EPITOPE VACCINE FOR LOW IMMUNOGENIC PROTEIN AND PREPARING METHOD AND USAGE THEREOF
WIPO Patent Application WO/
The present invention provides recombinant protein carrying an epitope. The recombinant protein has a skeleton structure from carrier protein, and a low immunogenic protein epitope is imported through splicing, replacement, and/or insertion to at least one molecular surface animo acid residue area of the carrier protein. The carrier protein has at least one T cell epitope, and the recombinant protein can effectively excite immunoreaction of an organism to the low immunogenic protein epitope.
Inventors:
LI, Rongxiu (Flat 5-518, 458 Fu Te East 1st Road China Pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai 1, 200131, CN)
ZHANG, Li (Flat 5-518, 458 Fu Te East 1st Road China Pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai 1, 200131, CN)
ZHONG, Conghao (Flat 5-518, 458 Fu Te East 1st Road China Pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai 1, 200131, CN)
CHENG, Chao (Flat 5-518, 458 Fu Te East 1st Road China Pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai 1, 200131, CN)
XU, Aizhang (Flat 5-518, 458 Fu Te East 1st Road China Pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai 1, 200131, CN)
LU, Wuguang (Flat 5-518, 458 Fu Te East 1st Road China Pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai 1, 200131, CN)
Application Number:
Publication Date:
11/20/2014
Filing Date:
05/14/2014
Export Citation:
SHANGHAI HYCHARM INC, (Flat 5-518, 458 Fu Te East 1st Road China Pilot Free Trade Zone, Pudong New Area, Shanghai 1, 200131, CN)
International Classes:
C07K19/00; A61K39/385; A61P37/02; C12N1/00; C12N15/62; C12N15/63
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Domestic Patent References:
Foreign References:
CNACNBCNACN1690080A
Other References:
NICHOLAS JOHNSON ET AL.: "Construction of an Epitope Vector Utilising the Diphtheria Toxin B-Subunit", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 146, 31 January -01-31), XP
See also references of EP
LE BUANEC H ET AL.: "TNF alpha kinoid vaccination-induced neutralizing antibodies to TNF alpha protect mice from autologous TNF alpha-driven chronic and acute inflammation", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 103, no. 51, 2006, pages 19442 - 7, XP, DOI: doi:10.1073/pnas.
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 1991, MACK PUB. CO.
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
Attorney, Agent or Firm:
XU & PARTNERS, LLC. (Room No.106, Building No.1 Universal High-Tech Plaza,958 Zhen Bei Road, Putuo District, Shanghai 3, 200333, CN)
权 利 要 求 书
1. 一种携带抗原表位的重组蛋白， 其特征在于， 所述重组蛋白具有源自载体蛋白的 结构骨架， 并且所述载体蛋白具有至少一个 T细胞表位， 并且在所述载体蛋白的至少一个 分子表面氨基酸残基区通过拼接、 替换、 和 /或插入而引入所述的抗原表位。
2. 如权利要求 1所述的重组蛋白， 其特征在于， 所述抗原表位是低免疫原性蛋白的 表位， 优选地所述的低免疫原性蛋白包括人和非人哺乳动物的蛋白。
3. 如权利要求 1所述的重组蛋白， 其特征在于， 所述的载体蛋白是病原体蛋白， 包 括病毒蛋白、 细菌蛋白、 衣原体蛋白、 支原体蛋白、 非人动物蛋白或其组合。
4. 如权利要求 2所述的重组蛋白， 其特征在于， 所述的低免疫原性蛋白选自下组： VEGF、 TNF-o Her2蛋白、 凝血因子、 白细胞介素、 成纤维细胞活化蛋白、 EGFR、 PDL1或其组合。
5. 如权利要求 1所述的重组蛋白， 其特征在于， 所述的分子表面氨基酸残基区包括 载体蛋白的 C末端， 和 /或所述的分子表面氨基酸残基区包括载体蛋白的 N末端。
6. 如权利要求 1所述的重组蛋白， 其特征在于， 所述的载体蛋白为白喉毒素的跨膜 结构域 (简称 DTT)。
7. 如权利要求 6所述的重组蛋白，其特征在于，所述的分子表面氨基酸残基区在 DTT 上的 287-299位氨基酸之间或 DTT的 C末端或 N末端，
优选地， 所述分子表面氨基酸残基区选自下组： DTT上的 290-297位氨基酸、 DTT上 的 291-297位氨基酸、 DTT上的 292-297位氨基酸、 293-297位氨基酸、 294-297位氨基酸、 DTT上的 295-297位氨基酸和 DTT上的 296-297位氨基酸。
8. 一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求 1所述的重组蛋白。 9. 一种表达载体， 其特征在于， 所述表达载体含有权利要求 8所述的多核苷酸。 10. 一种宿主细胞， 其特征在于， 所述的宿主细胞含有权利要求 9所述的表达载 体， 或者在基因组中整合有权利要求 8所述的多核苷酸。
11. 一种药物组合物， 其特征在于， 所述的组合物含有权利要求 1所述的重组蛋 白、权利要求 8所述的多核苷酸或者权利要求 9所述的表达载体或者权利要求 10所述的 宿主细胞， 以及药学上可接受的载体和 /或辅料。
12. 如权利要求 1 1所述的药物组合物， 其特征在于， 所述的组合物为疫苗。 13. 一种疫苗组合物， 其特征在于， 所述的组合物含有权利要求 1所述的重组蛋 白、权利要求 8所述的多核苷酸或者权利要求 9所述的表达载体或者权利要求 10所述的 宿主细胞， 以及免疫学上可接受的载体和 /或辅料。
14. 如权利要求 1所述的携带抗原表位的重组蛋白的用途， 其特征在于，
(a)用于制备针对所述抗原表位的抗体； 和 /或
(b)用于制备治疗与所述抗原表位相关的疾病的药物。
15. 一种抗原表位肽， 所述抗原表位肽源自哺乳动物 (如人)的低免疫原性蛋白且 包含一个或多个抗原表位，
并且所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的 5-100%， 且所述抗原表位肽的长度为 5-500个氨基酸；
并且所述抗原表位肽与本发明载体蛋白形成的重组蛋白可诱发同一种类的所述 哺乳动物产生针对该低免疫原性蛋白的免疫反应。
16.—种治疗方法， 给需要的对象施用权利要求 1所述的重组蛋白、 权利要求 1 1 所述的药物组合物或权利要求 13所述的疫苗组合物。
Description:
针对低免疫原性蛋白的表位疫苗及其制法和用途
本发明属于生物和医药领域， 具体地涉及针对低免疫原性蛋白的表位抗原的疫 苗及其制法和用途。本发明可有效激发机体针对低免疫原性蛋白的特定表位产生免疫 反应。 背景技术
慢性病包括心脑血管疾病和癌症， 随着经济发展和生活营养水平的持续提高， 其 发病率和死亡率快速升高， 成为人类致病、 致死主要原因； 利用单克隆抗体药物治疗 的优点是靶点明确， 疗效确切， 但需要用药剂量大、 重复次数多治疗成本高。
预防用疫苗作为控制传染性疾病及其并发症的重要手段已经挽救了数亿人的生 命、 对人类健康做出了重大贡献； 传统上的疫苗的抗原源自病原体， 对人类机体来讲 是外源物质自然能够激发人体的免疫保护反应。而慢性病的病因和治疗干预靶点是自 身物质， 如果也能够设计疫苗通过主动免疫， 激发机体产生免疫反应， 产生与单克隆 抗体药物具有相似治疗效果的自身抗体是一条非常具有吸引力的治疗途径； 具有疗 效持续时间长， 治疗成本低， 用药既方便又经济， 还具有预防发病的潜力。
但是， 由于机体存在对自身物质具有免疫耐受的保护机制， 正常的健康状态下， 机体不会产生针对自身物质的免疫反应。 目前 Le Buanec 等人和法国 NeoVacs 公司 (http : //neovacs. fr/) , 将用戊二醛将几十个人蛋白（包括多种细胞因子、 生长因子） 与铜蓝蛋白（the keyhole l impet hemocyanin , KLH)偶联后， 再用甲醛长时间处理杀 灭人蛋白分子的生物活性， 制备了 kinoid 抗原疫苗； KLH 偶联 TNF-oc 制备的 TNFK 抗原在小鼠炎症模型中具有治疗作用，临床试验证明在人体中能够成功诱导免疫反应 [Le Buanec H, et al . TNFalpha kinoid vaccination-induced neutral iz ing ant ibodies to TNF alpha protect mi ce from autologous TNFalpha-driven chronic and acute inflammation. Proc Natl Acad Sci USA 2006 ; 103 (51) : 19442-7]。 虽然， 这种疫苗的有效性得到了部分验证， 但是这种几十个人蛋白分子与 KLH分子偶联、 再 加上甲醛长时间处理形成的复杂的凝絮物质， 在满足临床药品要求的成份清楚、 结构 明确、 质量可控方面存在诸多的难度和难以说明的安全风险。
因此， 本领域迫切需要开发能够有效激发机体产生针对低免疫原性蛋白的免疫 应答的疫苗抗原技术， 同时满足临床药品成份清楚、 结构明确、 质量可控的要求。 发明内容
本发明的目的就是提供一种可有效激发机体产生针对低免疫原性蛋白的免疫应 答的方法以及相关的重组蛋白和组合物（如疫苗组合物）。 在本发明的第一方面，提供一种携带抗原表位的重组蛋白，所述重组蛋白具有源自 载体蛋白的结构骨架， 并且所述载体蛋白具有至少一个 T细胞表位， 并且在所述载体蛋白 的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、 替换、 和 /或插入而引入所述的抗原表位。
在另一优选例中， 所述 "分子表面氨基酸残基区"包括 loop区、 beta-tum区、 N末端 或 C末端。
在一优选例中， 所述重组蛋白诱导产生针对所述抗原表位的免疫应答。
在另一优选例中， 所述抗原表位是 B细胞表位或 T细胞表位。
在另一优选例中， 所述的载体蛋白是病原体蛋白， 包括病毒蛋白、 细菌蛋白、 衣原 体蛋白、 支原体蛋白、 或其组合。
