一种快速提取丝状真菌染色体DNA的方法
随着真菌分子生物学研究的深入开展,简便快捷地提取真菌染色体DNA对于从基因水平上揭示真菌这一类生物体的适应性进化、变异、系统发育关系等显得越来越为重要。迄今,对于从丝状真菌中提取染色体DNA的方法已有许多研究[1~4],其中较为有效的方法主要是酶解法、氯化苄法等[1,4]。但由于真菌的细胞壁结构坚固,次生代谢产物丰富等对其染色体DNA的提取带来一定困难,使现有这些方法分别存在操作繁琐、成本较高、毒性较大等局限或不足[5,6]。石英砂在研磨破碎植物组织中已有许多应用[7],但在提取丝状真菌染色体DNA中似未见报道[5,6]。本研究旨在建立一种以石英砂研磨为手段的简便、快速、安全、廉价的提取丝状真菌染色体DNA大片段的方法,并获得较高质量的染色体DNA,为进一步开展深入细致的分子生物学研究奠定基础。1材料与方法1·1供试菌株及其培养基粗糙脉孢菌(Neurospora crassa),米曲霉(Aspergillusoryzae),产黄...&
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随着真菌分子生物学研究的进展,简便快捷地提取真菌染色体DNA的方法对真菌分子生物学的研究日显其重要的意义。真菌的细胞壁结构坚固,次生代谢产物丰富等特点对其染色体的提取造成一定困难。目前,提取真菌染色体DNA的方法主要有:机械研磨法、酶解制备原生质体法、氯化苄法等[1 ]。其中机械研磨法常采用液氮研磨,主要是借助超低温的液氮使真菌的细胞壁变脆,再通过研磨破坏细胞壁使染色体释放出来。此法需要收集较大量的菌体,在提取时为保证研磨充分常常导致染色体DNA受机械剪切力过度而形成碎片,操作过程不太容易掌握。酶解制备原生质体法则受到酶的质量的影响,成本也较高,而且需摸索形成原生质体的适宜条件。氯化苄法在提取某些食用真菌时,几乎没有破壁的作用[2 ]。本文提供的方法与以上所述方法相比,具有操作步骤简单,操作时间短,不需特殊的仪器和药品等特点。本法所提的染色体DNA均大于2 0kb ,可直接用于限制性酶切,PCR等分子生物学研究。1　材料与方法1...&
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1概述丝状真菌作为低等的真核生物,对人类生命活动的各个方面均产生了深远的影响,为了控制真菌对人类不利的一面,充分利用其有益的特性服务于人类,就必须深入的了解其生理、遗传以及分子生物学方面的信息,并通过分子生物学手段对其进行有效改造。真菌是一类具有独特的形态学、生理学特征的真核生物,诸如生长形态丝状或酵母状;具有坚硬的几丁质细胞壁;具顶端生长特性;营腐生或寄生生活;孢子繁殖;基因组相对较小;多余DNA含量少等特点。由于丝状真菌能将现代分子生物学技术与经典的遗传学技术很好的结合在一起,使得丝状真菌成为进行分子遗传学理论研究极好的模式生物。分子遗传学研究的一个关键因素在于遗传转化系统的研究和发展。遗传转化技术的发展对于人们进一步分离基因和分析基因的功能提供了强有力的工具,目前遗传转化技术已经广泛的应用于原核生物和真核生物。自1973年M ishra和Tatum[1]首次报道粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的DNA转化以...&
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真菌在临床引起的感染率逐年增加,已经成为导致患者死亡的重要原因之一,得到医务人员的广泛注意。但是,其中丝状真菌引起的感染并未得到人们的足够重视。在日常病原微生物的鉴定中,检验人员往往将培养基上生长的丝状真菌菌落误认为是腐生菌或污染菌而丢弃,结果造成丝状真菌感染的漏诊,延误救治机会。本文报告了4份典型丝状真菌感染病例,以提示同行及临床医生应重视丝状真菌感染的诊断与治疗。1临床资料病例1,男,39岁。5月9日因全身多处刀刺伤,右侧胸腹联合伤,在当地医院行剖腹探查术,对右肾裂伤、右肝叶裂伤行修补缝合术后,因止血无效,致失血性休克,于5月10日转入本院创伤科救治。入院后,查血常规示白细胞总数11.2×109/L,尿素13.3mmol/L,肌酐332.6μmol/L,并立即行剖腹探查术,见右肾周血肿,右肾伤口出血,行右肾切除术。术后除予输血、补液、止血、纠正酸中毒等处理外,用头孢米诺钠、甲硝唑抗感染治疗。3d后,因消耗性凝血病,出现鼻腔吸...&
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通过微生物来表达蛋白越来越受到青睐,相比于其它表达系统,丝状真菌具有表达量大、分泌率高、分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞等特点,使其能进行各种翻译后加工,此外丝状真菌还具有良好的安全性,发酵程序较成熟,且成本较低,越来越受到人们的重视。在丝状真菌中实现高效表达的同源或异源蛋白很多,但是酶的高效表达与多个因素相关:宿主自身的特征,插入的外源基因或表达宿主自身的特征以及两者之间的不相容性或者相互影响而产生的一系列变化,使目的蛋白基因在表达宿主中很难实现高效表达。为了实现在丝状真菌中异源蛋白的高效表达,可以从两个方面来控制,一方面提高目的蛋白的表达量;另一方面抑制其它蛋白的分泌。其策略也可以从两方面来控制:一是外界条件,主要包括p H、温度、培养基等;二是基因的构建,主要包括使用高效强启动子、使用融合蛋白、使用转录因子、使用CCAAT图案的功能元件、构建蛋白酶缺陷株、增强基因拷贝数、构建高效的表达盒子、使用CRISPR/Cas9技术...&
