株及标准毒株制备阳性血清，进行HI交叉中和试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验、F和HN基因序列测序比较及免疫攻毒保护试验，结果证实新城疫SDM01株与传统的疫苗毒株（La Sota株及Clone30株）在基因分型及抗原性上均产生了较大的差异。
1. 一种鸡新城疫病毒株SDMOl，其保藏编号为：CCTCC N0:V201109。
2.如权利要求I所述的鸡新城疫病毒株SDM01，其特征在于：其分离制备方法如下：
无菌采集发病鸡的气管、脑、输卵管和肝脏，称重后分别按I : 3的重量比加入灭菌生理盐水，匀浆后经超声波处理，以3000r/min离心15min，取上清加青（链）霉素双抗至2000IU/ml，置4°C冰箱过夜，无菌检验合格后，分别接种5个10日龄SPF鸡胚，每胚0. 2ml。弃去24小时内死亡的鸡胚，此后每6-8小时照蛋I次，及时将死亡鸡胚取出，置2-8V冷藏，至96小时取出所有鸡胚，无菌收取鸡胚尿囊液，留样检测后病毒分离物即可置-70°C保存备用。
3.如权利要求I所述的鸡新城疫病毒株SDMOl，其在作为疫苗株的应用。
一种鸡新城疫株病毒及其分离方法
[0001] 本发明涉及动物病毒学领域，具体提供了一种新的鸡新城疫病毒，并且提供了该病毒的分离方法及其应用。
[0002] 鸡新城疫（NewCastledisease), 由副粘病毒引起的高度接触性传染病。又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。常呈急性败血鸡新城疫鸡新城疫症状。主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊舌L、粘膜和衆膜出血。死亡率尚，对养鸡业为害严重。有强毒株和弱毒株两类。病毒分为低毒力型（即缓发型）、中等毒力型（即中发型）、强毒カ型（即速发型）3型，现在普遍采用疫苗接种的形式来预防该类传染病，目前，我国最常用的疫苗有鸡新城疫I、II、L(Lasota)系活疫苗和油乳灭活疫苗，可以防治一般性的新城疫病毒感染，但是由于病毒的多祥性，往往新变异病毒的出现会导致疫情的大面积发生，给禽类养殖带来沉重的打击。
[0003] 山东某父母代肉种鸡场：发病周龄为31周，正处于产蛋高峰期，产蛋率为80%左右，临床上突然出现轻微的呼吸道症状，首先在ー栋鸡舍发生产蛋下降，8天后产蛋率从80%下降到24%，采食时间明显延长，10-14天后产蛋开始缓慢回升。此后，相邻的几栋鸡舍相继发病。剖检可见喉头粘液增多，喉头、气管出血严重，心、肝、脾、肺正常；个别肾肿；卵巢以及卵泡病变不明显；肠道有点状出血。取发病前后的鸡血清进行抗体检测，同时取发病鸡的脑、输卵管和气管进行病原分离。未发病前：ND的平均抗体水平为28 5，高低相差5 ；发病初期H9的平均抗体水平为28.7，高低相差4 ;发病10天后：发病栏ND抗体飙升至212以上，发病栏中的6个抽检样品中：2个215，2个217，I个218，I个213。而在整个发病前后，该鸡群的H9抗体水平无明显变化，据此可断定：该鸡场为NDV强毒感染；同时自2001年3月底至5月份，该公司不同种鸡场（相隔20公里以上）饲养的三批种鸡均连续在产蛋高峰期发病，症状一致类似的病例在天津、北京、河南、江苏、河北、山东省不同地区如东营、济宁、临沂、德州、济南、枣庄等发生。
[0004] 可见该致病性毒株与传统的疫苗毒株（La Sota株及Clone30株）在基因分型及抗原性上均产生了较大的差异，使得传统疫苗株已不能产生有效的保护，为了能够更好的认知该毒株及其致病性，必须对其进行进一歩的分离及研究。
[0005] 本发明的发明人从上述的发病鸡群中分尚到一株病毒，代号为SDMOl株并提供了其分离制备方法，发明人对该毒株进行了生物保藏，保藏编号CCTCC NO ：V201109 ;通过SPF鸡胚传代，进行了生物学特性试验如血凝性、血清中和试验、动物回归试验和外源病毒检查，试验结果证实该病毒为新城疫病毒。通过鸡胚平均死亡时间（MDT)U日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI)測定、6周龄鸡静脉内接种致病指数（IVPI)測定，证实该新城疫病毒为强毒力毒株。通过对分离毒株及标准毒株制备阳性血清，进行HI交叉中和试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验、F和HN基因序列测序比较及免疫攻毒保护试验，结果证实新城疫SDMOl株与传统的疫苗毒株（La Sota株及Clone30株）在基因分型及抗原性上均产生了较大的差异，SDMOl株对目前流行株具有较好的保护效果，是较佳的候选疫苗毒株。
