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【进展】-Nature-两篇神经母细胞与时间模式文章
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-Nature-Articles-Neural stem cells and differentiation本期Nature Article有两篇文章介绍有关神经干细胞及发育的内容并附有当期评论及介绍。当期评论Title：Stem cells in multiple time zones题目：在不同时间阶段的干细胞Abstract
In fruitfly, neural stem cells generatedifferent cell types at different times. It emerges that these temporalprogressions are controlled by multiple cascades of gene transcription factors.摘要
在果蝇中，神经干细胞在不同时间产生不同类型的细胞。事实证明这些时间性进程是由多个级联基因转录因子控制的。（评论原文）在中枢神经系统发育阶段，神经干细胞得到“GPS坐标”-即指导其在什么地方产生什么类型的神经细胞及胶质细胞的位置信息。有越来越多的信息表明这些神经干细胞也需要时间信息的输入，即具有固定先后产生顺序而使其在不同时间产生不同类型细胞的时间性信息。甚至在单个神经干细胞的培养中也会看到这种时间性进程的出现。在本期Nature中，由Bayraktar和Doe，以及Li等人在果蝇Drosophilamelanogaster中确认出保证神经干细胞正确时间性进程的调节性分子级联的组成。果蝇的中枢神经系统是通过两个阶段建立的：一个是胚胎期，在这一时期大多数基础性神经连接及功能得到建立；另一个是幼虫期，在这一时期对于胚胎期中枢神经系统框架作进一步扩展并建立起更大更复杂的成熟期中枢神经系统。在这两个阶段，神经干细胞-在昆虫中也称为神经母细胞（neuroblasts）-进行不对称分裂并自我复制，同时也形成自我复制能力受到进一步限制的子细胞。在许多情况下，子细胞仅分裂一次，这类株系被称为I类。有关果蝇胚胎中枢神经系统的一些重要的研究工作成果为研究时间性发育提供了框架。这些研究成果显示在神经母细胞中转录因子的表达呈现一种时间性的Hb-Kr-Pdm-Cas-Grh级联。每个因子对相邻的因子具有调节作用，从而保证了级联进程的准确性。每个因子还对神经母细胞的特异性分化能力具有控制作用，因为很明显在每个短暂的时间阶段都会产生不同类型的神经细胞及胶质细胞。然而，在果蝇中枢神经系统发育的晚期并没有这样的级联作用被确认出来，在其他动物中类似的精细级联作用也未见报道。Li及同事在果蝇幼虫的视叶（optic lobe）中确认出了控制I类神经母细胞时间性进程的基因及途径。这类神经母细胞能产生各类细胞，其中含有非常复杂的神经细胞类型，这些神经细胞对眼睛视觉输入的处理具有调节作用（图1a，b）。通过研究大量具有调节功能的基因，作者发现视叶神经母细胞有顺序地表达一组不同与胚胎神经母细胞的转录因子系列（Hth-Ey-Slp-D-Tll）。作者进一步对这些转录因子相互之间的调节作用进行研究，发现Hth并不是级联进程所必需的，而Ey、Slp和D则是所必需的。还有，对这些因子进行突变或过量表达会影响产生细胞的类型，因为在不同进程的下游细胞中转录因子Bsh、Lim3、Dfr、Ap、Toy、及Repo的表达发生了改变。Figure 1 | Time-dependent evolution of neural lineage trees. a, Neuroblasts in thecentral nervous system of Drosophila melanogaster larvae are dividedinto type I (which have daughter cells that divide once) and type II (whichhave daughter cells that divide several times). b, Li et al.8 reveal that thetemporal progression of type I neuroblasts is controlled by the expression of acascade of regulatory transcription factors (Hth–Ey–Slp–D–Tll), which resultsin generation of different types