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近年来,侵袭性真菌感染呈逐渐上升趋势[1,2],血液系统疾病、糖尿病、肿瘤相关疾病、老年病、艾滋病等患者成为侵袭性真菌感染的高危人群,广谱抗菌药的使用、各种导管介入等侵入性操作、干预免疫系统的制剂、放化疗等治疗方法称为真菌感染的诱发因素。丝状真菌感染临床症状和后果都更加严重,其中曲霉菌感染的病死率可高达50%以上[3]。为了解丝状真菌感染临床分布特点,以某医院住院患者为对象,对病人送检标本检测结果进行了调查,分析和了解丝状真菌感染的临床分布、标本种类分布和感染部位分布,为有效防控真菌感染提供参考。1资料与方法1.1资料来源选择烟台驻军某医院日-日期间住院患者为对象,收集患者送检标本丝状真菌检测结果。1.2检测方法1.2.1标本采集由各临床科室负责标本的采集。参照《全国临床检验操作规程》,根据感染部位采用不同的方法采集标本直接送该医院细菌室进行检验。1.2.2标本检测将送检标本接种于哥伦比亚血平板...&
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近年来,由于器官移植、免疫抑制剂使用、侵入性治疗、恶性肿瘤、HIV感染等患者逐年增多,以及广谱抗菌药物的广泛应用,丝状真菌的感染比例呈上升趋势。很多丝状真菌生长缓慢,传统的基于培养的形态学鉴定方法耗时长,操作繁琐且鉴定能力有限[1-2],给临床早期诊断和抗真菌治疗带来困难。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assis-ted laser desorption ionization-time-of-flight mass spec-trometry,MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种新的鉴定技术,具有敏感性高和特异性强的特点,可快速、准确鉴定细菌和真菌[3-5]。目前国际上对于抗真菌体外药物敏感试验结果的判读缺乏解释标准,通常用50%最低抑菌浓度(50%minimal inhibi-tory concentration,MIC50)和MIC90来反映抗真菌药物的活性。本研究主要评估MALDI-TOF M...&
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92一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法
第１４卷第２期２０１０年４月Ｌｉｆｅ生命科学研究；作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被；陈锋菊，李百元，杨冰，张叶纯，CHENFeng-；湖南科技大学生命科学学院,中国湖南,湘潭,411；LIFESCIENCERESEARCH2010，；参考文献(12条)；1.WHITETJ;BRUNST;LEESAna；2.孙立夫;张艳华;裴克全一种高效提取真
第１４卷第２期２０１０年４月Ｌｉｆｅ生命科学研究ＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＶ０１．１４Ｎｏ．２Ａｐｒ．２０１０一种经济快速提取丝状真菌基因组ＤＮＡ的方法陈锋菊，李百元，杨冰，张叶纯（湖南科技大学生命科学学院，中国湖南湘潭４１１２０１）摘要：以螺旋木霉（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｉｒａｌｅＸＸ）、小克银汉霉（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａｐｈａｅｏｓｐｏｒａＭＫ）和卵形孢球托霉（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａｂｕｔ／ｅｒ／ＸＴ）３种丝状真菌为材料。采用改进的ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ．方法改进后无需液氮、聚乙烯砒略烷酮（ＰＶＰ）和ＮａＡｃ等试剂，过程简洁，且所需茵体量少，提取的ＤＮＡ纯度较好，适用于一次微量提取多个样品的基因组ＤＮＡ．此方法得到的基因组ＤＮＡ可用于ＰｃＲ扩增．关键词：丝状真菌；基因组ＤＮＡ；ＣＴＡＢ法；ＰＣＲ中图分类号：Ｑ９３６文献标识码：Ａ文章编号：１００７．７８４７（２０１０）０２－０１２２－０３ＡｎＥｃｏｎｏｍｉｃａｌａｎｄＲａｐｉｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｆｏｒＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉＣＨＥＮＦｅｎｇ－ｊｕ，ＬＩＤＮＡｏｆｔｈｅＢａｉ―ｙｕａｎ，ＹＡＮＧＢｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＹｅ－ｃｈｕｎ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬ咖Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌ－ｌｕｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉａｎｇｔａｎ４１１２０１，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＧｅｎｏｍｉｃｐｈａｅｏｓｐｏｒａＭＫａｎｄｔｈｒｅｅｂｕｔｌｅｒｉｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓＸＴｗｅｒｅｆｕｎｇｉＺ托ｂｄｅ册ａｗｉｔｈａｓｐｉｒａｌｅＸＸ，ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａＡｍｍｏｎｉｕｍＧｏｎｇｒｏｎｅｌｌａｅｘｔｒａｃｔｅｄｍｏｄｉｆｉｅｄＣｅｔｙｈｒｉｍｅｔｈｙｌＢｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｉｍｐｒｏｕｅｄｍｅｔｈｏｄｄｏｅｓｎｏｔｒｅｑｕｉｒｅｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＶＰａｎｄＮａＡｃｅｔｃ．Ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｗａｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ。ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｈｉｇｈｅｒｐｕｒｉｔｙｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡＷｔｔ￥ｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｌｅｓｓａｍｏｕｎｔｏｆｍｙｃｅｌｉｕｍｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗｈｉｃｈｗａｓｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｔｒｅａｔｍａｎｙｓａｍｐｌｅｓａｔａｓｏｎｅｔｉｍｅ。ａｎｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｕｒｂａｓｉｃｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｕｃｈＫｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓＰＣＲ．ｆｕｎｇｉ；ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ；ＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ；ＰＣＲ（￡施ＳｃｉｅｎｅｅＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，１４（２）：１２２―１２４）通常真菌的传统分类鉴定依据主要采用形态学和生理学方面的特征，但这些方法很易受到培养条件的影响，如有名的生防真菌一木霉在土豆葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）和玉米葡萄糖琼脂培养基（ＣＭＤ）上培养时，其培养特征差异非常显著。而真菌的现代分类鉴定则是结合形态学、生理学以及ＤＮＡ分子水平等多方面进行综合鉴定．ＤＮＡ提取是分子水平鉴定的第一步．有关丝状真菌基因组ＤＮＡ提取的方法有很多ｃ１剖，但过程大多较繁琐，周期长或需加入某些特殊试剂．基收稿日期：２００９一ｌＯ．３０；修回１５１期：２０１０－０１．２１基金项目：湖南省教育厅基金资助项目（Ｂ３０９３９）于经济、快速、高效原则，本研究探索了一种在一般实验室里切实可行的丝状真菌ＤＮＡ的提取方法．１材料与方法１．１菌株螺旋木霉（Ｔｒ／ｃｈｏｄｅｒｍａ印ｉｒａ＆ＸＸ）、小克银汉霉（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａｐｈａｅｏｓｐｏｒａＭＫ）和卵形孢球托霉（ＧｏｎｇｒｏｎｅｌｌａｂｕｔｌｅｒｉＸＴ）３种丝状真菌均从土壤中筛选得到，现保存于本实验室．作者简介：陈锋菊（１９７３－），女，湖南桑植人，湖南科技大学讲师，硕士．主要从事生物化学与分子生物学研究，Ｅ－ｍａｉｈｃｈｅｎｆｅｎｇｊｕ５２６＠１６３．ｃｏｍ．万方数据第２期陈锋菊等：一种经济快速提取丝状真菌基因组ＤＮＡ的方法１．２试剂ＤＮＡＴａｑ酶、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２００和ＡＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢ购自天根生化（北京）科技有限公司，引物由上海生工合成．其它试剂均为国产分析纯．１．３菌体培养与收集将已分离纯化的３种丝状真菌分别接种于装有４０ｍＬＣＭＤ液体培养基（玉米粉２０ｇ，葡萄糖２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ）的１００ｍＬ的三角瓶中，置于２６―２８℃下摇瓶培养１～２ｄ后，１００００ｒ／ｒａｉｎ离心５ｍｉｎ收集菌体，用多层灭菌滤纸将菌体充分吸干．１．４基因组ＤＮＡ的提取１）取出事先冷冻的研钵，放置在冰块上，取适量吸干的新鲜菌丝体，加适量的２×ＣＴＡＢ提取液（含０．７％ＮａＣＩ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣＩｐＨ８．０，２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，２０ｇ／ＬＣＴＡＢ），２－５斗Ｌ肛巯基乙醇和适量的灭菌普通细砂，在研钵中迅速将菌体充分研磨；２）研磨后迅速将菌液移入１５ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄ－ｏｆｆ管中，于６５℃下水浴３０ｍｉｎ，水浴过程中颠倒２～３次；３）菌液摇匀后加等体积的氯仿：异戊醇混合液（２４：ｌ，Ｖ／Ｖ）充分混匀，４℃下１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；４）将上清夜移至另一新的Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ管中，加２．