在另一优选例中， 所述的抗原不来自所述载体蛋白。
在另一优选例中， 所述的抗原表位是来源于哺乳动物蛋白。
在另一优选例中， 所述的抗原表位选自下组：
(a) 单表位的抗原表位； 较佳地， 所述的单表位的抗原表位 (肽)的长度为 5-30个， 较 佳地 6-15个氨基酸； 或
(b) 多表位的抗原表位； 较佳地， 所述的多表位的抗原表位 (肽)的长度为 15-500个， 较佳地 20-300个， 更佳地 30-200个氨基酸。
在另一优选例中，在所述的载体蛋白的 C或 N末端引入所述的多表位的抗原表位 (肽)。 在另一优选例中， 当所述的重组蛋白被施用于人时， 诱导人产生针对所述抗原表位 的免疫应答。
在另一优选例中， 所述的替换包括部分替换或全部替换所述载体蛋白的所述表 面氨基酸残基区的氨基酸序列。
在另一优选例中， 所述的部分替换包括替换所述载体蛋白的表面氨基酸残基区序列 中的 1 - 15个氨基酸， 较佳地 2- 10个氨基酸。
在另一优选例中， 所述抗原表位是低免疫原性蛋白的表位。 优选地所述的低免 疫原性蛋白包括人和非人哺乳动物的蛋白。
在另一优选例中， 所述的低免疫原性蛋白包括： 自身免疫疾病相关蛋白、 肿瘤 相关蛋白、 心血管疾病相关蛋白。
在另一优选例中， 所述的低免疫原性蛋白包括：
(a) VEGF、 TNF-o Her2蛋白、 凝血因子、 白细胞介素、 成纤维细胞活化蛋白 (Fibroblast Activation Protein , FAP)、 EGFR、 PDL 1或其组合；
(b) 将（a)中蛋白经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的并且 与载体蛋白重组后能够诱发针对该低免疫原性蛋白的免疫反应的蛋白。
在另一优选例中， 所述低免疫原性蛋白为 TNF-cx或者将 TNF-cx经过一个或多个氨 基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的并且与载体蛋白重组后能够诱发针对该 TNF-cx 的免疫反应的蛋白。
在另一优选例中，所述抗原表位源自 TNF-cx,且在 TNF-cx中具有两个点突变 A145R 禾口 Y87H。
在另一优选例中， 所述抗原表位源自 TNF-cx， 并且选自下组：
(l)SEQ ID ^<<). : 10或8?0 ID NO. : 12所示的氨基酸序列； (2)将 SEQ ID NO. : 10或 SEQ ID NO. : 12氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的 取代、 缺失或添加而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的衍生的多 肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位选自下组中的一个或多个：
(1) VSRFAISYQEKVNLLSA;
(2) LDFAESGQV;
(3) WLNRRANA;
(4) GMDLKDNQLVV;
(5) VSRFAISYQEKVNLLSAV;
(6) ISRIAVSYQTKVNLLSA;
(7) ISRIAVSYQTKVNLLSAI ; 禾口
(8) 其他 TNF-cx蛋白中与 (1 (7)表位序列对应的肽段。 在另一优选例中， 所述低免疫原性蛋白为凝血因子。
在另一优选例中， 所述凝血因子为 FXI。
在另一优选例中， 所述抗原表位选自下组中的一个或多个：
(1) FYGVESPK;
(2) QYKMAESGYDI ;
(3) WGYRKLRDKIQ;
(4) TNEECQKRYRGHKITH;
(5) ACIRDIF;
(6) TTKIKPRIVGGTASVRGE ； 禾口
(7) 其他 FXI蛋白中与（1)?（6)表位序列对应的肽段。
在另一优选例中， 所述抗原表位包括凝血因子为 FXI的催化结构域。
在另一优选例中， 所述 FXI的催化结构域选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. : 45氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID NO. : 45氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加 而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述凝血因子为 FXII。
在另一优选例中， 所述抗原表位选自下组中的一个或多个：
(1) EAFSPVSYQHDLA;
(2) EGFSSITYQHDLA; ； 禾口
(3) 其他 FXI I蛋白中与（1)、 （2)表位序列对应的肽段。
在另一优选例中， 所述抗原表位包括凝血因子为 FXII的催化结构域。
在另一优选例中， 所述 FXII的催化结构域选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. ： 129或 SEQ ID NO. ： 130氨基酸序列的多肽；
(b)将（a)中氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成 的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。 在另一优选例中，所述抗原表位肽源自 FAP，并且所述抗原表位肽包括 YGDEQYPR。 在另一优选例中， 所述低免疫原性蛋白为 FAP。
在另一优选例中， 所述抗原表位源自 FAP， 并且所述抗原表位包括 YGDEQYPR。 在另一优选例中， 所述抗原表位源自 FAP催化结构域。
在另一优选例中， 所述 FAP催化结构域选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. ： 108氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID NO. : 108氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述重组蛋白的氨基酸序列选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. : 50或 SEQ ID NO. : 51氨基酸序列的多肽；
(b)将（a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且具 有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位源自 VEGF。
在另一优选例中， 所述抗原表位选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. : 63氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID NO. : 63氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加 而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述重组蛋白的氨基酸序列选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. : 62氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID NO. ： 62氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加 而形成的， 且具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位源自 PDL1。
在另一优选例中， 所述抗原表位源自 PDL1E。
在另一优选例中， 所述抗原表位选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. : 67、 SEQ ID NO. : 68、 SEQ ID NO. : 122、 SEQ ID NO. : 123、 SEQ ID NO. : 124或 SEQ ID NO. : 125所示氨基酸序列的多肽；
(b)将（a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且与 载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述重组蛋白选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. : 69、 SEQ ID NO. : 70、 SEQ ID NO. : 126或 SEQ ID NO. : 127所 示氨基酸序列的多肽；
(b)将（a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且与 载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位源自表皮生长因子受体 EGFR。
在另一优选例中， 所述抗原表位源自表皮生长因子受体 EGFR的第 I I I亚区。
在另一优选例中，所述抗原表位源自表皮生长因子受体 EGFR,并且所述抗原表位肽 选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. : 83、 SEQ ID NO. : 109、 SEQ ID NO. : 110、 SEQ ID NO. : 111 所示氨基酸序列的多肽； (b)将（a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且与 载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述重组蛋白的所述抗原表位源自表皮生长因子受体 EGFR, 并 且包括 SEQ ID NO. : 83或 SEQ ID NO.： 109所示的氨基酸序列的至少一种， 和
SEQ ID NO. : 110和 SEQ ID NO. : 111中的至少一种。
在另一优选例中， 所述重组蛋白选自：
(a)具有 SEQ ID NO. : 84、 SEQ ID NO. : 85、 SEQ ID NO. : 86、 SEQ ID NO. : 87、 SEQ ID NO. : 119或 SEQ ID NO. : 120所示氨基酸序列的多肽；
(b)将（a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且与 载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。 在另一优选例中， 所述的抗原表位的长度为 5-40个氨基酸， 较佳地为 8-30个氨基 酸。
在另一优选例中， 所述的载体蛋白包括白喉毒素 DT、 白喉毒素的跨膜结构域 DTT、 轮状病毒 VP7、 利什曼原虫的热休克蛋白、 空肠弯曲菌鞭毛蛋白、 沙眼衣原体主要外膜 蛋白、 血蓝蛋白 (Keyhole Limpet Hemocyanin , KLH)、 牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin, BSA), 鸡卵白蛋白 (Ovalbumin, OVA), 纤维蛋白原、 多聚赖氨酸 (PLL；)。
在另一优选例中， 所述的表面氨基酸残基区在 DTT上的 287-299位氨基酸之间或 DTT 的 C末端或 N末端， 优选地所述表面氨基酸残基区选自下组： DTT上的 290-297位氨基酸、 DTT上的 291-297位氨基酸、 DTT上的 292-297位氨基酸、 293-297位氨基酸、 294-297位氨 基酸、 DTT上的 295-297位氨基酸、 DTT上的 296-297位氨基酸。
在另一优选例中， 所述表面氨基酸残基区选自下组： DTT上的 305-310位氨基酸和 295-310位氨基酸。
在另一优选例中， 在 1-5个 (较佳地 1-3个） 表面氨基酸残基区引入抗原表位。
在另一优选例中， 所述的表面氨基酸残基区包括载体蛋白的 C末端。
在另一优选例中， 所述的表面氨基酸残基区包括载体蛋白的 N末端。
在另一优选例中， 所述抗原表位连接于所述载体蛋白的 C末端和 /或 N末端。
在另一优选例中， 所述抗原表位和所述载体蛋白之间具有连接肽。 优选地， 所述连 接肽长度为 3-30个氨基酸。 更优选地， 所述连接肽长度为 4-20个氨基酸。 最优选地， 所述 连接肽长度为 5-10个氨基酸。
在另一优选例中， 所述抗原表位和所述载体蛋白之间不具有连接肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位替换所述载体蛋白的 C末端或 N末端的 1-50个氨基 酸。 优选地， 所述抗原表位替换所述载体蛋白的 C末端或 N末端的 5-30个氨基酸。 更优选 地， 所述抗原表位替换所述载体蛋白的 C末端或 N末端的 10-20个氨基酸。 在另一优选例中， 所述的载体蛋白为白喉毒素的跨膜结构域 DTT， 并且所述的可插 入抗原表位的表面氨基酸残基区包括：