of neuronal and glial cell that expressspecific transcription factors: Bsh, Lim3, Dfr, Toy or Repo. Asymmetric Notchsignalling in sibling neurons and glia contributes to this diversificationprocess. c, Bayraktar and Doe7 report that in type IIlineages, separate cascades occur in two main branches: one in the neuroblastitself (Cas–Svp) and one in each daughter branch (Cas–D–Grh–Ey). This allowsfor the generation of even greater diversity in cell types originating from asingle neuroblast.图1
神经细胞谱系演化树的时间依赖性演变a，果蝇幼虫中枢神经系统中的神经母细胞分为I类（其子细胞只分裂一次）和II类（其子细胞可分裂多次）。b，Li等人揭示出I类神经母细胞的时间性进程是由调节性转录因子（Hth-Ey-Slp-Tll）的一种级联表达控制的，这导致了表达特异性转录因子Bsh、Lim3、Dfr、Toy或Repo的不同神经细胞或胶质细胞的产生。在同胞性神经元和胶质细胞中非对称性Notch信号传导作用驱动这种多样性进程的实现。c，Bayraktar和 Doe报道，在II类谱系中，在两个主要的分支中出现不同的级联作用：一个出现在神经母细胞自身（Cas-Svp）而另一个出现在其子细胞分支中（Cas-D-Grh-Ey）。这使从单个神经母细胞起源的细胞类型产生更大的多样化效果。然而，这种调节性级联作用只能对于在视叶系统中建立起来的神经细胞类型广泛的多样性给予部分解释。因此Li等人对于Notch信号传导途径的作用进行了研究，Notch信号传导在胚胎神经系统发育中以非对称形式作用，这样保证同胞神经元的不同进程。作者发现，的确Notch信号传导同样在视叶系统同胞神经元中对于建立非对称性细胞进程十分重要。；因此在视叶系统中所见到的神经细胞的高度多样化似乎是由同胞神经元中时间性级联作用再加上非对称性Notch信号传导作用而产生的。Bayraktar and Doe则在时间性编码进程中创建了一个全新的概念。除了子细胞通常只分裂一次的I类神经母细胞外，幼虫期的第二种神经母细胞也被确认出来，并称之为II类神经母细胞。有意思的是，II类神经母细胞产生的子细胞会分裂多次。这意味着，与通常含有十到十五个细胞的胚胎神经母细胞相比，II类神经母细胞群相对大一些，通常含有多达500个细胞，并且显示出极其丰富的细胞类型的多样性。在如此大量且多种分支的神经母细胞群体中控制细胞类型的多样性则对时间性进程的控制提出了更进一步的要求。Bayraktarand Doe 为回答这一问题的一种令人兴奋的进化方式提供了证据，即对于同一谱系中不同分支具有多个时间性级联作用进行控制。作者展示II类神经母细胞在细胞特异分化能力上也接受了一种时间依赖性的挑战，从随时间变化不同细胞类型的产生及调节性转录因子有秩序地表达来看这很明显。此外，这些神经母细胞的子细胞们通过一种程式化的转录因子级联作用而独立地发展演化。对子细胞时间性基因的突变或过度激活会影响神经元及胶质细胞的发育。令人惊讶的是，虽然每个子细胞经历同样的时间性进程，由于神经母细胞自身经历的时间性进程使随时间不同而产生不同类型的神经元（图1c）。基本上，由于神经母细胞随时间而发生变化，在子细胞中相同的级联作用则具有不同的信息价值。这些发现令人激动，为大的神经系统的发育过程中的时间性进程提供了一个不一样的思维概念。与以上两个研究相关的一个问题是时间性基因是如何与调节分化终止的基因联系的-时间性基因是如何支配独特的神经细胞的命运的？另一个重要的问题是有关I类和II类谱系的更完全详尽的说明，目前完成的研究确实对于关键性调节基因的时间性表达及导致特异性细胞类型的时间性形成给予了详细描述，但这些大型谱系的更精确的、达到对单细胞分辨程度演化过程的描述则还需要进一步的研究。这会由于这些大型谱系的组成大小及复杂程度（如每一个II类谱系所含有的细胞数量几乎相当于一个线虫那样多）而提出挑战。然而对于这些谱系的进化演变进行完全描述又是必要的，因为这必将带给我们更多的惊奇。在体内和体外两方面对于哺乳动物的研究已经使神经干细胞特化能力中的时间性进程得到了确认。然而，在确认真正的时间性基因级联作用方面的进展很有限，这里时间性基因级联作用指调节因子以有序的方式进行表达、互相之间进行调节以及对细胞特化规范能力具有调节作用。