５倍体积的冰冻无水乙醇，轻轻摇匀，等沉淀出现后，４ｏＣ下８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；５）弃上清夜，沉淀用７０％的酒精洗涤两次，在电烤炉的上方２０ｃｍ左右（以不烫手为准）烘干，加５０～１００ｔｒＬ的１Ｅ缓冲液（含１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ，ｌｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）充分溶解（如果溶解较慢可置于３７℃水浴器中促溶）；６）加入５斗Ｌ浓度为１０ｇ／Ｌ的ＲＮＡ酶，于６５℃消化４０ｍｉｎ；７）重复步骤３～５，所提ＤＮＡ溶液于一２０℃下保存备用．１．５ＤＮＡ质量的紫外检测按照文献【７】的方法进行ＤＮＡ浓度和纯度的检测．１．６ＩＴＳ和１８ＳｒＤＮＡ序列的ＰＣＲ扩增ＩＴＳ序列的ＰＣＲ扩增采用通用引物Ｌ９］：ＩＴＳｌ（５’．ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３’）和ＩＴｓ４（５’．ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ．３’）．反应总体系５０斗Ｌ，包括１０×ＰＣＲ缓冲液５ｔｒＬ，Ｍ矛＋（２５万方数据ｍｍｏｌ／Ｌ）３¨Ｌ，ｄＮＴＰ混合物（１０ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）１斗Ｌ，ＩＴＳｌ和ＩＴＳ４（浓度均为２５Ｉ上ｍｏｌ／Ｌ）各１¨Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．４ｐＬ（５Ｕ／¨Ｌ），模板２ｐＬ，无菌水加至５０¨Ｌ．ＰＣＲ反应程序为９４℃５ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃４０ｓ，３０个循环后再７２℃延伸８ｒａｉｎ．ＰＣＲ产物电泳染色后，用凝胶成像系统拍照．１８ＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增采用通用引物对【ｍ］：ＮＳＩ（５’．ＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣｌＴ】陋ＴＣＴＣ一３７）和ＮＳ８（５’－ＴＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡ．３’）．反应总体系５０ｐＬ，包括１０×ＰＣＲ缓冲液５ＩｘＬ，Ｍ矛＋（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）３ｐＬＬ，ｄＮＴＰ混合物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１斗Ｌ，ＮＳＩ和ＮＳ８（浓度均为２５Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ）各ｌ斗Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．４斗Ｌ（５Ｕ，斗Ｌ），模板２斗Ｌ，无菌水加至５０此．ＰＣＲ反应程序为９４℃３ｍｉｎ，９４℃５０ｓ，５２℃ｌｍｉｎ，７２ｏＣ５０ｓ，３０个循环后再７２℃延伸８ｍｉｎ．ＰＣＲ产物电泳染色后，用凝胶成像系统拍照．２结果２．１基因组ＤＮＡ的完整性取上述方法提取的基因组ＤＮＡ５ＩｘＬ进行１．５％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示该方法提取的基因组完整性较好，主条带明显，初步表明本改良方法提取ＤＮＡ是可行的（图１）．图ｌ提取真菌的基因组ＤＮＡ电泳图谱Ｍ、ｌ、２、３和Ｃ分别代表ＡＤＮＡ／ＨｉｎｄｌｌＩＭａｒｋｅｒ、螺旋木霉ＸＸ、小克银汉霉ＭＫ、卵形孢球托霉ＸＴ和空白对照．Ｆｉｇ．１ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆｔｈｒｅｅｓｔｒａｉｎｓｏｆＦｕｎｇｕｓＭ。１．２．３ａｎｄＣｄｅｎｏｔｅＡＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ，Ｔ．ＳｐｉｒａｌｅＸＸ，Ｃ．ｐｈａｅｏｓｏｏｒａＭＫ。Ｇ．ｂｕｔｌｅｆｉＸＴａｎｄｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｒｅｓｐｅｃ―ｔｉｖｅｌｙ．２．２ＤＮＡ的紫外检测结果利用紫外分光光度计测定本方法提取的ＤＮＡ的浓度可达到４６０－６７０ｍｇ／Ｌ，比传统方法１２４生命科学研究２０ｌＯ年（仅为３２５―３９０ｍｇ／Ｌ）要高得多，但比张颖慧等盯】报道的要稍低；改进后获得的ＤＮＡ，ＵＶ检测结果显示，其ＤＤ瑚／ＯＤ挪比值范围在１．８―２．０之间．说明用本方法提取所得基因组ＤＮＡ的得率较高，纯度较好．２．３ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增结果利用真菌ＩＴＳ和１８ＳｒＤＮＡ序列的通用引物对本改良方法提取的３种真菌的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ检测，结果见图２．