白喉毒素跨膜结构域 （DTT ) 可植入抗原表位的表面氨基酸残基区
lFOL. pdb中氨基酸编号 lFOL. pdb中氨基酸序列 DTT-1 221-225 KEHGP DTT-2 230-241 MSESPNKTVSEE
DTT-3 255-261 LEHPELS
DTT-4 267-277 TGTNPVFAGAN
DTT-5 287-299 QVIDSETADNLEK
DTT-6 305-311 SILPGIG
DTT-7 317-325 ADGAVHHNT 本发明的第二方面， 提供一种多核苷酸， 所述的多核苷酸编码第一方面所述的 重组蛋白。 本发明的第三方面， 提供一种表达载体， 所述表达载体含有第四方面所述的多 核苷酸。
本发明的第四方面， 提供一种宿主细胞， 所述的宿主细胞含有第三方面所述的 表达载体， 或者在基因组中整合有第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中， 所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
在另一优选例中， 所述的宿主细胞包括大肠杆菌、 酵母、 CHO细胞、 DC细胞等。 本发明的第五方面， 提供一种药物组合物， 所述的组合物含有第一方面所述的 重组蛋白、第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述 的宿主细胞， 以及药学上可接受的载体和 /或辅料。
在另一优选例中， 所述的组合物为疫苗。 本发明的第六方面， 提供一种疫苗组合物， 所述的组合物含有第一方面所述的 重组蛋白、第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述 的宿主细胞， 以及免疫学上可接受的载体和 /或辅料。
在另一优选例中， 所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中， 所述疫苗组合物为核酸疫苗组合物， 所述核酸疫苗组合物中 包含第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体。
在另一优选例中， 所述的佐剂包括氧化铝、 皂苷、 quil A、 胞壁酰二肽、 矿物油 或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或 DEAE葡聚糖、 细胞因子 (包括 L- 1、 L- 2、 『 - r、 GM-CSF , !L-6 << L- 12、 if CpG)。 本发明的第七方面， 提供第一方面所述的携带抗原表位的重组蛋白的用途， （a) 用于制备针对所述抗原表位的抗体； 和 /或 (b)用于制备治疗与所述抗原表位相关的疾 病的药物。
在另一优选例中， 所述的疾病包括： 自身免疫疾病 (如类风湿关节炎)、 肿瘤、 心 血管疾病等。 本发明的第八方面， 提供一种治疗方法， 给需要的对象施用第一方面所述的重 组蛋白、 第四方面所述的药物组合物或第三方面的疫苗组合物。 本发明的第九方面， 提供一种抗原表位肽， 所述抗原表位肽源自哺乳动物 (如人) 的低免疫原性蛋白且包含一个或多个抗原表位，
并且所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的 5-100% (优选地， 所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的 5-70%； 更优选地， 所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的 5-50%； 最优选地， 所述抗原表位肽氨基酸序列长度为相应的低免疫原性蛋白全长的 5-30%, 如 10 %、 15 %、 20 %、 25 % ), 且所述抗原表位肽的长度为 5-500个氨基酸； 并且所述抗原表位肽与本发明载体蛋白形成的重组蛋白可诱发同一种类的所述 哺乳动物产生针对该低免疫原性蛋白的免疫反应。
优选地， 所述抗原表位肽氨基酸序列长度为 3-57。 更优选地， 所述抗原表位肽氨 基酸序列长度为 5-17。
在另一优选例中， 所述的低免疫原性蛋白包括： VEGF、 TNF-o Her2蛋白、 凝 血因子、 白细胞介素、 FAP、 PDL1、 EGFR。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自 TNF-cx， 并且选自下组：
(1) SEQ ID ^<<).: 10或8?0 ID NO. : 12所示的氨基酸序列；
(2)将 SEQ ID NO. : 10或 SEQ ID NO. : 12氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的 取代、 缺失或添加而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的衍生的多 肽。
在另一优选例中，所述的抗原表位肽源于 TNF-cx，并且所述抗原表位肽选自下组： (a) SEQ ID NO.: 5-8 SEQ ID NO. :34、 SEQ ID NO. : 117或 SEQ ID NO. : 118所示的 多肽；
(b) 将 SEQ ID NO. : 5-8或 SEQ ID NO. :34所示的多肽经过一个或多个氨基酸残基 的取代、 缺失或添加而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发针对 TNF-cx免疫反应功 能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源于凝血因子 FXI， 并且所述抗原表位肽选自 下组：
(a) SEQ ID NO.: 40或 SEQ ID NO. :41所示的多肽；
(b) 将 SEQ ID NO. : 40或 SEQ ID NO. :41所示的多肽经过一个或多个氨基酸残基 的取代、 缺失或添加而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a) 衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽包括 FXI的催化结构域或其同源序列。
在另一优选例中， 所述 FXI的催化结构域的蛋白序列如 SEQ ID NO.:45所示。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自凝血因子为 FXI， 并且所述抗原表位肽选 自下组：
(a) SEQ ID NO.: 45所示的多肽；
(b) 将 SEQ ID NO. : 45所示的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自 FXII。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽选自下组中的一个或多个：
(1) EAFSPVSYQHDLA;
(2) EGFSSITYQHDLA; ； 禾口
(3) 其他 FXI I蛋白中与（1)、 （2)表位序列对应的肽段。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽包括凝血因子为 FXII的催化结构域。
在另一优选例中， 所述 FXII的催化结构域选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. ： 129或 SEQ ID NO. ： 130氨基酸序列的多肽；
(b)将（a)中氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成 的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自 FAP催化结构域。
在另一优选例中， 所述 FAP催化结构域选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. ： 108氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID NO. ： 108氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源于 FAP， 并且所述抗原表位肽选自下组： (a) SEQ ID NO.: 49所示的多肽；
(b) 将 SEQ ID NO. : 49所示的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自 VEGF。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. : 63氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID NO. : 63氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加 而形成的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自 PDL1。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自 PDL1E。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自 PDL1 , 并且所述抗原表位肽选自下组： (a)具有 SEQ ID NO. : 67、 SEQ ID NO. : 68、 SEQ ID NO. : 122、 SEQ ID NO. : 123、 SEQ ID NO. : 124或 SEQ ID NO. : 125氨基酸序列的多肽；
(b)将（a)中氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成 的， 且与载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自表皮生长因子受体 EGFR。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自表皮生长因子受体 EGFR的第 III亚区。 在另一优选例中，所述抗原表位肽源自表皮生长因子受体 EGFR,并且所述抗原表位 肽选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO. : 83、 110、 111所示氨基酸序列的多肽；
(b)将（a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且与 载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。 在另一优选例中， 所述抗原表位肽源自表皮生长因子受体 EGFR， 并且包括 SEQ ID NO. : 83所示的氨基酸序列， 和
SEQ ID NO. : 110和 SEQ ID NO. : 111中的至少一种。 本发明的第十方面， 提供一种融合蛋白， 所述融合蛋白是如本发明第九方面的 抗原表位肽与载体蛋白融合所形成的。
在另一优选例中， 所述载体蛋白与所述抗原肽段不是来自同一个蛋白， 所述载 体蛋白包含至少一个 T细胞表位， 所述载体蛋白可以增强所述表位肽的免疫原性。
在另一优选例中， 所述载体蛋白包括白喉毒素 DT、 白喉毒素的跨膜结构域 DTT、 轮状病毒 VP7、 利什曼原虫的热休克蛋白、 空肠弯曲菌鞭毛蛋白、 沙眼衣原体主要外膜 蛋白、 血蓝蛋白 (Keyhole Limpet Hemocyanin , KLH)、 牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin, BSA), 鸡卵白蛋白 (Ovalbumin, OVA), 纤维蛋白原。
在另一优选例中， 在所述载体蛋白的至少一个分子表面氨基酸残基区通过拼接、 替 换和 /或插入引入所述抗原表位肽形成所述融合蛋白。
在另一优选例中， 所述 "分子表面氨基酸残基区"包括 loop区、 beta-tum区、 N末端 或 C末端。
在另一优选例中， 所述抗原表位肽连接于所述载体蛋白的 C末端和 /或 N末端形成所 述融合蛋白。
在另一优选例中， 所述抗原表位和所述载体蛋白之间具有连接肽。 优选地， 所述连 接肽长度为 3-30个氨基酸。 更优选地， 所述连接肽长度为 4-20个氨基酸。 最优选地， 所述 连接肽长度为 7-17个氨基酸。
在另一优选例中， 所述抗原表位和所述载体蛋白之间不具有连接肽。
在另一优选例中， 所述融合蛋白选自：
(a)具有 SEQ ID NO. : 9、 11、 13、 35、 37、 39、 42、 43、 44、 50、 51、 62、 69、 70、 84、 85、 86、 87、 112、 119、 120、 126或 127所示氨基酸序列的多肽；
(b)将（a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且与 载体蛋白融合后具有诱发免疫反应功能的由（a)衍生的多肽。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中 具体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于 篇幅， 在此不再一一累述。 附图说明