最新的两个研究结果说明具有已知其他功能的调节性基因可能参与哺乳动物神经细胞前体的时间性级联作用，就像已知Hth、Ey及Tll这些基因在果蝇的发育中具有其他作用一样。这样，从更广泛的意义上看，目前对于调节性基因表达的集中研究可能有助于对哺乳动物神经系统中时间性级联作用的确认。（评论全文完）Article 1：Title：Temporal patterning of Drosophilamedulla neuroblasts controls neural fates题目：果蝇髓质神经母细胞的时间性模式控制神经细胞的命运Abstract
In the Drosophila optic lobes, the medullaprocesses visual information coming from inner photoreceptor R7 and R8 and fromlamina neurons. It contains approximately 40,000 neurons belonging to more than70 different types. Here we describe how precise temporal patterning of neuralprogenitors generates these different neural types. Five transcriptionfactors-Homothorax, Eyeless, Sloppy paired, Dichaete and Tailless-aresequentially expressed in a temporal cascade in each of the medulla neuroblastsas they age. Loss of Eyeless, Sloppy paired or Dichaete blocks furtherprogression of the temporal sequence. We provide evidence that this temporalsequence in neuroblasts, together with Notch-dependent binary fate choice,controls the diversification of the neuronal progeny. Although a temporalsequence of transcription factors had been identified in Drosophila embryonicneuroblasts, our work illustrates the generality of this strategy, with differentsequences of transcription factors being used in different contexts.摘要
在果蝇的视叶中，髓质对来自内部光受体（inner photoreceptor）R7、R8以及椎板神经元（laminaneuron）的视觉信息进行处理。在髓质中存在有超过70种不同类型的40，000个神经元。我们在此描述神经细胞前体的精确时间性模式是如何产生这些不同类型神经细胞的。在每个髓质神经母细胞中，随着发育的进程有五种转录因子有序地在一种时间性级联过程中表达，它们是Homothorax，Eyeless，Sloppypaired，Dichaete和Tailless。失去Eyeless，Sloppypaired 或Dichaete会阻断时间性结果的进一步演变。我们提供证据说明这种在神经母细胞中的时间性顺序与Notch依赖性二元进程选择一起控制了后代神经元多样化的形成。虽然在果蝇胚胎神经母细胞中一种转录因子的时间性顺序已经得到了确认，我们的研究结果对于这种发育策略的普遍性给予了说明，即在不同环境条件下有不同顺序的转录因子得到启用。（文章全文）神经细胞多样性的产生需要神经细胞前体以一定的时间空间模式进行演变分化。脊椎动物神经细胞前体是随其演变老化而通过不同特性状态而完成转化的，这样产生了一种保守的不同类型神经细胞生成的顺序。同样，果蝇的神经母细胞也在一种确定的顺序下产生具有不同结局的子代。在果蝇胚胎神经索（nervecord）中一种时间性特化的分子机制已经被确认，在神经母细胞老化的同时几种转录因子有序地进行表达，这几种转录因子是：Hunchback（Hb），Kruppel（Kr），Pdm1/Pdm2（Pdm），Castor（Cas）和Grainyhead（Grh）。