由图可知，３种丝状真菌的ＩＴＳ序列大小约０．６ｋｂ左右（图２左），１８ＳｒＤＮＡ序列大小约１．７ｋｂ左右（图２右），条带单一、清晰整齐，ＰＣＲ结果良好．说明该方法提取的基因组ＤＮＡ适合用于ＰＣＲ检测，可用于一般的分子生物学研究．图２基因组ＤＮＡＰＣＲ电泳圈左：ＩＴＳ；右：１８ＳＲｄｎａ；Ｍ、ｌ、２、３和Ｃ分别表示ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２００、ＸＴ、ＭＫ、ＸＸ和空白对照．Ｆｉｇ．２ＰＣＲａｍｐｌｍｃａｔｉｏｎｏｆＩＴＳ（１ｅｆｔ）ａｎｄ１８ＳｒＤＮＡ（ｒｉｇｈｔ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓＭ，ｌ，２，３ａｎｄＣｄｅｎｏｔｅＤＮＡＭａｒｋｅｒ２００，ＸＴ。ＭＫ，ＸＸａｎｄｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．３讨论基因组ＤＮＡ的提取技术是真菌分子鉴定及其相关分子生物学研究中一项最基本的操作技术，所提取的基因组ＤＮＡ质量的好坏会直接影响后续的实验操作，如ＰＣＲ、酶切和杂交等．目前，已报道的真菌ＤＮＡ的提取技术主要采用ＳＤＳ、ＣＴＡＢ或其改良法‘ｌｌ，１２］．其区别主要在于破壁方法以及破壁后分离核酸、蛋白质方面的不同，但均包括真菌细胞肇的裂解，真菌细胞膜的破坏，达到ＤＮＡ的释放以及真菌的纯化步骤．传统的破壁包括机械破壁、超声波破壁、玻璃珠万方数据破壁等．核酸分离包括经典的酚、氯仿抽提。以及商品化的纯化柱、纯化膜分离法等．经典的酚、氯仿抽提法涉及到毒性较大的苯酚，而商品化的试剂盒虽然操作简单、高效，ＤＮＡ质量较高，但价格昂贵，不太适用于经费较低的一般实验室．本研究中ＤＮＡ提取法的优点主要是经济、简单，不需特殊的仪器和药品．表现在：不需液氮；研磨砂采用筛选的普通砂粒；提取过程中无需苯酚、ＰＶＰ和ＮａＡｃ等．需要注意的事项有：１）研钵需进行低温预处理，研磨时研钵必须置于冰块上，时间最好严格控制在２ｍｉｎ内，以尽可能地降低ＤＮＡ的降解；２）研磨加入的ＣＴＡＢ的量随菌丝量的变化而变化．一般表征是研磨后的匀浆液不宜太粘稠，以防止加入氯仿／异戊醇抽提时难以分散；３）有时，缓冲液中不加ＰＶＰ，可能会导致最终ＤＮＡ产物比较难溶于ＴＥ缓冲液，但这并不影响后续过程，只需吸取溶解的ＤＮＡ溶液放入新的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，不会影响ＤＮＡ质量，但会影响产量；４）若加入无水乙醇后沉淀不明显，可将此Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管于一２０℃下放置２０ｍｉｎ促进沉淀；５）采用电烤炉烘干时，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管口不宜离火太近，一般在２０ｃｍ左右即可，其最终表征是以闻到乙醇气味为准；６）选用的砂粒需过筛使颗粒大小均匀适中，以便研磨均匀．事实上，运用该方法，本研究室还相继从木霉、毛壳菌、青霉菌和红曲霉中克隆到了蛋白质延伸因子ＥＦｌ和几丁质酶基因，进一步表明该方法是切实可行的．致谢：本研究中的小克银汉霉和卵形孢球托霉的鉴定由中科院微生物所的郑儒永院士完成．在此表示衷心地感谢！参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：【ｌ】ＪＡＭＥＳＡ，ＨＩＧＧＩＮＳＭＣ，ＪＥＮＫＩＮＳＤＲ，ｅｔ吐ＲａｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｒｏｍＢｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍｆｏｒｒｉｓｅｉｎＰＣＲ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏ－ｂｉｏｌｏｇｙ，２００ｌ。６７（１１）：５３２１―５３２４．ｆ２１ＧＲＩＦＦＩＮＤＷ，ＫＥＬＬｏＧＧＣＡ，ＰＥＡＫＫＫ，ｅｔａ１．ＡｒａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｓｈｙｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇＤＮＡｆｒｏｍｆｕｎｇｉ［Ｊ］．ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００２，３４（３）：２１０―２１３．【３１ＴＥＮＤＵＬＫＡＲＳＲ，ＧＵＰＴＡＡ，ＣＨＡｌｌＫ）（）ＢＢ．ＡｓｉｍｐｌｅｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｇａｌＤＮＡ［ＪＩ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２００３．２５：１９４１．１９４４．Ｉｔ］ＦＡＧＧＩＥ，ＰＩＮＩＧ，ＣＡＭＰＩＳＩＥ．ＵｓｅｏｆｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓｔＯｅｘｔｒａｃｔｆｕｎｇａｌＤＮＡ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｅｓ，２００５，４８（１）：３－７．（下转第１４９页）第２期胡灵玉等：子宫平滑肌细胞Ｓ膨２２一ａ基因的ｐＥＧＦＰ―Ｃ３载体构建及：ｓｉＲＮＡ筛选１４９作用，平滑肌肌动蛋白ＳＭＡ，ＳＭ２２哦是平滑肌细胞的标志蛋白，是调节分娩进程起决定作用的蛋白，而ＳＭ２２电在子宫平滑肌的具体作用机制不明．