图 1显示了实施例中基于重叠 PCR的扩增原理图。
图 2显示了实施例 1中 mTNF疫苗抑制发病的效果。 图 2A显示了免疫后 TNF28相对于 DT抗血清针对小鼠和人的 TNF蛋白的蛋白杂交实验。 图 2B显示每组老鼠免疫与发病期 间的平均发病分数，可以看到 mTNF28组相对于对照组 Alum在发病率上表现出明显的滞 后和减轻炎症的治疗作用。 图 2C显示各融合蛋白的生物活性。 图 2D显示每组老鼠免疫 与发病期间的平均发病分数， 可以看到 DTT-mTNFt组相对于对照组在发病分数上有明 显抑制发病的效果。
图 3显示了实施例 2中 mTNF28-l抗原蛋白的引发免疫反应的效果。 图 3A显示 mTNF28-l第四次加强免疫之后 60天取小鼠的血来做抗体分型，发现针对 I gG 1的滴度还 有 10000以上。 图 3B显示了每组老鼠免疫与发病期间的平均发病分数， 可以看到 mTNF28-l组相对于对照组在发病分数上有明显抑制发病的效果。
图 4显示了实施例 3中 FXI疫苗的抗血栓效果。 图 4A显示各组抗原免疫后小鼠在致 死肺栓塞模型中的存活率。图 4B显示从注射人胎盘浸出液到小鼠开始出现呼吸困难的 时间。 图 4C和图 4D显示 29号抗原免疫后小鼠血栓的形态 （C) 和湿重 （D) 。
图 5 显示了实施例 3中 FXI疫苗免疫小鼠的抗体延长了正常人血浆 APTT值 （A) 及 FXI ( B) 特异的血浆 APTT值。
图 6 显示了实施例 4中 FXI I疫苗免疫后小鼠血栓的形态 （A) 和湿重 （B ) 。
图 7显示了实施例 5中融合疫苗 DTT-FAP对肿瘤生长的抑制效果。 图 7A为肿瘤接种 后小鼠的存活率。 图 7B显示了肿瘤体积的变化趋势。 图 7C显示接种 4周后肿瘤的大小。
图 8显示了实施例 6中 DTT-VEGF免疫后可以显著延长荷瘤小鼠的生存时间。
图 9显示了实施例 6中不同实验组肿瘤周围血管状况、 瘤体内部病理形态、 肿瘤 重量和肿瘤体积的变化趋势。
图 10显示了实施例 7中 DTT-PDL1E和 DTT-PDL1E重组蛋白疫苗对肿瘤生长的抑制 效果。 图 10A显示了免疫治疗小鼠肿瘤体积变化。
图 10B、 图 10C和图 10D分别显示了实施例 7中 DTT-PDL1E和 DTT-PDL1E重组蛋白疫 苗免疫治疗小鼠肿瘤重量变化 （图 10B) 、 荷瘤小鼠的体重 （图 10C) 和肿瘤肿瘤与荷 瘤小鼠的体重比值 （图 10D ) 。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 首次意外地发现， 以合适的载体蛋白的结构 骨架为基础， 在所述载体蛋白的至少一个表面氨基酸残基区处通过拼接、 替换和 /或 插入而引入来自低免疫原性蛋白的肽段， 可以制得一类新颖的重组蛋白。所述重组蛋 白不仅可有效激发机体（如哺乳动物）对所述重组蛋白的免疫应答，而且可以有效地产 生针对所述来自低免疫原性蛋白肽段的免疫反应， 包括产生抗体。在此基础上完成了 本发明。 术语
如本文所用， 术语 "载体蛋白" 指在本发明的重组蛋白中作为蛋白结构骨架的 蛋白。 通常， 所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白， 例如病原体蛋白， 代表性的例 子包括（但并不限于）： 病毒蛋白、 细菌蛋白、 衣原体蛋白、 支原体蛋白等。
如本文所用， 术语 "抗原表位（肽）" 指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白的 一段肽， 该表位相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肽 段。 通常， 抗原表位指免疫反应拟靶向的肽段， 较佳地来源于哺乳动物（如人）蛋白的 一段肽， 而不是来自所述载体蛋白。
如本文所用， 术语 .pdb专指蛋白质三级结构数据文件， 来自 Protein Data B ank(www .pdb.org);
如本文所用， 术语 DTT指白喉毒素的跨膜结构域；
如本文所用， 术语 T细胞表位是指 T细胞表位， 又称为 T细胞抗原表位， 是抗原分 子经过抗原呈递细胞中酶解加工产生的一段肽， 能够由主要组织相容性复合体（MHC) 分子结合， 呈递在细胞表面被 T细胞受体（TCR)结合， 激活 T细胞， 包括 T辅助细胞表位 等。
如本文所用， 术语 "低免疫原性蛋白" 是指单独免疫动物不能引起足够的免疫 反应的蛋白
如本文所用， 术语 "分子表面氨基酸残基区" 或 "表面氨基酸残基区" 是指位于 蛋白分子表面的氨基酸残基组成的区域， 优选地， 所述 "分子表面氨基酸残基区"包 括 loop区、 beta-tum区、 N末端或 C末端。
代表性的载体蛋白
1. 白喉毒素及其跨膜结构域
白喉毒素（diphtheria toxin， DT)是感染了 beta噬菌体的白喉棒状杆菌 (Corynebacterium diphtheriae ) 产生的外毒素， 存在于临床使用的百白破疫苗成份中。 安全性得到多年临床使用的验证， 罕见严重不良反应， 目前尚无由白喉成份引起过敏 反应的报道。
白喉毒素分子由 535个氨基酸残基构成， 空间上相对独立的催化结构域 (1-193 AAs) 、跨膜结构域 C205-378AAs)和受体结合域 C386-535AAs)组成； 跨膜结构域 和受体结合域本身无毒性， 其功能是通过细胞表面受体结合， 将催化结构域转导进入 细胞内。
白喉毒素氨基酸序列（P00588, DTX_C0RBE)如下所示：
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESI INLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSI IRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS
(SEQ ID No.： 1)
白喉毒素分子中的存在 5个 T-辅助细胞表位可被高达 80%以上的人匪 C c lass II识 另 ij。 其中，四个 T-辅助细胞表位位于白喉毒素的跨膜结构域（T区， DTT)上，分别为 DTT-Th表位 271-290 (271-PVFAGANYAAWAVNVAQVID-290) ， DTT-Th表位 321-340 (321-VHHNTEEIVAQSI AL SSLMV-340) ， DTT-Th 表 位 331-350 (QSIALSSLMVAQAIPLVGEL-350) ， DTT-Th 表 位 351-370 (351- VD I GFAA YNFVES 11 NLFQV-370)，主要分布在三段长 α螺旋结构（276-ANYAAWAVNVA-286 ; 327-EIVAQSIALSSLMVAQAIPLV-347 ; 353 - IGFAA YN FV ESI INUWVHNSYN - 376)。 本发明人对白喉毒素的蛋白结构进行模拟，保留结构稳定需要的 α螺旋和 β折叠 元件和 Τ细胞表位， 能够被替换植入抗原表位的表面氨基酸残基区位置列于下表中。
白喉毒素（DT) 表面氨基酸残基区可植入位置汇总
表位植入位置
序号 被替代残基数
(氨基酸残基）
DT-1 6-10 5
DT-2 26-34 9
DT-3 26-43 18
DT-4 26-48 23
DT-5 68-76 9
DT-6 86-88 3
DT-7 107-112 6
DT-8 129-133 5
DT-9 169-177 9
DT-10 222-224 3
DT-1 1 232-239 8
DT-12 256-258 3
DT-13 268-271 4
DT-14 289-296 8
DT-15 317-320 4
DT-16 348-354 7
DT-17 438-440 3
DT-18 463-467 5
DT-19 495-502 8
DT-15 516-523 8 白喉毒素跨膜结构域 (DTT)本身无毒， 主要由 α螺旋元件构成核心骨架， 螺旋元件之 间由灵活性的环区连接。
DTT氨基酸序列（1F0L. pdb : 202 - 378)如下所示：
202 INLDWDVIRD KTKTKIESLK EHGPIKNKMS ESPNKTVSEE KAKQYLEEFH QTALEHPELS
262 ELKTVTGTNP VFAGANYAAW AVNVAQVIDS ETADNLEKTT AALSILPGIG SVMGIADGAV
322 HHNTEEIVAQ SIALSSLMVA QAIPLVGELV DIGFAAYNFV ESI INLFQVV HNSYNRP (SEQ ID No.： 2) 本发明人对 DTT的蛋白结构进行模拟，保留结构稳定需要的 α螺旋和 β折叠元件 和 Τ细胞表位， 能够被替换植入抗原表位的位置列于下表中。 DTT可植入抗原表位的表面氨基酸残基区汇总
通用的可植入位 优选的可植入位 优选的可替代
置（氨基酸残基） 置（氨基酸残基） 残基数
DTT-1 220-226 222-224 3
DTT-2 228-241 230-239 10
DTT-3 253-262 255-260 6
DTT-4 265-276 267-274 8
DTT-5 285-298 287-296 10
DTT-6 303-312 305-310 6
DTT-7 313-327 315-325 1 1
DTT-8 315-322 317-320 4 在本发明的优选例中， 可选择药物拟干预的靶蛋白的肽段移植到 DTT上， 并替换 DTT的表面氨基酸残基区， 包括 α螺旋元件之间环区氨基酸残基。
本发明的研究表明， 白喉毒素跨膜结构与来自靶蛋白的肽段整合后， 不会或基本 上不会影响各自的折叠。 在重组蛋白中， DTT作为蛋白骨架， 靶蛋白肽段移植到 DTT 上后， 可以诱导动物产生针对所述靶蛋白的免疫反应。 因此 DTT是一种非常合适的蛋 白骨架。 组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物， 它含有： （i)本发明的重组蛋白或本发明的可编码重 组蛋白的多核苷酸， 以及 (ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。
本发明中，术语"含有"表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。 因此， 术语 "主要由. . .组成"和 "由. . .组成"包含在术语 "含有" 中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。
本发明的组合物可以是单价的（仅含有一种重组蛋白或多核苷酸）， 也可以是多价 的 (含有多种重组蛋白或多核苷酸）。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型， 其中包括（但并不限 于）： 注射剂、 粒剂、 片剂、 丸剂、 栓剂、 胶囊、 悬浮液、 喷雾剂等。
(1)药物组合物
本发明的药物组合物包含（或含有）治疗有效量的本发明重组蛋白或多核苷酸。 本文所用的术语 "治疗有效量" 指治疗剂治疗、 缓解或预防目标疾病或状况的 量， 或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。 该效果可通过例如抗原水平来检测。 治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型 和健康状况、 病症的性质和程度、 以及选择给予的治疗剂和 /或治疗剂的组合。 因此， 预先指定准确的有效量是没用的。 然而， 对于某给定的状况而言， 可以用常规实验来 确定该有效量。
为了本发明的目的， 有效的剂量为给予个体约 0. 001毫克 /千克至 1000毫克 /千 克， 较佳地约 0. 01毫克 /千克至 100毫克 /千克体重的重组蛋白。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。 术语 "药学上可接受的载体" 指用 于治疗剂（例如本发明的重组蛋白）给药的载体。 该术语指这样一些药剂载体： 它们本 身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体， 且给药后没有过分的毒性。合适的 载体可以是大的、 代谢缓慢的大分子， 如蛋白质、 多糖、 聚乳酸（polylactic acid)、 聚乙醇酸等。 这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。 在 Remington ' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.， N. J. 1991)中可找至 lj关于药学上可接受 的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体， 如水、 盐水、 甘油和乙醇。 另外， 这些载体中还可能存在辅助性的物质， 如润湿剂或乳化剂、 pH 缓冲物质等。 通常， 可将组合物制成可注射剂， 例如液体溶液或悬液； 还可制成在注射前适合配入溶液或 悬液、 液体赋形剂的的固体形式。 脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗（组合物）可以是预防性的（即预防疾病）或治疗性的（即在患病后 治疗疾病）。
