wb可以直接用hrp标记抗体hrp的抗体吗

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【求助】WB中HRP为什么要标记在二抗上,而不是一抗上?
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这个帖子发布于8年零50天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
如题,Western Blotting中,标记的酶(如HRP)为什么要标记在二抗上,而不是一抗上?
不知道邀请谁?试试他们
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一抗种类繁多,一一标记太麻烦,较难掌握,且敏感性低;而标记二抗敏感性高,应用范围广,可避免标记一抗致使活性下降
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这种解释是建立在二抗的Fab与一抗的Fc特异性结合,这样似乎所有抗原检测中,只需要一种二抗就可以了,可商业化的二抗种类很多呀,这又如何解释?请达人指教!谢谢!
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从抗体公司的二抗目录上看,可以这样理解:即一抗的Fc与其来源和种类有关,二抗的标记方式也有不同。不知是否如此?
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我的理解可能有以下几个原因:1、特异性:一抗一般虽然是单抗,但其实来源于小鼠腹水的单抗(检测试剂用的抗体用CHO培养的应该很少,成本问题),并不是完全单一的针对目标抗原的同种抗体。如果没有经过抗原柱特异性的纯化,这种一抗实际上含有小鼠自身的抗体,比例还不低(对IgG型单抗,我的经验是特异性抗体含量大约为50%)。如果直接用一抗接酶检测,本底可能比较高,在WB上背景较深。而通过一次一抗的搭桥,二抗酶检测,实际上是将检测的阀值抬高了,相应的使得本底降低。这时方法学的问题。2、通用性:没有接酶的一抗不仅可以在WB上应用,还可以用在不同类型的Elisa检测上,用在光免检测,用在生化检测,用在金标检测等等各种检测手段或其它方面上。接酶后的一抗应用范围大大缩小。3、生产便利性:一抗是个特异性的试剂,应用的对象单一,量就较小,再用接酶来限制使用的话,试剂公司销售成问题了。而二抗是个通用性的试剂,针对面广,一次可以大量生产的。一抗的成本高,二抗的成本低。所以要保证高成本的一抗活性好,防止在酶标记过程中活性下降,灵敏度降低。4、二抗种类问题:也许对WB而言只要有一种类型的二抗就可以了,但二抗的使用范围可不只是WB啊。例如,在一种Elisa检测抗原当中,模式为(捕获抗体-抗原-一抗-二抗酶),包被用捕获抗体的动物类型就不可以与二抗的动物类型相同,甚至接近都不可以,否则可能引起假阳性问题,这就有对不同种属二抗的需求。应该还有其他很多很多原因的。
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谢谢,说的很有道理!
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这个是专门标记一抗的方法,供参考
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