[0006] 发明人对该病毒毒株进行了生物保藏，于2011年3月保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO ：V201109o
[0007] 在本发明中，发明人对该病毒毒 株进行了进ー步的研究，发现其具有如下的特征：
[0008] (I)发病鸡除呼吸道症状外，大部分鸡均有腺胃出血、十二指肠出血、泄殖腔出血、气管出血或粘液增多等病变，用10日龄SPF鸡胚接种病毒，可见24-72小时死亡的鸡胚均有充血或出血，肝脏有坏死和出血点；
[0009] (2)病毒分离物对I %鸡红细胞产生凝集；
[0010] (3) SPF鸡回归试验可出现呼吸道症状、腺胃出血、肠道枣核样出血、盲肠扁桃体出血及泄殖腔出血等新城疫典型病变；
[0011] (4)外源病毒检查发现，病毒分离物免疫SPF鸡的血清只呈现ND抗体呈阳性反应，而其它鸡十八种疾病均为抗体阴性反应；
[0012] (5) SDMOl株病毒的F和HN基因均扩增出目的片段。经双向测序、拼接和校正后，F基因开放阅读框架（ORF)全长1，662bp，编码553个氨基酸，基因序列如Seq ID No ：1所示，其所编码的氨基酸序列如Seq ID No ：3所示；HN基因ORF全长1，716bp，编码571个氨基酸，基因序列如Seq ID No :2所不,其所编码的氣基酸序列如Seq ID No:4所不。
[0013] 发明人还提供了该病毒的分离鉴定方法如下：
[0014] 病毒的分尚培养
[0015] 无菌采集发病鸡的气管、脑、输卵管和肝脏，称重后分别按I : 3加入灭菌生理盐水，匀浆后经超声波处理，以3000r/min离心15min，取上清加青（链）霉素双抗至2000IU/ml，置4°C冰箱过夜，无菌检验合格后，分别接种5个10日龄SPF鸡胚，每胚0. 2ml。弃去24小时内死亡的鸡胚，此后每6-8小时照蛋I次，及时将死亡鸡胚取出，置2-8V冷藏，至96小时取出所有鸡胚，无菌收取鸡胚尿囊液，留样检测后将含有病毒的鸡胚尿囊液置_70°C保存备用。
[0016] 为了对该病毒进行准确的鉴定，发明人进行了如下的鉴定试验方式：
[0017] I.红细胞凝集试验（HA)
[0018] 病毒分离物对I %鸡红细胞发生凝集反应，HA为29，即病毒的凝集效价为29。
[0019] 2.红细胞凝集抑制试验（HI)
[0020] 病毒分离物与特异性新城疫、禽流感H9和AIV H5亚型、减蛋综合症（EDS)等病毒单因子阳性血清进行HI交叉抑制试验，进行初歩鉴别诊断。结果病毒分离物只与新城疫特异性阳性血清出现阳性反应，证实该病毒分离物应为新城疫病毒。
[0021] 3.动物回归试验
[0022] 取40日龄SPF鸡10只，用点眼、滴鼻途径，每只鸡接种SDMOl株鸡胚尿囊液0. 2ml,观察14天。被接种的10只SPF鸡，在48小时左右开始出现呼吸道症状，96小时内全部死亡，剖检出现典型的新城疫症状：气管出血、十二指肠、泄殖腔粘膜、盲肠扁桃体等出血。
[0023] 4.外源病毒检查
[0024] 4周龄SPF鸡10只，用SDMOl株制备灭活疫苗免疫，免疫I周和2周后加强免疫I次，同时设相同日龄SPF鸡对照5只，最后I次免疫3周采血。进行有关疫病的血清抗体检验，检验项目有传染性法氏囊病（IBD)、禽腺病毒I型（Adeno)、减蛋综合征（EDS)、禽脑脊髄炎（AE)、禽流感（AI)H9亚型、禽流感（AI)H5亚型、禽呼肠孤（REO)、鸡痘（FP)、传染性喉气管炎（ILT)、鸡传染性支气管炎（IB)、禽白血病（AL)、鸡马立克氏病（MD)、鸡新城疫（ND)、网状内皮增生症（RE)。结果免疫鸡只新城疫抗体阳性，其它均为阴性，证实病毒分离物中只含有新城疫病毒。
[0025] 5.生物学毒カ检测