这些疫苗包含免疫性抗原（包括本发明重组蛋白）， 并且通常与 "药学上可接受 的载体"组合， 这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任 何载体。 合适的载体通常是大的、 代谢缓慢的大分子， 如蛋白质、 多糖、 聚乳酸、 聚 乙醇酸、 氨基酸聚合物、 氨基酸共聚物、 脂质凝集物（如油滴或脂质体）等。 这些载体 是本领域普通技术人员所熟知的。 另外， 这些载体可起免疫剌激剂（ "佐剂" ）作用。 另外， 抗原也可以和细菌类毒素（如白喉、 破伤风、 霍乱、 幽门螺杆菌等病原体的类 毒素）偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于： （1)铝盐（alum) , 如氢氧化铝、 磷酸铝、硫酸铝等；（2)水包油型乳剂配方，例如，（a) MF59 (参见 W0 90/14837)， (b) SAF, 禾口（c) Ribi(TM)佐剂系统（RAS) (Ribi Immunochem , Hami lton , MT)， （3)皂素佐剂； (4) Freund完全佐剂（CFA)和 Freund不完全佐剂（IFA) ; (5)细胞因子， 如白介素（如 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL_5、 IL_6、 IL_7、 IL-12等）、 干扰素（如 γ干扰素）、 巨噬细胞 集落剌激因子 (M-CFS)、 肿瘤坏死因子（TNF)等； （6)细菌 ADP-核糖基化毒素（如大肠 杆菌热不稳定毒素 LT)的脱毒变异体； 以及（7)作为免疫剌激剂来增强组合物效果的 其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物（例如， 可包括抗原、 药学上可接受的载 体以及佐剂）， 通常含有稀释剂， 如水， 盐水， 甘油， 乙醇等。 另外， 辅助性物质， 如润湿剂或乳化剂、 PH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地， 包括免疫原性组合物在内的疫苗， 包含免疫学有效量的免疫原性多 肽， 以及上述其它所需的组分。 "免疫学有效量"指以单剂或连续剂一部分给予个体 的量对治疗或预防是有效的。 该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治 疗个体的类别（如人）、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、 治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范 围内， 可通过常规实验来确定。
通常， 可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂， 例如液体溶液或悬液； 还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、 液体赋形剂的固体形式。 该制剂还可乳化或 包封在脂质体中， 以增强佐剂效果。
此外， 本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。
(i ii)给药途径和剂量
一旦配成本发明的组合物， 可将其直接给予对象。 待治疗的对象可以是哺乳动 物， 尤其是人。
当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组蛋白直接施用于个体。通常采用与 常规疫苗相同的施用途径和 /或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括 (但并不限于）：肌内、皮下、皮内、 肺内、 静脉内、 经鼻、 经口服或其它肠胃外给药途径。 如果需要， 可以组合给药途径， 或根据疾病情况进行调节。 疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予， 且可以包括给予加强 剂量以引发和 /或维持免疫力。
应以 "有效量"给予重组蛋白疫苗， 即重组蛋白的量在所选用的给药路径中足以引 发免疫应答， 能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。
代表性的疾病包括 (但并不限于）： 自身免疫性疾病、 肿瘤等。
在各疫苗剂份中所选用的重组蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副 作用的量而定。 通常， 在感染宿主细胞后， 各剂的疫苗足以含有约 l g-1000mg， 较佳 地为 1 μ g-100mg, 更佳地 10 μ g_50mg蛋白质。 可用包括观察对象中的抗体滴定度和其 它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平 来确定是否需要增强剂量。 在评估了血清中的抗体滴定度后， 可能需要选用增强剂量免 疫接种。 施用佐剂和 /或免疫剌激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
优选方法是从肠胃外（皮下或肌内）途径通过注射给予免疫原性组合物。
此外， 本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予， 或者与其他治疗剂一 起给予。 本发明的主要优点在于：
(1) 可有效激发机体针对低免疫原性靶点的特定表位免疫反应。
(2) 携带抗原表位的重组蛋白的制备成本低， 给药方便。
(3) 相对于与载体蛋白化学偶联的制剂， 抗原结构确切、 质量可控， 更安全。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比 和份数是重量百分比和重量份数。 实验方法：
方法 1 重组蛋白抗原结构设计
单表位重组蛋白抗原结构设计用靶蛋白的抗原表位肽氨基酸序列移植到 DTT 的表位 展示位置并替换原位置氨基酸残基完成，形成新蛋白结构；多表位重组蛋白抗原结构设计 将靶蛋白的多抗原表位肽段或结构域插入 DTT的 C末端， 或通过一段 l inker插入到 DTT 的 C末端完成， 形成新蛋白结构。 方法 2重组蛋白的表达载体构建
根据 GeneBank中 DTT基因 mRNA和靶蛋白基因 mRNA的开放阅读框的抗原表位区序列， 设计 DTT基因引物 （DTT-F和 DTT-R) 和靶蛋白基因引物， 通过重叠 PCR的原理在 DTT相 应的表位展示位置引入抗原表位区序列， 并在头尾引入酶切位点 BamHI和 XhoI， 引入 3 个保护碱基 （图 1 )。 各引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
( 1 )抗原表位从 DTT中间插入 /替换的重组蛋白表达载体构建： 以 DTT基因 DNA为模 板， 取引物 DTT-F (含 BanR I 酶切位点和） 和靶蛋白 _2R进行第一轮 PCR扩增； 同时以 DTT基因 DNA为模板，取引物用引物 DTT-R (含 Xhol酶切位点）和靶蛋白 -3F进行 PCR扩增； 以上两种扩增产物混合后， 取引物 DTT-F和 DTT-R进行 PCR扩增重组蛋白基因。
( 2 )抗原表位从 DTT的 C末端插入 /替换的重组蛋白表达载体构建： 以 DTT基因 DNA 为模板， 引物对 DTT-F (含 BanR I 酶切位点和肠激酶切位点 DDDDK的序列） 进行第一轮 PCR扩增； 再以靶蛋白基因引物对 （反向引物含
3/4 o I 酶切位点序列) PCR扩增靶蛋白抗 原表位基因； 以上两种扩增产物混合后以引物对 DTT-F和靶蛋白基因反向引物进行 PCR 扩增重组蛋白基因。
重组蛋白基因用 BaiM I 和 Xho I 酶切连接到质粒 pGEX 6p-l 达到表达质粒 pGEX-DTT-靶蛋白抗原表位， 通过测序确认正确性。
PCR体系配制后， 94° C变性 2 94° C 15s , 55° C 30s, 68° C 2 min， 35个 循环； 68° C 10 min。 取 2μ?扩增产物进行电泳， Goldview染色观察后出现目的带。 PCR 产物和 pEGX-6P-l载体双酶切的回收纯化， 用 AXYGEN凝胶清洁试剂盒清洁后。 在 PCR仪 上采用 T4连接酶连接进行连接反应 16° C 5 h。 连接产物热激转化大肠杆菌， 将 5 uL的 连接产物加入感受态细胞中轻轻混匀，冰浴 20 min再转入 42° C水浴 90s，再冰浴 2 min, 加 900 μ L 37° C预热 LB培养基， 于 37° C摇床 150rpm复苏 lh， 取 200 μ L涂布于含 有 Amp抗菌素 LB平板， 37° C培养 20 h， 进步一鉴定筛选转化子。 提取的载体质粒用头 尾引物 PCR扩增后经鉴定的阳性克隆加入终浓度为 15%的无菌甘油，于 -80° C超低温冰箱 保存备用，为含有重组蛋白表达质粒的大肠杆菌菌种。阳性克隆通过测序与理论序列比较 判断是否连接成功。
表 1 DTT基因 C端插入表位的通用引物表 方法 3重组蛋白的表达鉴定与规模制备 将含有重组表达质粒蛋白的大肠杆菌单菌落接种到 5mL LB培养基， 37° C培养过夜。 然后以 1 : 50稀释到含有 50ng/L Amp, LB培养基 50mL中， 培养约 4小时使其 0D6。。值约 为 0. 6， 加 IPTG至终浓度为 lmM， 在 37° C诱导 4小时时取出鉴定表达情况。 取 50 mL 诱导的培养物，冰上放置 30 min， 12000rpm离心 8 min， 收集菌体，弃上清； 沉淀用 lxPBS ( 5mL/100mL培养物）加等体积冰冷的无菌水打散重悬； 加入 300 μ g/mL的溶菌酶， 冰上 轻摇 30 min后， 置 -70° C冻存 12h; 把样品用流动的水融化后加入蛋白酶抑制剂， 冰浴 中超声破碎（200W功率）， 间歇破碎， 每破碎 5s， 间隔 5s， 反复破碎共 8min， （可在显微 镜下观察破碎结果）。 混合物在 4° C用 12，000g的转速离心 12 取混合、 上清、 沉淀 样品保存 4° C备用。
取混合，上清，沉淀样品分别用考马斯亮蓝法定量测定蛋白含量并稀释到一定浓度后 取 200uL加入 50uL 5 X上样 buffer, 煮沸 5min， 取出冷却后 12, 000 rpm离心 8min并加 样。 用微量进样器取 20 μ L上述混合液， 用 SDS-PAGE电泳分析诱导表达的蛋白分子量和 表达量， 判断与理论分子量一致性和表达可溶性。
挑取表达阳性的菌种，接种于 50mL选择性 Amp LB液体培养基中， 37° C, 200rpm/min 振摇过夜，第二天取 lmL接种到 1L LB液体培养基中，同样的操作一共 4瓶， 37° C， 180rpm 培养 4h后， 取一管不加 IPTG样本作为对照， 其余加入 1 mol/L IPTG于菌液中至终浓度 为 1 mM， 继续培养 10小时。 全部诱导后菌液 6000rpm离心 8 min收集菌体沉淀， 用 lmL PBS (pH = 7. 3 ) 重悬洗涤一次离心收集菌体， 加入体积 250 mL PBS (pH = 7. 3 ) 重悬后 超声破碎， 15min， 脉冲破碎后用 50 mL离心管离心， 15000rpm, 40min后， 小心取上清， 4°C存放备用。
GE 5mL GST预装柱先 lxPBS (140mM NaCl , 2. 7mM KC1， lOmM N 3/4 HP04， 2mM KH2P04)平 衡， 流速设为 4mL/min左右，平衡 5个柱体积， 将上述处理好的蛋白上样， 流速 lmL/ 上样结束后，用 lxPBS洗杂，流速为 4mL/min，洗脱至少 10个柱体积；之后用 lxPSP buffer 平衡柱子至少 5个体积后， 用 800 ul的 PSP酶切割流穿 GST柱子， 使其均匀充满整个柱 子， 于 4°C切割 12-16小时后用含有洗脱液 （50mM Tris-HCl , 10m GSH， pH8. 0 ) 洗脱蛋 白 2-3个柱体积， 洗脱流速为 2mL/min， 用过的柱子用 20%乙醇冲洗柱子和仪器。 之后将 蛋白透析到生理盐水中， 定量后将蛋白稀释成 0. 5mg/mL， 电泳检测纯度达到 90%以上。将 蛋白用生理盐水透析后 -20°C冰箱保存备用。 所制备的三种蛋白纯度都在 90%以上。 方法 4融合蛋白的动物免疫和抗原滴度的检测
将融合蛋白抗原稀释成 0. 5mg/mL后与稀释后浓度为 2mg/mL的氢氧化铝 （sigma) 佐 剂或弗氏佐剂混匀后背部皮下多点注射， 隔周加强免疫，如此加强免疫 2次后小鼠眼眶取 血， 37°C静置 2h后， 4000rpm离心 lOmin后， 取上清血清备用。