这一时间性级联作用对于神经索中神经细胞多种谱系性质的特化是充分和必需的。一个有趣的问题是是否在其他系统中的神经细胞前体也遵循同样的时间性基因级联模式。在果蝇的触角神经叶神经母细胞中，kr限制40个投射神经元中的一个神经元的发育演变。在脊椎动物中，IKAROS（亦称IKZF1），一种Hb的小鼠同源物，对于早期视网膜前体细胞保持发育演变能力的状态是必要且充分的。然而，类似于果蝇神经索母细胞的转录因子级联作用并未见报道。这样，仍然不清楚这种有效的机制是否在其他的系统中被广泛地应用。我们在此在果蝇髓质中回答这一问题。含有隶属于70余种细胞类型，40，000个神经元的髓质是视觉处理中心（视叶）最大的神经网。它是由被称为外部增殖中心（outerproliferation centre，OPC）的新月形神经上皮衍生出来的。OPC的单层神经上皮细胞通过对称性分裂进行增殖。它们在一波神经生成的作用下最终转化为髓质神经母细胞，这种神经形成作用起始于新月形神经上皮的中间内侧边缘并向两侧扩张（图1a，c）。然后每个神经母细胞非对称性分裂多次进行自我更新以及产生神经节母细胞（ganglionmother cells，GMCs），然后再分裂一次产生髓质神经元。每个神经母细胞的子代形成一个链状，在这个链上最新生成的神经元位于临近神经母细胞及GMCs的最外层，而最早产生的神经元则处于临近髓质神经网的最里层（图1c，d）。之前先导性的研究工作已经对特化不同髓质神经元类型的转录因子进行了确认。然而，并不清楚这些转录因子在神经元中的表达是如何控制产生神经细胞多样性的。我们发现，随着髓质神经母细胞的发育老化，有五种转录因子有序地在其中进行表达，它们是Homothorax（Hth），Eyeless（Ey），Sloppy paired 1和2（Slp），Dichaete（D）以及Tailless（Tll）。在分裂的神经母细胞中，Ey，Slp和D的每一个对于下一个转录因子的启动都是必需的。Slp和D还是关闭上一个转录因子所必需的。这些转录因子控制了标志神经细胞子代特征的下游转录因子的表达。GMCs的依赖于Notch途径的非对称性分裂进一步增加了神经细胞特征的多样性。我们对不同于Hb-Kr-Pdm-Cas-Grh顺序的新转录因子时间性级联作用的确认说明神经细胞前体的转录因子依赖性时间性开关控制是神经细胞特化过程中一个普遍性主题，即在不同环境条件下会征用不同的转录因子顺序。Figure1 | The developing medulla. a, Model of a larval brain showing that theneuroepithelium(blue) givesrise to the lamina on the lateral (L) side and to themedulla on the medial (M)side. A wave of neurogenesis (light red) convertsneuroepithelium (NE) cells(blue) into neuroblasts (NBs) (red). A,D, P, V, VNC, ventral nerve cord. b, Surface viewshowing neuroepithelium(phalloidin, blue), medulla neuroblasts (Dpn, red),and lamina neurons (Elav,purple). c,Cross-sectional model showingneuroblasts(red), GMCs (green) and neurons (purple). A single neuroblastsclone is shown by grey thickoutlines. PR, photoreceptor. d,Cross-sectionalviewshowing the neuroepithelium (DE-cadherin, blue), medulla neuroblasts(Dpn, red), medulla GMCs(Pros, green), medulla and lamina neurons(elav-gal4. UAS-CD8::GFP, purple). In all panels, thesmall red arrow depictsthewave of neurogenesis.图1