[0026] 按照OIE方法，利用蚀斑纯化后的 病毒分别进行鸡胚最小致死量（MDT)、I日龄雏鸡脑内致死指数（ICPI)和6周龄静脉接种指数（IVPI)检测，结果：MDT为50. 5小吋，ICPI和IVPI分别为I. 76和2. 41，表明为分离到的SDMOl株为强毒。
[0027] 6. F和HN基因测序
[0028] SDMOl株的F和HN基因均扩增出目的片段。经双向测序、拼接和校正后F基因开放阅读框架（ORF)全长1，662bp，编码553个氨基酸，基因序列如Seq ID No : I所示；HN基因ORF全长l，716bp，编码571个氨基酸，基因序列如Seq ID No :2所示。
[0029] 按照传统方法进行F基因分型，SDMOl为基因VII型，而LaSota为基因II型。
[0030] 综合上述鉴定结果，发明人可以确定该新毒株为ー株新城疫病毒的强毒株。
[0031] 发明人进ー步的将该毒株与其它新城疫分离株抗原性比较、鸡胚中和交叉抗原同源性比较以及细胞交叉中和的抗原同源性比较，发现由其他新城疫分离株获得的传统疫苗对目前流行株的交叉保护能力较弱，相比之下，SDMOl对多数分离株具有较高的交叉保护能力。
[0032] 发明人还进行了现在常用的LaSota免疫对本发明所述的流行株SDMOl进行了攻毒保护效果研究，结果发现传统的疫苗毒对SDMOl存在着抗原性方面的差异，不能提供有效的保护。因此必须提供新的疫苗株。
[0033] 综上所述，本发明提供的鸡新城疫病毒（NDV) SDMOl毒株通过SPF鸡胚传代，进行了生物学特性试验如血凝性、血清中和试验、动物回归试验和外源病毒检查，试验结果证实该病毒为新城疫病毒。通过鸡胚平均死亡时间（MDT)U日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI)測定、6周龄鸡静脉内接种致病指数（IVPI)測定，证实该新城疫病毒为强毒力毒株。通过对分离毒株及标准毒株制备阳性血清，进行HI交叉中和试验、鸡胚中和试验、细胞中和试验、F和HN基因序列测序比较及免疫攻毒保护试验，结果证实新城疫SDMOl株与传统的疫苗毒株（La Sota株及Clone30株）在基因分型及抗原性上均产生了较大的差异。
[0034] 发明人对本发明所公开的鸡新城疫病毒（NDV)毒株SDMOl进行了生物保藏，具体保藏信息如下：
[0035] 保藏信息
[0036] 保藏时间：日
[0037] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC
[0038]保藏编号：CCTCC NO ：V201109
[0039] 保藏单位地址：武汉大学
[0040] 分类命名：副粘病毒科SDMOl病毒具体实施方式
[0041] 实施例I病毒的分离培养：
[0042] 无菌采集发病鸡的气管、脑、输卵管和肝脏，称重后分别按I : 3的重量比加入灭菌生理盐水，勻衆后经超声波处理，以3000r/min离心15min,取上清加青（链）霉素双抗至2000IU/ml，置4°C冰箱过夜，无菌检验合格后，分别接种5个10日龄SPF鸡胚，每胚0. 2ml。弃去24小时内死亡的鸡胚，此后每6-8小时照蛋I次，及时将死亡鸡胚取出，置2-8V冷藏，至96小时取出所有鸡胚，无菌收取鸡胚尿囊液，留样检测后病毒分离物即可置-70°C保存备用。
[0043] 实施例2病毒的鉴定：
[0044] I.红细胞凝集试验（HA)
[0045] 病毒分离物对I %鸡红细胞发生凝集反应，HA为29，即病毒的凝集效价为29。
[0046] 2.红细胞凝集抑制试验（HI)
[0047] 病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即红细胞凝集抑制试验（HI)，具有特异性。病毒分离物与特异性新城疫、禽流感H9和AIV H5亚型、减蛋综合症(EDS)等病毒单因子阳性血清进行HI交叉抑制试验，进行初歩鉴别诊断。