用包被缓冲液 （50mmol/L碳酸氢盐缓冲液， pH 9. 6 ) 将靶蛋白或靶细胞的稀释到浓 度为 lOOng/ΙΟθμΙ， 然后转移到聚苯乙烯 96孔板上 （每孔加 Ιθθμ? ), 4°C孵育过夜， 用 PBST (0. 02 M磷酸盐， 0. 15 M NaCl, 0. 15% Tween-20, pH 7· 4)洗 6次， 每次洗 5分钟。 再加入 300μ1脱脂奶粉（溶于 PBST, 蛋白浓度为 5%)， 37°C孵育 2小时进行封闭。用 PBST ( 0. 02 M磷酸盐， 0. 15 M NaCl, 0. 15% Tween-20, pH 7. 4) 洗 6次， 每次洗 5分钟。 然 后用脱脂奶粉（溶于 PBST, 蛋白浓度为 5%)将免疫血清稀释一定的倍数后每孔加 Ιθθμ? , 37°C孵育 1小时， 用 PBST (0. 02 M磷酸盐， 0· 15 M NaCl, 0. 15% Tween-20, pH 7. 4) 洗 6次， 每次洗 5分钟。 加入 Ιθθμ?羊抗鼠 -IgG-辣根过氧化物酶交联物 （1 : 5， 000稀释）， 37°C孵育 1小时， 用 PBST (0. 02 M磷酸盐， 0· 15 M NaCl, 0. 15% Tween-20, pH 7. 4) 洗 6次，每次洗 5分钟。最后加入 Ιθθμ?底物溶液（10ml底物溶液含 lmg四甲基联苯胺（TMB)， 0. 0969g柠檬酸钠， 0. 3496g Ν 3/4 ΗΡ04 · 12Η02， 32 μ? 0. 75% Η202， 37°C孵育 30分钟。 加 入 50μ1 2mol/L H2S04终止反应。 在酶标仪上对每个孔测 450nm处的值。 实验 5 小鼠胶原模型的构建
当小鼠 3次免疫之后， 开始造类风湿关节炎模型， 具体操作过程： 第 42天将牛的 II 型胶原（2mg/mL)与 CFA(内含 lmg/mL的 M. tuberculosis)l： 1冰上背部多点注射共 200uL; 第 63次将牛的 II型胶原（4mg/mL) 与 CFA (内含 lmg/mL的 M. tuberculosis) 1： 1比例， 低温冰上用枪头吹打乳化 （以滴一滴在清水上， 不立即散开为乳化好的标准）， 在距离小 鼠尾根部 1. 5cm处注射 50uL; 第 70天将牛的 II型胶原（4mg/mL) 与 CFA (内含 lmg/mL的 M. tuberculosis, 且每 ml CFA中新力口入 3mg的 M. tuberculosis) 1 : 1比例， 低温冰上 乳化后在距离小鼠尾根部 1. 5cm处注射 50uL。 以后每周两次来检测老鼠的体重和发病情 况并做好记录。
评分标准： 用 4分制评判小鼠的发病程度： 0分： 无红肿和肿胀的证据； 1分： 红斑 和轻度肿胀局限于足中段（跗骨） 或 踝关节 （一个脚趾有轻微红肿）； 2分： 红斑和轻度 肿胀从踝关节蔓延至足中段 （有 2个或者 2个以上的脚趾红肿）； 3分： 红斑和中度肿胀 从踝关节蔓延至跖关节 （踝关节或髋关节红肿）； 4 分： 红斑和重度肿胀包括了踝， 足和 趾（所有的关节和脚趾均红肿， 不能弯曲）。 所有的四肢均单独计分， 故最高分为 16分。 方法 6 Western鉴定
原始样品一般上样量为 20-30ug以初始电压为 45V时的电流强度进行稳流电泳，当电 压达 65V时改为稳压电泳，在目的蛋白泳动至距胶下缘 1cm以上结束。 将胶浸于转移缓冲 液中平衡 lOmin。 依据胶的大小剪取膜和滤纸 6片， 放入转移缓冲液中平衡 lOmin。 如 用 PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5秒钟。 装配转移三明治： 海绵 3层滤纸胶膜 3层滤纸 海绵， 每层放好后， 用试管赶去气泡。 将转移槽置于冰浴中， 放入三明治（黑色面对黑色 面）， 加转移缓冲液， 插上电极， 10mA过夜或者 100V， lh。 （注意调整时间）转膜结束后， 切断电源， 取出杂交膜。
将膜从电转槽中取出， 去离子水与 TTBS稍加漂洗， 浸没于封闭液中缓慢摇荡 lh。 将 稀释好的一抗装入 10mL的或者 50mL的进口离心管。将 Western膜从封闭液中取出，滤纸 贴角稍吸干， 正面朝下贴在一抗上， 4°C静置过夜（正面上下用铅笔做好标记）。一抗孵育 结束后， 用 TTBS漂洗膜后再浸洗三次， 每次 10min。 根据一抗来源选择合适的二抗， 根 据鉴定方法选择 HRP标记的抗体， 按相应比例稀释 （1 : 5000)， 室温轻摇 lh。 二抗孵育结 束后， 用 TTBS漂洗膜后再浸洗三次， 每次 10min。 将 A、 B发光液按比例稀释混合。 膜用 去离子水稍加漂洗， 滤纸贴角吸干， 反贴法覆于 A、 B混合液滴上， 置于保鲜膜内固定于 片盒中， 迅速盖上胶片， 关闭胶盒， 调节曝光强度。 方法 7 T细胞增殖实验
50ml离心管 8只， 洗净， 灭菌； 15 ml 离心管 16只， 洗净， 灭菌。 无菌细胞筛网 8 只， 300 ml 75%酒精， 灭菌镊子两把， 小剪刀两把， 灭菌 PBS， RPM1640+20%FCS， 各一瓶。 6孔培养板两只， 10ml—次性注射器 8个。 小鼠脱颈处死后， 放入 75%乙醇中浸泡 15分 钟， 浸泡期间， 取出淋巴细胞分离液室温平衡， 超净台内取出灭菌的剪刀镊子， 用酒精棉 擦拭后摆放在 10cm细胞培养皿中， 准备好 6孔板， 将滤器套在 50ml离心管上。
将浸泡好的小鼠仰卧尾朝外平放在平皿中， 从右侧腹股沟上方一厘米剪开腹腔， 用小 镊子拨开肝脏后小心拉出脾脏， 放在 6孔板的孔中， 孔中预先加入 2 ml PBS; 用注射器 的活塞柄头小心的压碎脾脏，并进行旋转研磨至完全散开。将得到的细胞悬液小心的吸到 离心管上的滤器中， 至细胞悬液全部滤过， 加 lml PBS冲洗下板孔并吸出冲洗滤网一次； 准备好 15ml离心管，预先加入 3ml淋巴细胞分离液，按照说明书进行操作分离淋巴细胞； 细胞沉淀用 PBS再清洗一次，用含有 10%FCS 1640将细胞调整至 5 X 107ml， 按照每孔 100 μ L铺板， 每孔加终浓度为 10 μ g/ml抗原剌激， 5% C02 37度培养 72小时； 加入 10 μ L ΜΤΤ 继续培养 4小时， 吸弃培养上清及悬浮的细胞； 加入 100 二甲亚砜， 室温震荡 溶解蓝色沉淀； 550 nm、 630 nm读取吸光值， 以 0D57。_0D63。作为最终数值， 判断每孔的活 细胞数目。 用抗原剌激组-空白对照组数值作为细胞增殖活性。 方法 8 CTL杀伤实验
CFSE staining buffer 禾 P 7AAD staining buffer 按照 7AAD/CFSE Cel l-mediated cytotoxicity Assay kit (Abnova, US) 说明书准备。
标记靶细胞： 肿瘤细胞用胰酶消化后， 1000 rpm 5 min 离心弃上清； 加入 3 ml Cel l-Based Assay Buffer 重悬， 计数后 1000 rpm 5 min离心弃上清; 按照 106cel ls/ml 用 CFSE staining buffer重悬， 对照细胞用同体积 Cel l-Based Assay Buffer 重悬， 室温避光孵育 15 1000 rpm 5 min离心弃上清，细胞按照 106cel ls/ml用含 10%FBS+1640 重悬； 1000 rpm 5 min离心弃上清，细胞按照 106cel ls/ml用含 10%FBS+1640重悬。 放置 细胞培养箱中培养 30min-l小时备用； 按照 T细胞增殖实验中的方法分离脾脏淋巴细胞， 按照 107cel ls/ml铺 6孔板，每孔 2加入终浓度为 10 μ g/ml抗原肽和 10 unit/ml IL-2 剌激， 5% C02， 37度培养 5天后备用。
检测： 将标记好的靶细胞按照 104cel ls/wel l铺 96孔板中。 剌激好的效应细胞按照 效靶比 10 : 1， 20 : 1, 50 : 1 加入到靶细胞中， 并补足培养基至每孔总体积为 200 μ L, 5% C02 37度孵育 6小时。 400g/5min收集细胞沉淀，每管加入 50ul 7-AAD Staining Solution, 重悬细胞。 4度避光孵育 15 400g/5min 收集细胞； 加入 0. 2ml Assay Buffer重悬， 400g/5min收集细胞； 加入 0. 2ml Assay Buffer重悬，上流式检测，记录数据；收集 20000 个细胞。 计算双阳性细（ CFSE+7AAD+)占 CFSE阳性细胞 (CFSE+)的百分比作为最终的杀伤 率。 方法 9 肿瘤细胞培养与小鼠移植癌症模型的建立与免疫治疗效果评价
细胞与肿瘤接种： 材料包括 DMEM培养基、 1640培养基、 胎牛血清、 抗生素、 胰蛋 白酶、 均购自 Invitrogen公司， PBS (参考 Takara说明书配制）。 Binder细胞培养箱、 飞鸽离心机、 万和金属水浴锅。
肿瘤细胞培养与移植： CT26、 B16 F10、 Lewis 等肿瘤细胞均购自中科院上海细胞 库， 根据不同肿瘤细胞特性常规传代培养， 5 % C02培养箱，37 °C培养。 当细胞融合度达 到 90%时，经 0. 25 %胰酶消化， 收集细胞于无血清的培养液中，轻轻摇动， 500g,离心 5min， 洗涤一次， PBS重悬， 调整浓度为 106， 经台盼蓝染色， 并用血球计数板计数， 检测活细 胞比例在 95 %以上。 根据实验要求， 实体瘤接种在前肢腋下 105-106个 /只。
表观效果评价： 肿瘤接种 7天左右 （不同类型肿瘤略有差异） 隔天游标卡尺测定肿 瘤长和宽， 利用肿瘤体积计算公式： Tumor V0lume=Width2Jength^ /2。 肿瘤体积大于 2000讓3或 3000讓3 (不同类型肿瘤略有差异）理论上判断小鼠死亡， 统计存活情况， 制定 生存曲线。 在接种肿瘤 （20-30 天） 剖杀小鼠， 称量瘤重， 根据公式： 抑制率 = (对照组 平均肿瘤重量-实验平均组肿瘤重量） /对照组平均肿瘤重量 J00%。 小鼠在分组前和剖杀 前， 电子天平称量小鼠体重并记录， 计算瘤重体重比。 实施例 1 靶向 TNF-α的重组蛋白疫苗
抗 TNF-oc单克隆抗体药物在临床治疗类风湿关节炎领域获得了巨大成功，但是抗体药 物用药剂量大、使用频繁、用药成本高阻碍了更大范围的使用惠及更多患者。本实施例开 发了预防和治疗类风湿关节炎的靶向 TNF-oc的重组蛋白疫苗。
步骤 1 抗原结构设计
将表中 mTNF抗原表位序列移植替换到 DTT被替换的位置处构成， 组成相应的抗原依 次为 mTNF28、 mTNF31、 mTNF37、 mTNF25、 DTT_mTNFt、 DTT_hTNFt。 将 TNF分子的 87位酪 氨酸 Y突变为组氨酸 Η、 145位丙氨酸 Α突变为精氨酸 R得到 TNF-生物活性极低的突变体 mTNFt 和 hTNFt ( t 为定点突变）， 移植到 DTT 的 C 末端构成重组抗原 DTT_mTNFt 和 DTT-mTNFt。 本实施例中所用的其余重组抗原的结构移植信息参见表 2。
TNF重组抗原设计
-mTNFt (A145R/Y87H) 抗原蛋白氨基酸序列: EKGDQLSAEVNLPKYLDFRESGQVYFGVIAL(SEQ ID NO. :9)
VYFGVIAL (SEQ ID NO. :10) - hTNFt (A145R/Y87H) 抗原蛋白氨基酸序列:
LEKGDRLSAEINRPDYLDFRESGQVYFGI IAL (SEQ ID NO. :11)
QVYFGIIAL(SEQ ID NO. :12)
GELVDIGFAAYNFVESI INLFQVVHNSYNRP (SEQ ID NO. :13)
mTNF28的抗原蛋白的核酸序列如 SEQ ID NO. :121。 步骤 2重组蛋白的表达纯化及免疫原性观察
按照方法 2操作， 用表 3 TNF重组抗原基因引物分别构建各抗原的表达质粒， 测序 证明正确。
DTT- mTNFt (A145R/Y87H)抗原蛋白基因序列请见 SEQ ID NO. :14。
DTT- hTNFt (A145R/Y87H)抗原蛋白基因序列请见 SEQ ID NO. :15。
mTNF32抗原蛋白基因序列请见 SEQ ID NO. :16。 mTNF31抗原蛋白基因序列请见 SEQ ID NO. : 17。 表 3 TNF重组抗原基因引物
引物名称 引物序列
CGCGGATCCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATAAATCTTGATTGGGATGTC DTT-F
DTT3 (SEQ ID NO.： 18)
DTT-R CCGCTCGAGCTAGGGACGATTATACGAATTATG (SEQ ID NO. : 19) mT80- 96下
GAAAAGACAACTGCTGCTC (SEQ ID NO. : 20)
半段正 -P2
mT80- 96下
TCAACCTCCTCTCTGCCGAAAAGACAACTGCTGCTC (SEQ ID NO. : 21) 正向 -P4
mT80-96上 TCCTGGTATGAGATAGCAAATCGGCTGACAGCTGTTTCGCTATCGATAACTT (SEQ 反向 -P3 ID NO. : 22)