髓质的发育过程a，果蝇幼虫脑模型显示蓝色的神经上皮产生于基质的侧面，髓质的中部内侧。一波神经生成作用（浅红色）将蓝色的神经上皮细胞转变为红色的神经母细胞。A，anterior-前部；D，dorsal，背部；P，posterior，后部；V，ventral，腹部；VNC，腹部神经索。b，表面视图显示神经上皮（鬼笔环肽-phalloidin，蓝色），髓质神经母细胞（Dpn，红色）及基质神经元（Elav，紫色）。c，剖面模型显示神经母细胞（红色），GMCs（绿色）及神经元（紫色）。灰色粗轮廓线显示一个单个的神经母细胞。PR，光受体-photoreceptor。d，剖面成像图显示神经上皮（DE-cadherin，蓝色），髓质神经母细胞（Dpn，红色），髓质GMCs（Pros，绿色），髓质和基质神经元（elav-gal4，UAS-CD8::GFP，紫色）。所有组图中，小的红色箭头表示神经生成作用。在髓质神经母细胞中的一种时间性基因级联作用在髓质发育期间，将神经上皮转化为神经母细胞的作用使得通过快照能够看见不同时间阶段的神经母细胞状态，新产生的神经母细胞会处于扩增的新月形神经母细胞区域的两侧边缘，而最老的神经母细胞则处于这一区域的中间内侧位置（图1a，b）。我们对发育的髓质进行了转录因子的抗体筛选并确认出五种转录因子，Hth，Ey，Slp1，D和Tll，它们在神经母细胞扩增阶段在神经母细胞的五个连续的条形区域内表达，Hth在最新分化的神经母细胞中表达而Tll则在最老的神经母细胞中表达（图2a，b）。这说明随着髓质母细胞的老化这些转录因子有顺序地在其中表达。在神经母细胞中相邻转录因子表达的条形区域相互有部分重叠，例外的是D和Tll的表达区域，它们彼此相邻但没有重叠。我们以及其他研究小组以前曾报道过Hth和Ey在髓质神经母细胞中的表达，但并没有发现它们参与神经母细胞特征的控制过程。Hth和Tll也在神经上皮中表达。为说明每个神经母细胞是否有顺序地表达这五个转录因子，我们在神经母细胞的子代中进行了检测。Hth，Ey及Slp1分别在对应产生先后顺序的三个不同层神经元中表达，Hth在最深层的每个谱系最早产生的神经元中表达；而Ey或Slp1则在临近神经母细胞的更表面的层中表达。这说明它们在每个谱系中按顺序先后产生（图2c，d，j）。D则在两种特异的神经元群体中表达。更近邻表面的神经元群体从D+的神经母细胞那里继承了D的表达（图2e，虚线上面）。在更深层的D+神经元（与Hth和Ey表达层相比）独立地启动D的表达，这一点将在随后讨论（图2e，虚线下面）。我们获得了单个神经母细胞的克隆并对其及子代的转录因子的表达进行了检测。处于Ey+阶段的单个神经母细胞克隆包括Ey+的GMCs/神经元以及Hth+的神经元（图2f）。这表明Ey+神经母细胞经过Hth+阶段进行转化并产生Hth+神经元。处于D+阶段的神经母细胞克隆包含已经通过Slp+及Ey+阶段转化的D+神经母细胞。这些数据支持这样一种模型，即每个髓质神经母细胞随其老化的过程有顺序地表达Hth，Ey，Slp1和D，结果产生继承和维持转录因子表达的神经元。Slp1和Slp2是在胚胎及眼发育中以串联方式起作用并功能冗余的两个同源基因。Slp2与Slp1在髓质神经母细胞中的表达相同（补充图1a）。我们将Slp1和Slp2合并称为Slp。Tll在最老的髓质神经母细胞中表达。最老的Tll+神经母细胞显示出基因Pros的核定位（图2h），说明它们在幼虫神经索及中脑神经母细胞中当其寿命结束时会经历Pros依赖性细胞周期的终结。Tll+神经母细胞及其子代表达gcm基因（glialcells missing，gcm）（补充图1b），并且其子代逐渐关闭Tll的表达而开启Repo的表达，Repo是胶质细胞的特异性标记。这些细胞向更深的神经元层中迁移，并最终在髓质神经网周围以胶质细胞形式存在（图2i）。这样，Tll+的神经母细胞对应于表达gcm的视叶和中脑之间的胶质母细胞并产生髓质神经网的神经胶质。处于Tll+阶段的神经母细胞克隆包含Hth+神经元及Ey+神经元以及其他神经元（补充图1c），确证了Tll+神经母细胞代表髓质神经母细胞的最终时间性阶段而不是一个分割开的胶质母细胞群。因此，这些数据清晰地表明髓质神经母细胞呈顺序地随其老化表达五种转录因子。前四个时间性阶段产生出继承并维持当其生成时就已经具有的转录因子的神经元，虽然在Ey，Slp或D阶段有一部分神经元失去了神经母细胞转录因子的表达（图2j）。在最后的时间性阶段，神经母细胞转变为胶质母细胞然后退出细胞周期（图2j，k）。