具体方法：根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝単位的病毒液；在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第I孔至第11孔各加25微升生理盐水；第I孔加相应血清25微升，吹吸混合均匀，吸25微升至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃25微升；第12孔加新城疫阳性血清25微升，作为血清对照；自第I孔至12孔各加25微升4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用IO自第I孔至12孔各加1%鸡红细胞悬液25微升，振荡混合均匀，室温下静置后观察結果。待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++)，而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（_)吋，即可进行结果观察。以100%抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。
[0048] 结果病毒分离物只与新城疫特异性阳性血清出现阳性反应，证实该病毒分离物应为新城疫病毒。
[o动物回归试验
[0050] 取40日龄SPF鸡10只，用点眼、滴鼻途径，每只鸡接种SDMOl株鸡胚尿囊液0. 2ml,观察14天。被接种的10只SPF鸡，在48小时左右开始出现呼吸道症状，96小时内全部死亡，剖检出现典型的新城疫症状：气管出血、十二指肠、泄殖腔粘膜、盲肠扁桃体等出血。
[0051] 4.外源病毒检查
[0052] 4周龄SPF鸡10只，用SDMOl株制备灭活疫苗免疫，免疫I周和2周后加强免疫I次，同时设相同日龄SPF鸡对照5只，最后I次免疫3周采血。进行有关疫病的血清抗体检验，检验项目有传染性法氏囊病（IBD)、禽腺病毒I型（Adeno)、减蛋综合征（EDS)、禽脑脊髄炎（AE)、禽流感（AI)H9亚型、禽流感（AI)H5亚型、禽呼肠孤（REO)、鸡痘（FP)、传染性喉气管炎（ILT)、鸡传染性支气管炎（IB)、禽白血病（AL)、鸡马立克氏病（MD)、鸡新城疫（ND)、网状内皮增生症（RE)。结果免疫鸡只新城疫抗体阳性，其它均为阴性，证实病毒分离物中只含有新城疫病毒。[0053] 5.生物学毒カ检测
[0054] 按照OIE方法，利用细胞蚀斑纯化后的病毒分别进行鸡胚最小致死量（MDT)、1日龄雏鸡脑内致死指数（ICPI)和6周龄静脉接种指数（IVPI)检测，这是评价NDV毒力致病性的3个指标：MDT —般小于60小时的为速发型，在60?90小时为中发型，大于90小时的为缓发型；ICPI —般大于I. 6为速发型，I. 2?I. 6为中发型，小于I. 2为缓发型；IVPI —般2. 0以上为速发型，2. 0以下为速发型或缓发型。
[0055] 本病毒检测结果=MDT为50. 5小时， ICPI和IVPI分别为I. 76和2. 41，表明为分离到的SDMOl株为强毒。
[0056] 6. F和HN基因测序及鉴定
[0057] SDMOl株的F和HN基因均扩增出目的片段。经双向测序、拼接和校正后F基因开放阅读框架（ORF)全长1，662bp，编码553个氨基酸，基因序列如Seq ID No : I所示；HN基因ORF全长l，716bp，编码571个氨基酸，基因序列如Seq ID No :2所示。
[0058] 按照传统方法进行F基因分型，SDMOl为基因VII型，而LaSota为基因II型。
[0059] 实施例3 SDMOl株与其它新城疫分离株抗原性比较
[0060] I. HI同源性比较
[0061] 单因子阳性血清制备，按照国家SPF鸡微生物监测方法，将制备的20株NDV抗原和阳性血清分别进行交叉HI实验，取5次检测值的平均。同时设：SPF鸡阴性血清、新城疫阳性血清对照和病毒对照。HI抗原同源性的计算按免疫学方法进行：R=V^" xiG()%，rl=异源血清效价I/同源血清效价1，r2 =异源血清效价2/同源血清效价2，结果如表I。
[0062] La Sota与Clone30和F48E9的抗原同源性最高，分别为0. 97和0. 98，与17个分离株的抗原同源性为0. 70?0. 97，大多数介于0. 85?0. 90。其中，23. 5%的NDV野毒与F48E9和La Sota间的同源性在0. 9以上，但52. 9%的NDV野毒与La Sota和F48E9的同源性已降至0. 70?0. 85，而且，即使同属于基因VII型的不同毒株间抗原的同源性也变化在 0. 79-1. 0 间。