AGCTGTTTCGCTATCGATAACTTGC (SEQ ID NO. : 23) 半段反 -PI
mT142- 150
下半段正向 GGTAGCGTAATGGGCATTGCAGAC (SEQ ID NO. : 24) -P2
mT142- 150 TTAGACTTTGCGGAGTCCGGGCAGGTCGGTAGCGTAATGGGCATTGCAG (SEQ ID 下正向 -P4 NO. : 25)
mT142- 150 GACCTGCCCGGACTCCGCAAAGTCTAAAAGAGCAGCAGTTGTCTTTTCCAAATT (SEQ 上反向 -P3 ID NO. : 26)
mT142- 150
上半段反向 AAGAGCAGCAGTTGTCTTTTCC (SEQ ID NO. : 27)
半段正向 GAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACT (SEQ ID NO. : 28)
mT28-35下 TGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCGAAAAGACAACTGCTGCTCTTTCGATACT (SEQ mTNF37 正向 -P4 ID NO. : 29)
mT28-35上 GGCGTTGGCGCGCTGGCTCAGCCAATCGATAACTTGCGCAACGTTT (SEQ ID 反向 -P3 NO. : 30)
ATCGATAACTTGCGCAACGT (SEQ ID NO. : 31)
半段反 -PI
上半段反 CACTAGTTGGTTGTCTTTGAGATCCATGCCAGCTGTTTCGCTATCG (SEQ ID -PI NO. : 32)
下半段正 GGATCTCAAAGACAACCAACTAGTGGTGGAAAAGACAACTGCTGCTC (SEQ ID -P2 NO. : 33) 重组蛋白抗原的表达纯化按照方法 3操作， 制备出纯度达到 90%_95%的重组抗原。 小 鼠免疫操作按照方法 4， 包被抗原用 mTNF, 最终 ELISA结果显示， 抗血清稀释 100倍后， TNF28针对 mTNF的 0D45。平均值为 0· 33， mTNF31针对 mTNF的 0D45。平均值为 0· 09, mTNF37 针对 mTNF的 0D45。平均值为 0· 11，而 Alum针对 mTNF为 0D45。平均值 0. 05， TNF28比对照的 Alum组产生针对 mTNF的抗体比 mTNF31、 mTNF37都要好。 免疫之后血清 western结果显 示 TNF28组对比 DTT组（单用 DTT免疫的小鼠血清）有明显的抗体条带， 并且人 TNF条带 比小鼠 TNF条带反应信号更强 （图 2A) 。
步骤 3 蛋白突变之后的生物活性测定
取对数生长期的 L292细胞（25cm2培养瓶培养 2d)，倒掉培养液后用 lxPBS洗涤两次， 吸净 lxPBS后加入 0. 7mL 消化液 37°C消化 3min， 1000rpm/min离心 4min， 吸去消化液， 用 5mL的 1640培养液洗涤细胞 2次，以去除胰酶。用 1640培养液调整细胞浓度至 2xl07ml， 取 96孔细胞培养板， 每孔中加 0. lml L929细胞悬浮液， 在 C02培养箱中培养过夜或 24 小时， 待细胞贴满板壁 95%以上时， 方可加样。 用 AcD-1640培养基根据情况 10倍系列稀 释待测 TNF， 每孔加入稀释物 100uL， 每个稀释度 3个重复孔， 在 C02培养箱中培养 20h， 直接于每孔加入 20uL MTT (碧云天）， 37°C下孵育 4h， 用酶标仪检测波长 450nm， 参考波 长 600-650nm， 测各孔 0D 值。 杀伤率计算公式： （对照组 0D45。-实验组 0D45。） /对照组 0D45。x l00%。 最大杀伤浓度从 0. 2ng/ml降低到 100000以上（已经做到的最大浓度）， 定点 突变后， 重组蛋白的活性下降了 100000倍以上 （图 2C)。
步骤 4胶原诱导小鼠关节炎模型的观察
按照方法 5 中的步骤构建胶原诱导的小鼠关节炎模型。 针对靶抗原 mTNF28， mTNF31， mTNF37，利用改造后的表位移植蛋白 mTNF28在小鼠关节炎动物模型上相对于 Alum 对照组， 在发病分数上从 60-120天期间低 3-4分， mTNF31和 mTNF37组只相差 1_2分， mTNF28显示出由于 mTNF31和 mTNF37的治疗效果 （图 2B)。 利用定点突变后的融合蛋白 DTT-mTNFt在小鼠关节炎动物模型上相对于 Alum对照组如图 2D， 在发病分数上从 20-32 天期间低 5-6分。 DTT-mTNFt相对于 Alum对照组在发病分数上有明显抑制发病的效果。 实施例 2 TNF80-96表位疫苗的优化
步骤 1 抗原结构设计
从实施例 1中可以看出带有 TNF80-96表位的 mTNF28效果较好，因此本实施例中对该 表位进行改进。采用与实施例 1相同的方法，不同点在于采用下表所示的蛋白表位和替换 的位置构建 mTNF21、 mTNF26、 mTNF28、 mTNF30、 mTNF32、 mTNF28_l、 mTNF29系列重组蛋 白。
表 4 表位和替换的位置
mTNF32 80-96 291-297 VSRFAISYQEKVNLLSA
VSRFAISYQEKVNLLSAV (S mTNF28-l 80-97 290-297
EQ ID NO. : 34)
mTNF29 80-96 c VSRFAISYQEKVNLLSA
hTNF上 90-96氨基酸序列为：
ISRIAVSYQTKVNLLSA (SEQ ID NO. : 117)
hTNF上 90-97氨基酸序列为：
ISRIAVSYQTKVNLLSAI (SEQ ID NO. : 118) -l抗原蛋白的氨基酸序列
AQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESI INLFQVVHNSYNRP (SEQ ID NO. : 35) hTNF28- 1抗原蛋白的基因序列请见 SEQ ID NO. : 36 -l抗原蛋白的氨基酸序列
AQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESI INLFQVVHNSYNRP (SEQ ID NO. : 37) mTNF28-l 抗原蛋白的基因序列请见 SEQ ID NO. : 38
AQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESI INLFQVVHNSYNRP (SEQ ID NO. : 39) 步骤 2重组蛋白的表达纯化及免疫原性观察
具体重组蛋白抗原的构建和表达纯化方法参见方法 2 3。 制备的重组蛋白纯度都在 95%以上系列重组蛋白， 4°C放置 2天和 10天后， SDS-PAGE电泳结果表明 mTNF28_l的结 构稳定性要远优于其他蛋白。 对比 mTNF28-l和 DTT圆二色谱， 结果表明两个蛋白整个结 构式一致， 蛋白核心骨架没有变化。 针对 80-96 表位进行优化所得的一系列蛋白， 通过 DSC做的 Tm值， mTNF28-l (Tm=66. 58)与 DTT (Tm=69. 85)的 Tm值比较接近，远高于 mTNF28 (Tm=61. 01 ) 的 Tm值。 虽然 mTNF28_l与 mTNF28蛋白仅差一个氨基酸， 但是 mTNF28_l 在结构稳定性上确表现出了更高的稳定性。
抗原免疫后产生的血清的滴度如方法 4操作， 包被抗原分别为 mTNF和 DTT。 第三次 加强免疫后， 产生能应答小鼠百分比 mTNF28-l为 80%， 对 mTNF蛋白的抗血清稀释 100倍 滴度后的 0D45。平均值 0. 28 mTNF32 分别为 50%和 0. 22, mTNF21和 mTNF28分别为 25%和 0. 17， 以及 25%和 0. 15; mTNF28-l抗原性最高。 免疫结果表明， mTNF28_l相比于其他的 移植表现出了更好的免疫效果。 步骤 3胶原诱导小鼠关节炎模型的观察
第 4次加强免疫之后 60天取小鼠的血来做抗体分型，结果如图 3A所示，结果表明加 强免疫之后 60天， 小鼠体内针对 mTNF的抗体类型主要为 IgGl， 并且滴度还有 10000。说 明本发明的重组蛋白引起的免疫反应能够在体内维持较长时间。按照方法 4的方法测定了 mTNF28-l 对胶原诱导小鼠关节炎模型的治疗效果， 如图 3B 发现从第 55-80 天期间， mTNF28-l治疗组相对于 Alum佐剂组和 DTT载体蛋白组对小鼠关节炎发病抑制率达 40%以 上。 实施例 3靶向凝血因子 FXI的抗血栓疫苗
FXI为参与内源凝血途径的凝血因子，近年来的文献及病理统计数据支持， FXI缺失能 帮助机体抗血栓， 但是仅造成机体轻微出血， 因此 FXI被认为是安全有效的抗血栓靶点。 本实施例构建针对凝血因子 FXI的抗血栓疫苗， 检验其免疫原性及抗血栓效果。 步骤 1 : 重组抗原的设计
本实施例用的抗原为将人 FXI 的候选表位序列移植替换到 DTT的待移植位置构建而 成。 17号抗原为将人 FXI ( 523-538aa)氨基酸序列的 TNEECQKRYRGHKITH (SEQ ID NO. : 40) 移植替换到 DTT 的 291-297 位置构成， 20 号抗原为将人 FXI ( 363_380aa ) 的 TTKIKPRIVGGTASVRGE (SEQ ID NO.： 41)氨基酸序列移植替换到 DTT的 291-297位置构成。 29 号抗原为将人 FXI ( 381-625aa) 的催化结构域移植到 DTT的 C末端构成。 具体抗原的氨基酸序列如下：
QAIPLVGELVDIGFAAYNFVESI INLFQVVHNSYNRP (SEQ ID NO. : 42)
VAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESI INLFQVVHNSYNRP (SEQ ID NO. : 43)
29号抗原氨基酸序列: NEVWHLVGITSWGEGCAQRERPGVYTNVVEYVDWILEKTQAV (SEQ ID NO. : 44)
人 FXI ( 381-625aa) 的催化结构域氨基酸序列：
VYTNVVEYVDWILEKTQAV (SEQ ID NO. : 45)
17号抗原蛋白的基因序列请见 SEQ ID NO. : 46。
20号抗原蛋白的基因序列请见 SEQ ID NO. : 47。
29号抗原蛋白的基因序列请见 SEQ ID NO. : 48。
步骤 2: 重组抗原载体构建， 蛋白表达鉴定及规模化制备
按方法 2构建重组抗原的基因， 通过方法 3对重组蛋白进行表达鉴定及制备。 通过 12% SDS-PAGE检测， 重组抗原 29的分子量约为 45KD, 17号抗原和 29号抗原的分子量约 为 20KD, 与理论分子量相符， 抗原纯度均为 90%以上。
步骤 3: 动物免疫和抗体滴度检测
小鼠免疫方法及抗体反应检测按照方法 4进行， 其中所用小鼠为雌性 C57BL/6J (购 自上海斯莱克）， 免疫剂量为 30ng/只小鼠， 每组 8只小鼠。 第二次加强免疫后一周采血 制备血清， 通过 ELISA检测针对 FXI的抗体反应。
以人 FXI作为 ELISA包被抗原， 被 17号， 20号， 29号抗原免疫的小鼠的抗血清按 1 比 100稀释， ELISA结果 0D45。值分别为 0. 52 ±0. 11， 0. 43 ±0. 08， 2. 52 ±0. 3 (阴性血清 的值为 0. 14±0. 03)，表明 17号， 20号， 29号抗原能激发小鼠产生能识别人 FXI的抗体。
以小鼠 FXI作为 ELISA包被抗原，被 29号抗原免疫的小鼠的抗血清按 1比 100稀释， ELISA结果 0D45。值为 1. 87 ±0. 5 (阴性血清的值为 0. 14±0. 03)， 表明 29号抗原激发小鼠 产生的抗体能通过交叉反应识别小鼠的 FXI。 步骤 4: 免疫对小鼠凝血时间的作用
小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法 4，其中所用小鼠为雌性 C57BL/6J (购自 上海斯莱克）， 免疫剂量为 30ng/只小鼠， 每组 5只小鼠。 第二次加强免疫后 14天， 小鼠 用戊巴比妥钠麻醉（100mg/kg经腹腔注射）。 沿腹中线切口， 翻开内脏暴露下腔静脉。 用 含 50ul 3. 2%枸橼酸钠的注射器抽取 450ul血液， 轻轻转动注射器使血液和抗凝剂混匀。 所有样品室温 3000g离心 15min制备不含血小板的血浆。 APTT值和 PT值在 4h内分别用 活化部分凝血活酶时间测定试剂盒（鞣花酸） （凝固法）， 凝血酶原时间测定试剂盒（凝固 法） （上海太阳生物技术有限公司） 在 thromboscreen 400c (pacific hemostasis) 半自 动凝血分析仪上测定。
被 PBS， DTT， 17号抗原， 29号抗原免疫的小鼠的 APTT值分别为 25. 2 ± 1. 8s， 24. 5 ± 2. Is, 26. 7 ± 1. 8s， 30. 3 ± 2. 5s。被 PBS免疫的小鼠 APTT值与野生型小鼠的值相近（野 生型小鼠的 APTT值为 25. ls)， 表明 PBS不会干扰机体内源凝血途径功能。 被 29号抗原 免疫的小鼠的 APTT值相对于 PBS组小鼠的值延长了 1. 2倍（p〈0. 05， t检验）， 表明该抗 原能抑制 FXI所参与的内源凝血途径的功能。