而人体子宫平滑肌细胞需原代培养，不能无限分裂，子宫平滑肌组织取材受伦理学限制，细胞来源不易；另一方面，原代细胞无论小干扰、过表达转染都困难，采用ＦＴ２９３细胞进行质粒合成和筛查ｓｉＲＮＡ是进一步的实验基础．实验证明我们合成的ｐＥＧＦＰ－Ｃ３．ＳＭ２２．Ｏｌ载体和筛查的ｓｉＲＮＡ有效片段：５＇－３’ＳＭ２２―２５２：ＣＣＡＵＧＧＵＣＵＵＣＡＡＧＣＡＧＡＵＴＴＡＵＣＵＧＣＵＵＧＡＡＧＡＣＣＡＵＧＧＡＧ：５＇－３’ＳＭ２２―４４４：ＣＣＡＡＣＵＧＧＵＵＵＡＵＧＡＡＧＡＡＴｒＩＩＩＪＣＩＩＩＪＣＡＩＩＡＡＡＣＣＡＧＩＪＩ７ＧＧＧＡ．ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ为研究ＳＭ２２．０ｃ在子宫平滑肌中的作用打下坚实基础．参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：【ｌ】张卫社，粱清华，谢庆生，等．应用ｃＤＮＡ微阵列筛选子宫平滑肌细胞收缩相关药物靶点ｆＪ】．中南大学学报（医学版）（ＺＨＡＮＧＷｅｉ－ｓｈｅ．ＬＩＡＮＧＱｉｎｇ－ｈｕａ，ＸＩＥＱｉｎｇ―ｓｈｅｎｇ，ｅｔ以Ｓｃａｎｎｉｎｇｏｆｄｒｕｇｆｒｏｍｔｈｅｕｔｅｒｉｎｅｔａｒｇｅｔｓａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｅｄｏｆｔｒａｎｓｇｅｌｉｎｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．ＡｃｔｓＬａｇｅｒＢｉｏｌｏｇｙＳｉｎｉｃａ）。２００９，１８（３）：３３４．３３６．ＳＵＺＵｌＩＴ，ＮＡＧＡＩＲ，ＹＡＺＡｌＩＹ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｉｍｓｏｆｔｒａｎｓ．『３１ｅｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｉｌｓ【Ｊ１．ＯｒｃＲｅｓ，１９９８，８２（１２）：１２３８一１２４２．【４１ＭＯＲＧＡＮｒｅｇｕｌａｔｉｏｎＫｂｙＧ，ｔｈｉｎＧＡＮＧＯＰＡＤＨＹＡＹｆｉｌａｍｅｎｔ―ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＳＳ．Ｃｒｏｓｓ―ｂｒｉｄｇｅｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．ＪＡｐｐｌｍｕｓｃ｜ｅ－ＰｈｙｓｉｏＩ．２００１．９１：９５３．９６２．ｒｅｌａｔｅｄｂｙｔｏｕｔｅｒｕｓｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ【５】ＺＨＯＵｓｐｅｃｉｆｉｃＪＬ，ＨＵＧｇｅｎｅｓａｒｅＱ。ＨＥＲＲＩＮＧＢＰ．Ｓｍｏｏｔｈｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ【Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄＳｏｉ））。２００７，３２（４）：５７９―５８３．【２】胡灵乇．周昌菊，谷永红，等．人妊娠子宫平滑肌细胞的原代培养方法研究及ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ蛋白的检测Ⅲ．激光生物学报（ＨＵＬｉｎｇ－ｙｕ，ＺＨＯＵＣｈａｎｇ－ｊｕ，ＧＵＹｏｎｇ―ｈｏｎｇ，ｅｔ０１．ＴｈｅｐｒｉｍａｒｙｕｔｅｒｉｎｅｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｓｃＤＮＡｄｉｆｆｒｅｎｔｉａｌｌｙｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙＥｌｋ．１【Ｊ１．Ｍｏｌ【６】ＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００５，２５：９８７４－９８８５．乐杰，谢幸，丰有吉，等．妇产科学（第六版）ｆＭ】．北京：人民卫生出版社（ＬＥＪｉｅ．ＸＩＥＸｉｎ，ＦＥＮＧＹｏｕ－ｊｉ，ｅｔａ１．ＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓａｎｄＧｙｎｅｃｏｌｏｇｙ（ＳｉｘｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）【Ｍ】．Ｂｅｉｊｉｎｇ：‘Ｐｅｏｐｌｅ’ＳＭｅｄｉｃａｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＨｏｕｓｅ）．２００４．ｏｆｈｕｍａｎｕｔｅｒｉｎｅｐｒｅｇｎａｎｃｙｓｍｏｏｔｈ（上接第１２４页ｊ【５】【９】ＷＨＩＴＥＴＪ．ＢＲＵＮＳＴ，ＬＥＥＳ，ｅｔａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｈｙｉｏ－ｇｅｎｅｔｉｃ刘少华．陆金萍：朱瑞良，等．’一种快速简便的植物病原真菌基因组ＤＮＡ提取方法【Ｊ】．植物病理学报（ＵｕＳｈａｏ－ｈｕａ，ＬＵＪｉｎ―ｐｉｎｇ。ＺＨＵＲｕｉ―ｌｉａｎｇ，ｅｔａ１．ＡｒａｐｉｄａｎｄｓｉｍｐｌｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｂｙａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｉｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＤｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｇｅｎｅｓ［Ｃ】／ＩＩＮＮＥＳＭＡ，ＧＥＬＦＡＮＤｔｏＨ，ＳＮＩＮＳＫＹＪＪ，“Ⅱｆ．ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ『１０１Ｇｕｉ。ｍｉｎ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．１９９０．３１５―３２２．ＡＮＤＥＲＳＯＮＬＣ。ＣＡＭＰＢＥＬＬＣＤ，ＰＲＯＳＳＥＲＪＩ．ＰｏｔｅｎｔｉａｌＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ），２００５，３５（４）：３６２―３６５．【６】张桂敏。唐文杰，班静．等．硅胶破碎法抽提真菌染色体ＤＮＡ［Ｊ］．湖北大学学报（自然科学版）（ＺＨＡＮＧＴＡＮＧｆＩｌｎｇａｌ１８ＳｒＤＮＡａｎｄｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｉｍｅｎｆｏｒｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｂｉａｓｏｆｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｓｐａｃｅｒｆｕｎｇａｌＷｅｎ－ｊｉｅ．ＢＡＮｏｆＪｉｎｇ．ｅｔａ１．ＡｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｏｆＨｕｂｅｉｓｏｉｌｌＪ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，５ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｕｎ＃ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌＳｃｉｅｎｃｅ）．２００６，２８（１）：６９－７１．（１）：３６－４７．【１ｌＪ吴发红，黄东益，黄小龙，等．几种真菌ＤＮＡ提取方法的比较【Ｊ】．中国农学通报（ＷＵＦａ―ｈｏｎｇ，ＨＵＡＮＧＤｏｎｇ―ｙｉ，ＨＵＡＮＧＸｉａｏ－ｌｏｎｇ，ｅｔａ１．ＣｏｍｐａｒｉｎｇｆｒｏｍｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｓｔｕｄｙｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ【７】张颖慧，魏东盛，邢来君，等．一种改进的丝状真菌ＤＮＡ提取方法【Ｊ】．微生物学通报（ＺＨＡＮＧＹｉｎｇ－ｈｕｉ，ＷＥＩＤｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＸＩＮＧｉＪａｊ－ｊｕ．，ｅｔａ１．ＡｍｏｄｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｎｇＤＮＡｆｒｏｍ４６６－．４６９．ｓｅｖｅｒａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒＤＮＡｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。２００８，３５（３）：ｆｕｎｇｉ咖．ＣｈｉｎｅｓｅＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎ）．２００９．２５（８）：６２―６４．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．．ｆ１２｝周礼２【．一种制备富含多糖丝状真菌基因组ＤＮＡ的方法ｆＪｌ．湖北农业科学（ＺＨＯＵＬｉ―ｈｏｎｇ．Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｇｅｎｏｍｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ【８】孙立夫，张艳华，裴克全．一种高效提取真菌总ＤＮＡ的方法ｌＪ】．菌物学报（ＳＵＮＡｒａｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＬｉ－ｆｕ，ＺＨＡＮＧＹａｎ－ｈｕａ，ＰＥＩＫｅ－ｑｕａｎ．ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉｗｉｔｈａｂｕｎｄａｎｔｐｏｌｙｓａｃ?ｏｆＤＮＡｆｒｏｍｆｕｎｇｉＬ玎．Ｍｙｃｏｓｙｓ－ｃｈａｒｏｓｅ［Ｊ］．ＨｕｂｅｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ．２００８，４７（４）：３７９?３８１．ｔｅｍａ）．２００９。２８（２）：２９９．３０２．万方数据一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：陈锋菊， 李百元， 杨冰， 张叶纯， CHEN Feng-ju， LI Bai-yuan， YANG Bing，ZHANG Ye-chun湖南科技大学生命科学学院,中国湖南,湘潭,411201生命科学研究LIFE SCIENCE RESEARCH)0次 参考文献(12条) 1.WHITE T J;BRUNS T;LEE S Analysis of phyiogenetic relationships by amplification and directsequencing of ribosomal RNA genes 19902.