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如何用Excel建立谷丙转氨酶标准曲线？
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我用的南京建成的试剂盒，赖氏法测定谷丙转氨酶，用Execl建立标准曲线，添加趋势线时选择的是多项式3阶，R^2达到3个9，可是建立的方程与试剂盒说明书上差别很大。我的方程：y =
- 40.707X^2 + 184.82X+ 0.58&&R2 = 0.9989,试剂盒说明书上的方程：y=-0.26X-781.8683X^(1.5)+X^(2.5)-X^3，说明书上还有如下标注：r^2=0.DF Adj r^2=0. FistdErr=0. Fstat=11865.97。
我觉得南京建成建立标准曲线的用的其它软件，有哪位高手用Execl建立过标准曲线，麻烦把建曲线的步骤分享一下，我看看我做得是否正确，多谢指教！急用！
(foodwater)
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楼主可以到本论坛搜搜啊，用EXCEL做标准曲线都是一个原理，就不要在这里发重复帖了！你可以看看下面的链接。
[ 本帖最后由 lily123436 于
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小鼠谷丙转氨酶（ALT)酶联免疫分析（ELISA说明书
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小鼠谷丙转氨酶（ALT)酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中谷丙转氨酶（ALT)的活性。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠谷丙转氨酶（ALT)水平。用纯化的小鼠谷丙转氨酶（ALT)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入谷丙转氨酶（ALT)，再与HRP标记的谷丙转氨酶（ALT)体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的谷丙转氨酶（ALT)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠谷丙转氨酶（ALT)活性浓度。
试剂盒组成：
试剂盒组成
酶标包被板
标准品：27U/L
标准品稀释液
1.5ml1瓶2-8℃保存
样品稀释液
2-8℃保存显色剂A液
终止液3ml1瓶
20倍浓缩洗涤液
样本处理及要求：
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100l分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50l弃掉，再各取50l分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50l分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50l，混匀后从第七、第八孔中分别取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l弃掉。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为18U/L，12U/L，6U/L，3U/L，1.5U/L）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。
7.温育：操作同33。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10.终止：每孔加终止液50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（n5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释
倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。
2.批内与批见应分别小于9%和11%
检测范围：
1U/L-22U/L
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：66个月
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重新安装浏览器，或使用别的浏览器谷丙转氨酶（GPT）活性的测定预习报告；1.研究背景：转氨酶是体内重要的一类酶；的αC酮基之间的相互转化，从而生成一种新的氨基酸；2.研究目标：由于催化活性是酶的一个独特属性；没有活性往往是毫无意义的；3.研究策略：根据本次酶活力单位和酶比活定义，通；酶催化产生的丙酮酸的量，进而间接反应酶的比活；4．研究方案及可行性分析：现在可以对反应环境可以；值可以通过缓