Figure 2 | A temporal sequence of transcription factors inmedulla neuroblasts. a, b, Surface views showing that neuroblastssequentially express:Hth(red), Ey (blue), Slp1 (green) and D (red) (a), and D (red) and Tll (cyan)(b). c–i, Cross-sectional viewsshowing the expression of the five transcriptionfactors in neuroblasts and their progeny. c, Hth (red), Ey (blue) and Dpn(green). d, Ey (blue) and Slp1 (green). e, D (red). The dashed line separates thetwo populations of D1 neurons (see text). n,neurons. f, In a neuroblast clone(b-G green in left, dashedcircles in right), the neuroblast is Ey1 (blue, smallarrow), whereas its progeny are Ey1 or Hth1 (red, open arrows). g, In aneuroblast clone (b-G white in inset), theneuroblast isD1 (red, small arrow).It has generated Slp1 (green) GMCs (arrowhead), andEy1 (blue)neurons(openarrows). h, The oldest neuroblasts (small arrows)express Tll (cyan intop),Dpn (red) and nuclear Pros (blue in bottom). i, Tll1 neuroblast progeny(small arrows) lose Tll(cyan), and turn on Repo (red) while migrating (alongthe dashed arrow) to becomemedulla neuropil glia (arrowhead). j, Schematicmodel. For simplicity, the overlap betweentranscription only one neuroblast/GMC is shown for eachstage. D expression in the deeperneuron population is not shown. Empty cells indicate that a subsetof neuronsbornduring the Ey, Slp or D windows do not maintain the neuroblaststranscription factor. k,Model showing that each neuroblast sequentiallyexpresses five transcription factors.图2
在髓质神经母细胞中的转录因子时间性顺序a，b，表面视图显示神经母细胞有顺序地表达：Hth（红色），Ey（蓝色），Slp1（绿色）及D（红色）（a），D（红色）及Tll（天蓝色）（b）。c-i，剖面视图显示神经母细胞及其子代中五种转录因子的表达。c，Hth（红色），Ey（蓝色）和Dpn（绿色）。d，Ey（蓝色）和Slp1（绿色）。e，D（红色）。虚线将两种D+神经元分开。n表示神经元。f，在一种神经母细胞克隆中（β-Gal；左图中的绿色，右图中的虚线），神经母细胞是Ey+（蓝色，小箭头），而其子代是Ey+或Hth+（红色，空心箭头）。g，在一种神经母细胞克隆中（β-Gal；白色），神经母细胞是D+（红色，小箭头），而其产生Slp+（绿色）GMCs（纯箭头）及Ey+（蓝色）神经元（空心箭头）。h，最老的神经母细胞（小箭头）表达Tll（上图中天蓝色），Dpn（红色）及核区Pros（下图蓝色）。i，Tll+神经母细胞子代（小箭头）失去Tll表达（天蓝色）而开启Repo（红色）表达，并沿虚线箭头方向迁移，形成髓质神经网胶质（纯箭头）。j，模型草图。为简单化，图中略去转录因子的相互重叠部分，每个阶段只显示一种神经母细胞/GMC。在神经元群体深层D的表达没有在图中显示。空细胞说明在Ey，Slp或D阶段产生的部分神经元没有维持神经母细胞转录因子的表达。k，模型显示每个神经母细胞有序地表达五种转录因子。时间性转录因子的交叉调节作用我们对于神经母细胞从一种转录因子向下一种转录因子转变的过程中这些时间性顺序转录因子之间是否存在交互调节作用进行了检测。缺失hth或其共同因子exd（extradenticle）并不影响Ey的表达及随后神经母细胞时间性顺序的进程（数据未展示）。我们使用细菌性人工染色体（BAC）挽救构建物在eyJ5.71缺失的背景下与含有Flip重组酶目标（FRT）位点的染色体进行重组的方法构建了ey缺失的突变克隆。