孙立夫;张艳华;裴克全 一种高效提取真菌总DNA的方法[期刊论文]-菌物学报 .张颖慧;魏东盛;邢来君 一种改进的丝状真菌DNA提取方法[期刊论文]-微生物学通报 .张桂敏;唐文杰;班静 硅胶破碎法抽提真菌染色体DNA[期刊论文]-湖北大学学报(自然科学版) .刘少华;陆金萍;朱瑞良 一种快速简便的植物病原真菌基因组DNA提取方法[期刊论文]-植物病理学报 .FAGGI E;PINI G;CAMPISI E Use of magnetic beads to extract fungaI DNA 2005(01)7.TENDULKAR S R;GUPTA A;CHATrOO B B A simple protocol for isolation of fungal DNA .GRIFFIN D W;KELLOGG C A;PEAK K K A rapid and efficient assay for extracting DNA from fungi2002(03)9.周礼红 一种制备富含多糖丝状真菌基因组DNA的方法[期刊论文]-湖北农业科学 .吴发红;黄东益;黄小龙 几种真菌DNA提取方法的比较[期刊论文]-中国农学通报 2009(08)11.ANDERSON L C;CAMPBELL C D;PROSSER J I Potential bias of fungal 18S rDNA and internal transcribedspacer polymeraso chain reaction primers for estimating fungal biodiversity in soil .JAMES A;HIGGINS M 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本实验室从一酸奶样品中分离到两株丝状真菌N3、N9。通过形态学观察、RAPD分析及5.8SrDNA及ITS区序列测定并结合出菇试验，初步确定了N3、N9菌株的分类地位以及它们与其近缘种的生物系统学关系。
1分别观察了N3、N9菌株在PDA培养基上的菌落特征和菌丝体形态特征。结果表明：N3、N9菌株在PDA培养基上25℃培养7d后菌落生长旺盛，呈丝状辐射生长，表面呈绒絮状，圆形，平坦。菌丝浓密，粗壮，多气生菌丝，菌丝体上具有明显的锁状联合结构，故初步判定N3、N9菌株为担子菌。
2比较了CTAB、SDS-CTAB和氯化苄这3种DNA提取方法提取8株担子菌DNA的效果。结果表明：CTAB法和SDS-CTAB法只适合于部分菌株的DNA提取，对另外一些菌株则提取不出谱带清晰的DNA而氯化苄法适合于所有供试菌株的DNA提取，所有菌株的DNA凝胶电泳图谱带清晰，效果很好。同时研究比较了液氮研磨和提取液的pH值对氯化苄法提取DNA效果的影响。
3运用RAPD技术对N3、N9菌株和6株担子菌标准菌株进行了比较。首先从40个10bp引物中筛选出18个有效引物，用于所有供试材料基因组DNA样品的扩增。这18个引物对8株供试菌株均能扩增出清晰的谱带。对RAPD结果进行聚类分析，构建了供试菌株基因型的亲缘关系图。从聚类图上可以看出，菌株N3、N9与糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)白平菇、糙皮侧耳澳黑平菇、姬菇(P.limpidus)河北33、毛头鬼伞(Coprinuscomatus)聚为一类，而香菇(Lentinusedodes)、金针菇(Flammulinavelutipes)聚为另一类。其中菌株N3、N9与白平菇的亲缘关系最近，与澳黑平菇、河北33的亲缘关系稍近一些，故可初步确定N3、N9菌株应属于侧耳属。
4再次运用RAPD技术对N3、N9菌株和侧耳属7株菌株进行了聚类分析。以扩增条带清晰、多态性丰富和重现性好为原则，从40个10bp引物中筛选出了21个有效引物，用于所有供试材料基因组DNA样品的扩增。聚类结果表明：菌株N3、N9与白平菇相似程度最高，三者最先合并，之后与澳黑平菇、河北33、姬菇黑平1号归为一类，而鲍鱼菇(P.abalonus)、金顶侧耳(P.citrinopileatus)、阿魏侧耳(P.ferulae)归为另一类。故可在第一次聚类的基础上进一步确定N3、N9应属于侧耳属，且与白平菇的亲缘关系较近。
5对N3、N9菌株的5.8SrDNA及ITS序列进行PCR扩增和序列测定，并将这两株菌株与Genbank中登录的糙皮侧耳、哥伦比亚侧耳(P.columbinus)、灰白侧耳(P.spodoleucus)等共18株菌株的5.8SrDNA及ITS序列进行聚类分析。系统聚类树结果表明：菌株N3、N9在聚类树上被聚在以糙皮侧耳为代表的分支中，其中N3与灰白侧耳的ITS1-5.8S-ITS2基因序列同源性最高，其Bootstrap支持率为100％，二者很可能是同一个种；N9与佛罗里达侧耳(P.floridanus)的ITS1-5.8S-ITS2基因序列同源性最高，其Bootstrap支持率为99％，也显示出十分密切的遗传亲缘关系，提示N9可能属于佛罗里达侧耳。
6对N3、N9菌株进行了出菇试验。出菇试验表明：N3、N9菌株均具有结实能力，其桑椹期的形状和子实体的形态结构与侧耳属的子实体相同。2.学位论文 于寒颖 Dactylellina cionopaga捕食线虫相关基因的研究 2008三亿文库包含各类专业文献、生活休闲娱乐、高等教育、中学教育、外语学习资料、幼儿教育、小学教育、92一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法等内容。　
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