谷丙转氨酶（GPT）活性的测定预习报告 1.研究背景：转氨酶是体内重要的一类酶。转氨酶催化αC氨基酸的αC氨基与αC酮酸的αC酮基之间的相互转化，从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸，这种作用称为转氨基作用。它在生物体内蛋白质的合成，分解等中间代谢过程中，在糖，脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系，相互制约及相互转变上都起着很重要的作用。 故转氨酶是氮代谢中不可缺少的一种酶，本次实验测定谷丙转氨酶活性不但可以进一步完善了转氨酶活性研究领域，并且对其他种类转氨酶活性测定具有一定指导作用，测得数据还可以作为临床医学参数造福人类。 2.研究目标：由于催化活性是酶的一个独特属性。酶蛋白质质量再多，纯度再高，如果没有活性往往是毫无意义的。实验用赖氏法分别测定兔子肝脏和血清中GPT活性，藉以作为谷丙转氨酶研究的一个基础。 3.研究策略：根据本次酶活力单位和酶比活定义，通过一定技术手段测定在该条件下由酶催化产生的丙酮酸的量，进而间接反应酶的比活。由于丙酮酸与2,4―二硝基苯肼反应所生成的丙酮酸二硝基苯腙，在碱性环境中于520nm下的特异光吸收在一定的浓度范围内符合朗伯比尔定律，故可以用比色法测定丙酮酸的含量，便可以计算出肝脏和血清中谷丙转氨酶的比活。 4．研究方案及可行性分析：现在可以对反应环境可以做到相当准确的控制，pH值可以通过缓冲溶液控制，反应的温度可以通过恒温水域箱控制，电子天平可以测定万分之一克以及精确的容量瓶这样可以保证标准管丙酮酸的浓度的准确性。虽然这些实验基础具备了但是由于α-酮戊二酸和2,4―二硝基苯对显色的干扰，以致丙酮酸产量与酶量的关系并不始终成线性关系，其理论误差可以控制相应物质浓度尽量减小。同时，在操作过程中酶在相应条件下反应的时间，以及将试管同时放入和取出水浴的时间不能够精确保证，造成进一步的误差。故本次实验虽具有一定的可操作性，但由于其中引入的误差过程比较多，应该注意保证每一步的正确性，同时通过卡门氏单位进行校正，进而减小实验误差对可操作性带来的影响。 5．具体实验设计： 5.1实验材料：家兔的肝脏和血清 5.2实验仪器：722-光栅分光光度计、离心机、电热恒温水浴锅、匀浆机、移液器、100ml容量瓶若干、15ml具塞刻度试管若干 5.3具体操作步骤 1．肝匀浆液制备：新鲜肝脏用生理盐水冲洗后沥干，取1g以9ml预冷的pH7.4的0.1M磷酸缓冲液在冰浴上充分匀浆（10%肝匀浆），4000转低温冷冻离心15分钟取上清液冰浴中备用，酶活测定时视情况一般还需稀释至少50倍使用。 2. 血清的制备：心脏采血，分装至预先用生理盐水浸润过的离心管中，3000转低温冷冻离心15分钟取血清冰浴中备用。
3.谷丙转氨酶活力的测定
（1）取试管2支，分别注明“测定管”、“对照管”，按照表一（均要做三个平行）
进行操作；
（2）记录测定管与对照管的吸光度，将测定管吸光度减去对照管吸光度然后根据表二绘
制的标准曲线计算出对应丙酮酸含量；
（3）谷丙算转氨酶活力计算：由丙酮酸-OD520标准曲线求得丙酮酸含量，带入丙酮酸含
量与卡门氏单位线性回归方程，求得对应的卡门氏单位。
（4）根据上述酶活力单位，计算出每克肝组织或每ml血清中总活力单位。 表一：
谷丙转氨酶的测定 测定管对照管稀释后肝脏溶液或血清/ml0.1――基质液/ml，37℃预热5min0.50.5混合后，37℃水域30min2,4-二硝基苯肼液/ml0.50.5稀释后肝脏溶液或血清/ml――0.1混合后，37℃水域20min0.4M NaOH/ml55室温放置10min,在520nm比色，以蒸馏水调零，测各管吸光度4.赖氏法测定谷丙转氨酶活力标准曲线绘制，按表二操作； 表二：
标准曲线绘制表格
0.1M磷酸缓冲液/ml 0.10
2uM丙酮酸标准溶液/ml 0.00
基质缓冲溶液/ml 0.50
2,4-二硝基苯肼/ml 0.50
混匀后，37℃水域20min 0.4M NaOH/ml 5.00
室温放置10min，在520nm比色，以蒸馏水调零，测各管吸光度 表三：
数据记录表格 管号
6 肝测1 肝测2 肝测3 血测1 血测2 血测3
肝对1 肝对2 肝对3 血对1 血对2 血对3
备注：“肝测”表示“肝脏测定管”，“肝对”表示“肝脏测定对照管”，血清的简称亦然。 5.用EXCEL以各管吸光度减去1号管吸光度，所得差值为纵坐标，相应的丙酮酸浓度为横坐标，作标准曲线图； 5.4每一步的作用 （1）稀释肝脏匀浆液的作用是：因为酶量过高时，丙酮酸产量与酶量之间更加不符合线性关系，稀释后可以避免由于肝脏酶活力过高，对测定的影响； （2）测定管加入稀释后的肝脏溶液是为了提供谷丙转氨酶，作为对照管故不加稀释后的肝脏溶液； （3）对基质液预热是为了使得一定时间内酶促反应温度恒定，加入基质液是为了让具有酶的试管启动转氨反应；