[0063] 表I. NDV不同毒株间HI同源性
[0064]La Clone F^8K9 UTizO.S Tj03 .TSOI JS02 SDDOI SDMOI YG SCTfl^ SQD04 SQ7.04 QF.01 SSXO^ SKYO.^ SR7.03 T.T05 SPYO.^ SWS La I .00
Clone 0.97 1.00 F48E9 0.98 0.96 1.00
Whz03 0.83 0.80 0.73 1.00 Tj03 0.97 0.94 0.96 0.91 1.00 JSOi 0.88 0.85 0.86 0.90 0.95 LGO JS02 0.86 0.84 0.80 0.91 0.88 0.89 1.00 SDDOi 0.85 0.80 0.78 0.88 0.93 0.87 0.91 LOG SDMOi 0.89 0.86 0.88 0.93 0.93 0.96 0.88 0.94 1.00 YG 0.86 0.85 0.90 0.89 0.92 1.02 0.98 0.95 0.91 LOG
SCL03 0.95 0.89 0.85 0.87 0.92 0.89 0.88 0.84 0.87 0.90 1.00
SQD04 0.93 0.93 0.85 0.84 0.92 0.87 0.88 0.93 0.88 0.90 0.89 LOO
SQZ04 0.83 0.79 0.82 0.96 1.02 0.89 0.96 1.00 0.94 0.89 0.84 0.94 LOG
QEOi 0.85 0.89 0.82 0.87 0.92 0.96 0.93 0.97 0.92 1.03 0.96 0.91 0.96 1.00
ssxo3 0.9フ 0.95 0.91 0.88 0.95 0.95 0.87 0.89 1.07 0.99 0.91 0.97 1.01 0.94 1.00
SKY03 0.86 0.86 0.78 0.96 0.85 0.94 0.93 0.91 0.84 0.98 0.89 0.97 0.98 0.85 0.92 1.00
SRZ03 0.81 0.78 0.70 0.88 0.88 0.99 1.01 1.00 0.92 0.85 0.85 0.96 0.98 0.85 0.82 0.80 1.00
TJ05 0.87 0.85 0.81 0.93 0.88 0.93 0.90 0.91 0.86 0.98 0.85 0.98 1.00 0.86 0.90 0.97 0.85 1.00
SPY03 0.92 0.91 0.86 0.79 0.96 0.92 0.91 0.86 0.92 0.95 0.95 0.89 0.87 0.92 0.96 0.84 0.88 0.82 1.00
swsos 0.82 0.81 0.77 0.88 0.94 0.91 0.95 0.96 0.95 0.89 0.86 0.88 1.00 0.95 0.86 0.8フ 0.98 0.86 0.92 1.00
[0066] 2.鸡胚中和交叉抗原同源性比较
[0067] 分别测定NDV毒株鸡胚半数感染量（EID5tl)，采用固定病毒稀释血清法，能使半数
鸡胚保护的最高血清稀释度即为该血清的中和效价，HI抗原同源性的计算按免疫学方法进
行：R=V^" Xi00 %，巧=异源血清效价ノ同源血清效价17 r2 =异源血清效价J同源血
[0068] 传统的La Sota、Clone30和传统的F48E9强毒之间相关程度较高（大于0. 6)，显示
出较高的交叉保护能力，而与分离株相关程度不一，普偏低于0.5。其中，La
的中和同源性在0. 77，15%的NDV强毒与F48E9和La Sota间的同源性在0. 5以上，85%的
NDV强毒与La Sota和F48E9的同源性已降至0. 15?0. 5。
[0069] 表2NDV不同毒株间鸡胚中和 交叉抗原同源性
[0071 ] 3.细胞交叉中和的抗原同源性比较
[0072] 表3细胞交叉中和的抗原同源性