被 PBS， DTT， 17号抗原， 29号抗原免疫的小鼠的 PT值分别为 10. 4 ± 0. 2s， 10. 6士 0. Is, 10. 2 ± 0. 2s, 11. 2 ± 0. ls。 被 17号抗原免疫的小鼠的 PT值没有显著延长， 而被 29号抗原免疫的小鼠的 PT仅轻微延长 （无临床意义）， 表明所设计的重组抗原不会干扰 正常的外源凝血途径的功能。 步骤 5: 抗原对肺栓塞血栓的预防
小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法 4，其中所用小鼠为雌性 C57BL/6J (购自 上海斯莱克）， 免疫剂量为 30ng/只小鼠， 每组 8只小鼠。 第二次加强免疫后 14天， 通过 致死肺栓塞模型评价各组小鼠抗血栓效果。 具体步骤如下： thromborel s (S i emens) 按 说明书要求用 10ml蒸熘水复溶。 小鼠用戊巴比妥钠按 50mg/kg腹腔注射麻醉后， 分离暴 露下腔静脉。 按 7. 5ul/g的体重将复溶后的 thromborel s在 3s内注入下腔静脉， 立刻计 时， 观察动物呼吸有无， 20分钟时动物呼吸不停止即认为动物存活。
如图 4A所示， 被 PBS， DTT， 17号， 20号， 29号抗原免疫的小鼠在第 20分钟的存活 率分别为 20%， 0%, 37. 5%， 25%, 50%, 表明 17号和 29号抗原能帮助小鼠抗肺栓塞。
小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法 4，其中所用小鼠为雌性 C57BL/6J (购自 上海斯莱克）， 免疫剂量为 30ng/只小鼠， 每组 14只小鼠。 第二次加强免疫后 14天， 通 过肺栓塞模型评价 29号抗原的抗血栓效果。 小鼠用戊巴比妥钠按 50mg/kg腹腔注射麻醉 后， 分离暴露下腔静脉。 按 30ug人胎盘浸出液 /g体重的剂量从下腔静脉注射， 记录各组 小鼠开始出现呼吸困难的时间。
如图 4B所示，被 PBS， DTT及 29号抗原免疫的小鼠的发生呼吸困难的时间分别为 121 ± 21s， 118 ± 35s， 182 ± 33s， 被 29号抗原免疫的小鼠发生呼吸困难的时间延长 1. 5倍 (p&0. 01 , t检验）， 表明 29号抗原能帮助小鼠抗肺栓塞。 步骤 6: 抗原对下腔静脉狭窄血栓的预防
小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法 4，其中所用小鼠为雌性 C57BL/6J (购自 上海斯莱克）， 免疫剂量为 30ng/只小鼠， 每组 6只小鼠。 第二次加强免疫后 14天， 通过 下腔静脉狭窄血栓模型评价 29 号抗原的抗血栓效果。 具体步骤如下： 小鼠称重， 按 100mg/kg 体重用戊巴比妥钠麻醉， 腹部剃毛， 涂碘伏消毒。 用眼科剪小心开腹， 翻出内 脏用浸有生理盐水的纱布包好，暴露出下腔静脉，在左肾静脉支流下方分离下腔静脉和腹 主动脉， 用 6-0丝线（上海金环）将下腔静脉结扎到 30g针头上。 除去针头， 造成静脉狭 窄。在腰支流部位分离下腔静脉和腹主动脉，在结扎线下方及腰直流部位分别用两个血管 夹夹闭血管各 20s。并记录下操作时刻。将肠子有序放回腹腔， 用 5-0尼龙线（上海金环） 依次缝合肌肉和皮肤， 涂碘伏消毒后放回洁净笼子。 24h后取出栓子， 生理盐水漂洗后， 用 4%多聚甲醛固定 24h以上， 拍照。 用滤纸吸干后称湿重。
如 4C、 4D所示， 被 PBS， DTT, 29号抗原免疫的小鼠的栓子分别为 11. 2 ± 2. lmg, 8. 2 ± 4. 5mg， 4. 5 ± 2. 3mg， 被 29号抗原免疫的小鼠体内的栓子相对于对照组小鼠栓子的 重量减小 60%， 表明 29号抗原能帮助小鼠预防下腔静脉狭窄血栓。 步骤 7抗体对人血桨的 APTT值及 PT值的影响
被各抗原免疫的小鼠的血浆中的抗体用蛋白 A-sepharose介质纯化后用 BCA定量试 剂盒定量， 用 10mM PBS (pH7. 4) 稀释后， 跟人血浆 1比 1体积比混合后， 测 APTT值， PT值， 及 FXI的活性。
29号抗原激发小鼠产生的抗体能显著延长正常人血浆的 APTT值， 且该抑制效果存 在明显的量效关系 （如图 5A所示）， 0. 75mg/ml终浓度的抗体能使正常人血浆的 APTT值 延长到 151s， 对照组值为 54s。 29号抗原激发小鼠产生的抗体能显著抑制人 FXI的活性， 且该抑制效果存在明显的量效关系 （如图 5B所示）， 抗体（0. 75mg/ml终浓度）与正常人 血浆混合后， 抗体血浆混合物加入到乏 FXI人血浆中， 后者 APTT值延长到 121s， 对照组 值为 63s。
正常人血浆分别与被 29号抗原和 DTT激发小鼠产生的抗体孵育后测 PT值分别为 41s, 42s, 表面 29号抗原激发小鼠产生的抗体不会干扰人的正常止血所必须的外源凝血 途径的功能。
步骤 8 抗原安全性检测
通过 PT测试， 29号抗原不影响小鼠的外源凝血通路的功能， 表明这个抗原没有 出血毒副作用。 为了进一步说明抗原的安全性， 本发明检查了小鼠体表及内脏有无出 血。 通过解剖比较， 发现 DTT， 29号抗原免疫组小鼠各内脏 （心肝脾肺肾肠胃等） 上 均无异常出血点。 此外还检查了小鼠肝脏的形态色泽。 肉眼观察结果显示， 29号抗 原免疫组小鼠肝脏的形态和色泽与 DTT免疫组的小鼠无差异。 实施例 4靶向凝血因子 FXII的抗血栓疫苗
FXII为参与内源凝血途径的凝血因子， 近年来的文献及病理统计数据支持， FXII 缺失能帮助机体抗血栓， 但是机体无异常出血， 因此 FXII被认为是安全有效的抗血栓 靶点。本实施例构建针对凝血因子 FXII的抗血栓疫苗，检验其免疫原性及抗血栓效果。 步骤 1 : 重组抗原的设计
本实施例用的抗原为将人 FXII的候选表位序列移植替换到 DTT的待移植位置构 建而成。 38号抗原为将人？ 11的? ？8? 8?(^101^ ( 79-91 ) (SEQ ID NO. : 128)氨基 酸序列移植替换到 DTT的 295-297位置构成， 48号抗原为将人 FXII的催化结构域 ( 345-596 ) 移植到 DTT的 C末端构成。 mFXII79-91位氨基酸
EGF S SIT YQHDL A(SEQ ID NO. : 131) hFXII的催化结构域 （345-596) GDRNKPGVYTDVAYYLAWIREHTVS (SEQ ID NO. :129) mFXII的催化结构域 （345-596)
GDRNKPGVYTDVANYLAWIQKHIAS (SEQ ID NO. :130)
(SEQ ID NO. :113)
LVCEDQAAERRLTLQGIISWGSGCGDRNKPGVYTDVAYYLAWIREHTVS (SEQ ID NO. :114) 编码 38号抗原的核酸序列请见 SEQ ID NO. :115。 编码 48号抗原的核酸序列请见 SEQ ID NO. :116。 步骤 2: 重组抗原载体构建， 蛋白表达鉴定及规模化制备
按方法 2构建重组抗原的基因， 通过方法 3对重组蛋白进行表达鉴定及制备。通过 12% SDS-PAGE检测，重组抗原 48的分子量约为 45KD, 38号抗原的分子量约为 20KD, 与理论分子量相符， 抗原纯度均为 90%以上。 步骤 3: 动物免疫和抗体滴度检测
小鼠免疫方法及抗体反应检测参考方法 4， 其中所用小鼠为雌性 C57BL/6J (购自 上海斯莱克） ， 免疫剂量为 30ng/只小鼠， 每组 8只小鼠。 第二次加强免疫后一周采血 制备血清， 通过 ELIS A检测针对 FXII的抗体反应。
以人 FXII作为 ELISA包被抗原， 被 38号， 48号抗原免疫的小鼠的抗血清按 1比 100 稀释， 00450值分别为0.38±0.07， 1.32 ±0.51 (阴性血清的值为 0.11 ±0.03 ) ， 表明 38 号， 48号抗原能激发小鼠产生能识别人 FXII的抗体。
以小鼠 FXII作为 ELISA包被抗原， 被 38号， 48号抗原免疫的小鼠的抗血清按 1比 100稀释， 00450值分别为0.11±0.04， 1.75±0.21 (阴性血清的值为 0.12 ± 0.03 ) ， 表 明 48号抗原激发小鼠产生的抗体能通过交叉反应识别小鼠的 FXII。
步骤 4: 免疫对小鼠凝血时间的作用
小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法 4，无血小板的血浆制备和 APTT值和 PT值测定按照实施例 3步骤 4。
被 PBS， DTT, 38号抗原， 48号抗原免疫的小鼠的 APTT值分别为 25.2±1.8s， 24.5 ±2. Is, 31.2±3.2s， 27.1±5.1s。 被 PBS或 DTT免疫的小鼠 APTT值与野生型小鼠的值 相近 （野生型小鼠的 APTT值为 25. Is) ， 表明 PBS或 DTT不会干扰机体内源凝血途径 功能。被 38号抗原免疫的小鼠的 APTT值相对于 PBS组小鼠的值延长了 1.24倍（p&0.05， t检验） ， 表明该抗原能抑制 FXII所参与的内源凝血途径的功能。
被 PBS， DTT, 38号抗原， 48号抗原免疫的小鼠的 PT值分别为 10.4±0.2s， 10.6 ±0.1s， 10.1±0.5s， 10.2±0.4s。 被 PBS或 DTT免疫的小鼠 PT值与野生型小鼠的值相 近（野生型小鼠的 PT值为 10.6s)，表明 PBS或 DTT不会干扰机体外源凝血途径的功能。 被 38号或 48号抗原免疫的小鼠的 PT值没有显著延长，表明所设计的重组抗原不会干扰 小鼠外源凝血途径的功能。 2.5mg华法林溶于 800ml饮用水中让小鼠自由饮用三天， 小 鼠的 PT值为 60.1±38.7s， 相对于野生型小鼠的 PT值延长了 5.7倍， 该结果表明相对于 临床上常用的抗凝药物华法林， 本专利抗原免疫不会造成机体异常出血。 步骤 5: 抗原对肺栓塞血栓的预防
小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法 4，肺栓塞血栓实验操作按照实施例 3 步骤 5。
被 PBS，DTT， 38号抗原免疫的小鼠在第 20分钟的存活率分别为 20%， 0%, 37.5%,， 表明 38号抗原能帮助小鼠抗肺栓塞。 步骤 6: 抗原对下腔静脉狭窄血栓的预防
小鼠免疫方法参照及抗体反应检测参考方法 4， 下腔静脉狭窄血栓实验按照实施 例 3步骤 6。
实验结果如图 6所示， 被 PBS， DTT, 38， 48号抗原免疫的小鼠的栓子分别为 11.2±2.1mg， 8.2±4.5mg， 4.7±2.7mg， 4.8±2.5mg， 被 38号， 48号抗原免疫的小 鼠体内的栓子相对于 PBS对照组小鼠栓子的重量分别减小 58%， 57%, 表明 38号， 48号抗原能帮助小鼠预防下腔静脉狭窄血栓。 实施例 5 以 FAP为靶点的肿瘤疫苗开发
成纤维细胞活化蛋白 （fibroblast activation protein, FAP) 是特异性表达于肿瘤 相关成纤维细胞 (carnicinoma associated fibroblasts, CAFs) 的一种膜蛋白， 其胞浆 区为一段 6个氨基酸的短肽链， 跨膜区为一段 19个氨基酸的疏水片段， 胞外区包含一个 β 螺旋区域和一个 α β 水解酶区域 （氨基酸序列 500?760)。 FAP特异性表达于恶性上 皮肿瘤 （包括乳腺癌、 肺癌、 结肠癌等） 的基质中， 而在正常人体组织中无表达。 FAP在 肿瘤相关成纤维细胞上的表达对于形成肿瘤生长的微环境较为重要。研究表明过表达 FAP 会促进肿瘤微血管的生成并促进肿瘤生长，而敲除 FAP可以抑制肿瘤免疫逃逸，实现机体 对肿瘤的免疫应答。 此外， FAP与肿瘤抗原相比， 基因组更为稳定。 因此， 许多研究者选 取 FAP作为肿瘤治疗靶点。 FAP酶活性抑制剂在动物实验中表现出良好的抗肿瘤效果， 目 前已进入临床实验。靶向 FAP的 DNA疫苗在动物实验中激发了 CTL效应，表现出良好的抗 肿瘤效果。 因此， 本专利选取 FAP作为靶点， 开发肿瘤疫苗并研究其免疫原性及抗肿瘤效 果。 步骤 1重组抗原的设计
参照方法 1， 将人 FAP的催化结构域 （氨基酸序列 500?760 ) 与 DTT的 C端融合， 设计了结构域疫苗 DTT-FAP。另外，参照方法 1将 FAP表位序列 239-246 (YGDEQYPR (SEQ ID NO. : 49) )替换 DTT的氨基酸序列 291-297 ( SETADNLE), 设计了单表位疫苗 DTT_4B。抗原 氨基酸序列如下： -FAP氨基酸序列
YLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSD (SEQ ID NO. : 50)
注： DDDK为肠激酶切位点， 为促进融合蛋白原核可溶表达； GGGGG 5个甘氨酸残基， 作为 1 inker。
AMWYSDQNHGLSGL