（4）准确保温30min是为了控制酶促反应时间，方便衡量酶的比活； （5）加入2,4-二硝基苯肼是为了使得转氨酶失活，同时作为与丙酮酸反应的底物； （6）对照管加入等量稀释后的肝脏是为了减少测定误差，尽量出去除丙酮酸二硝基苯腙对OD值的影响； （7）溶液混合后，37℃水域20min是使得丙酮酸充分地与2,4-二硝基苯肼反应； （8）加入5ml 0.4MNaOH是为了提供碱性环境，使丙酮酸二硝基苯腙呈现特异性光吸收。
5.5最关键的步骤
5.6时间分配（预计完成时间）：
6质疑及相关思考 (1)转氨酶在细胞内的作用及生理意义？细胞内有众多的转氨酶，但相关研究及医学临床应用中却几乎都是只检测谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活力，而极少测定其它转氨酶活力，你推测可能的原因会是什么？为什么？
转氨酶在代谢中起着非常重要的作用，因为多数氨基酸都可以通过转氨酶作用脱去氨基进行降解，并且所有氨基酸的合成过程中，其氨基酸都是直接或者间接地来自谷氨酸参与的转氨基过程；医学临床中只是检测GPT和GOT，肝脏中GPT活力最高，GPT活力测定可诊断肝功能的正常与否，急性肝炎患者血清中GPT活力可明显地高于正常人GPT，测定GOT活力则有助于对心脏病变的诊断，心肌梗塞时血清中GOT活性显示上升。而其他转氨酶在身体各个器官和部位相当，测量其他转氨酶对医疗方面指导意义不大。
(2)转氨酶催化的是双底物可逆反应，根据酶活力测定的总体思路，在设计转氨酶的活力测定实验方案时如何保证测得的是反应的初速度？为什么？
首先，在不影响测定的前提下保证底物浓度足够大；其次，考虑反应时间和产物浓度，二者权其重的前提下尽量减少反应时间。由于此时产物浓度相对于底物浓度是非常小的，这样就可以忽略逆反应带来的影响。
(3)转氨酶测定是医学临床上用以检测相关疾病的重要指标，测定方法的历史建立了金氏法、穆氏法及赖氏法（包括改良赖氏法），请查询资料，分别明确三种方法的酶活单位定义、各自测定的酶促反应时间，三种方法的主要异同点。目前临床检测国家规定使用的为赖氏法，为什么做如此选择？实验指导上三份转氨酶测定的资料所使用的各是何种方法？ 金氏法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。穆氏法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位。1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。金氏法60min ，穆氏法和赖氏法30min。三种方法主要异同点：其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同，不同之处在于作用时间。 在赖氏法中尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的丙酮酸二硝基苯腙化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确，其结果与速率法数据相近。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。 第一个用的是金氏法，第二个用的是穆氏法，第三个用的是赖氏法。
(4)转氨酶活力测定的卡门氏单位的由来？为何设计的标准曲线要以卡门氏单位为横坐标，而不是以标准丙酮酸含量为横坐标？
虽然金氏法、穆氏法、赖氏法操作相对于速率法测定转氨酶活力要简便，但?-酮戊二酸的干扰使得前三种方法的精确性不如速率法，而速率法原理是：还原辅酶I在340nm处有最大光吸收，因此伴随还原辅酶I不断被丙酮酸氧化，340nm光吸收值随之下降，下降速率和谷丙转氨酶活力成比例，籍此测定谷丙转氨酶活力，故产生了卡门氏单位：1ml血清在25℃，340nm，体积为3ml，光径为1cm每分钟光密度下降0.001的酶量。
查资料无果，我认为 标准曲线以卡门氏单位为横坐标是为了方便计算，避免其他单位和卡门氏单位转换。
(5)实验指导上转氨酶活力测定的前两份资料中没有设计标准曲线，这种设计与第三份设计了标准曲线的方案有何异同？
这三种方法本质相同，仅因为赖氏法使用卡门单位对数值进行校准更加精确。由于最初测定认识有限，前两种方法相对于第三种方法没有设计标准曲线，在测定配置溶液OD值与丙酮酸含量之间线性关系也不如赖氏法好。如果对精度要求不是很高可以用前两种方法，操作更加简便。
实验相关试剂配置 1.标准柠檬酸溶液 62.5mg丙酮酸钠 100ml 0.05mol/lH2SO4
5 0.4mol/l NaOH溶液 将4mol/lNaOH稀释10倍
4.（0.02% ）2,4-二硝基苯肼溶液 20mg溶质溶于少量1mol/l HCL中，加热溶解；
用1mol/lHCL稀释至100ml
2.（0.1mol/l）磷酸缓冲溶液 13.97g K2HPO4 2.69g KH2PO4 1000ml蒸馏水
3.谷丙转氨酶底物 0.9g L-丙氨酸 29.2mg α-酮戊二酸 溶于pH7.4 0.1mol/l的磷酸缓冲溶液 用1mol/lNaOH调节pH值到7.4 用上述磷酸缓冲溶液稀释至100ml
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