[0074] 上表结果表明：La Sota、Clone30和传统的F48E9-毒之间相关程度较高，而NDV分离株之间，有的相关程度较高，有的较低，反应出NDV的复杂性，但普遍与传统的疫苗株LaSota、Clone30有一定的差异。其中，F48E9与La Sota之间中和同源性在0. 63，34%的NDV强毒与F48E9和La Sota间的同源性在0. 5以上，但66%的NDV强毒与La Sota和F48E9的同源性已降至0. 17?0. 46，说明传统疫苗株对2/3的流行株的中和能力较低，已不能对流行株产生有效保护。4. LaSota免疫对流行株的攻毒保护效果研究
[0075] 用LaSota活疫苗免疫3周鸡群21日后，分别用5个流行株NDV及F48E9进行肌肉途径攻毒，观察14日。所有攻NDV分离株强毒和经典强毒F48E9未免疫SPF鸡全部发病，96h内死亡率均为100%，剖检为新城疫典型病变；疫苗对3组流行毒和经典强毒F48E9产生了较好的保护，说明传统的LaSota活疫苗对流行的强毒仍具有较好的交叉保护。但是，有2组免疫鸡发病。其中，C组攻SKY03毒的免疫鸡在120小时死亡I只，另有3只精神差，A组SDMOl攻毒在168?216小时有5只出现发病症状。这说明传统的疫苗毒对SDMOl、SKY03可能存在着抗原性方面的差异，不能提供有效的保护。
[0076] 表4流行株攻毒后鸡群发病情况
[0079] 注：*分子表示发病鸡数量,分母表示实验鸡数。
[0080] 5. LaSota和SDMOl株与其它NDV分离毒株F基因同源率比较
[0081] 从Genebank下载经典NDV毒株的F基因序列，对分离毒株进行F基因克隆测序，推导氨基酸全长，进行同源率比较，结果见表4。NDV相同基因型的毒株氨基酸同源率相对较高。比较发现：LaSota、SBZ02、QE01、JS05、SQZ04、SY03和Taxas48等基因ニ型之间高度同源，氨基酸同源率为 93. 1%~ 99. 6% ;SDD01、JS01、JS02、SCL03、SPY03、Taiwan95、SDM01和 SKY03 等基因 VII 型的同源率为 95. 5% -98. 7% ;F48E9、JS06、SBD02、TJ03、JS701 等基因IX之间的同源率为：98. 7%?99. 6%。
[0082] 不同的基因型分离株氨基酸同源率相差较大，LaSota与基因VII型分离毒间同源率为88. 1% -89. 2%，远低于SDMOl株与基因VII型分离毒间同源率95. 7% -98. 7%。
[0083] 表5不同基因型代表毒株的F基因氨基酸全长与LaSota和SDMOl的同源率
[0086] 实施例4疫苗的制备方法
[0087] 将SDMOl株用灭菌生理盐水1000倍稀释后，经尿囊腔途径接种10?11日龄SPF鸡胚，每胚0. 1ml，置37°C培养，弃去24h内死亡的鸡胚，及时照蛋随时将死亡的鸡胚取出冷藏，收获72小时内死亡及获鸡胚尿囊液，加入鸡胚尿囊液总体积0. 1%的甲醛，充分摇匀后于37°C灭活16h，然后按水相体积的4?6%加入吐温-80，按水与油相I : 3的比例加入兽用注射白油中，胶体磨高速乳化5?7min，乳化結束前加入终浓度为0. 001 %的硫柳汞即可。
*天津市华泰森淼生物工程技术有限公司鸡新城疫－禽流感二联乳剂疫苗的制备方法 *扬州大学基因vii型新城疫病毒致弱株a-ndv-vii及其构建方法 *乾元浩生物股份有限公司一种鸡新城疫-禽流感二联油乳剂灭活疫苗及其制备方法 *哈药集团生物疫苗有限公司一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法 *Michel BublotNewcastle disease virus vectored avian vaccines1 *李玉和等: "", 《中国家禽》, vol. 32, no. 17, 31 December -12-31), pages 64 - 652 *葛金英等: "", 《微生物学报》, vol. 46, no. 4, 4 August -08-04), pages 547 - 551International Classification, , , C06PublicationC10Entry into substantive examinationC14Grant of patent or utility modelRotate