我们也对eyJ5.71纯合突变的幼虫进行了检测。在这两种条件下，神经母细胞显示缺失Slp的表达，Slp+的神经母细胞产生由转录因子Toy（Twin ofeyeless）标记的神经元子代也显示Slp表达缺失（图3a，补充图2a）。然而，神经母细胞的分裂并没有受到影响（补充图2b），而且Hth只在最新的神经母细胞及首次生成的神经元中表达（图3a及未展示数据）。使用在神经上皮及神经母细胞中表达的Vsx-Gal4作为驱动而针对ey进行的RNA干扰（RNAi）产生了同样的表型。这说明Ey对于启动下一个转录因子Slp是必需的，但对于抑制Hth则不是必需的（图3c）。在删除slp1和slp2的缺失性突变slpS37A中，神经母细胞正常地从Hth+转化为Ey+，但老一些的神经母细胞维持Ey的表达而不启动D或Tll表达的进程（图3d，e，补充图2f），说明Slp对于抑制ey激活D是必需的。同样，在D突变的克隆中，神经母细胞也被阻断在Slp+阶段而不启动Tll的表达（图3f，g），说明D对于抑制slp激活tll是必需的。最后，在tll突变克隆中，D的表达没有扩展到最老的神经母细胞中，说明tll不是关闭D所必需的（补充图2j）。这样，在髓质神经母细胞时间性顺序中，ey，slp和D对于启动下一个转录因子是相互必需的。slp和D还是关闭前一个转录因子所必需的（图3h）。我们还对每个基因获得性功能表型进行了检测。然而，在所有神经母细胞或大容量神经母细胞克隆中过量表达Hth，Ey，Slp1或Slp2，或D并不足以激活下一个转录因子或抑制前一个转录因子（补充图2e，g-i及未展示数据）。只有在所有的神经母细胞中过量表达tll足以抑制D的表达（补充图2k）。概括来看，在转录因子之间的交互调节作用至少在部分转化中是必需的。我们没有发现hth和ey之间的交互调节。因为ey已经在神经上皮及Hth+的神经母细胞中呈低水平表达，也许存在未知的因子通过逐渐上调ey并抑制hth来达到第一个转化。由于tll足以但不必需来抑制D的表达，一定有其他的因子与Tll一起作用来抑制D。Figure 3 | Cross-regulations between transcription factorsin the gene cascade. a, Surface view: in an eyJ5.71 mutantclone marked by a lack of greenfluorescent protein (GFP; red) and Ey (blue), Slp1 (green) islost in neuroblasts.b, Cross-sectional view: in eyJ5.71 mutants,Hth (red) is only in the youngestneuroblasts (Dpn marking all neuroblasts, blue). c, Summary model. d, Surfaceview: in slp mutantMARCM clones (GFP, white in left, dashed line in middleand right), neuroblastscontinue to express Ey (blue) and do not turn on D(red). e, Summary model. f, Surface view: in D mutantclones marked by lack ofGFP(white in left, dashed line in middle and right), neuroblasts continue toexpress Slp1 (green) and donot turn on Tll (cyan). g, Summary model.h,Model summarizing cross-regulations between the five transcription factors.Asterisk denotes sufficientbut not required.图3
基因级联中转录因子之间的交互调节a，表面视图：在由缺失绿色荧光蛋白（GFP，红色）和Ey（蓝色）标记的eyJ5.71突变克隆中，Slp1（绿色）的表达在神经母细胞中缺失。b，剖面视图：在突变中，Hth（红色）只存在于最新生成的神经母细胞中（Dpn标记所有神经母细胞，蓝色）。c，概括模型。d，表面视图：在slp突变MARCM克隆（GFP，左图白色，中间和右图虚线）中，神经母细胞持续表达Ey（蓝色）而没有启动D的表达（红色）。e，概括模型。f，表面视图：在由缺失GFP标记的D突变克隆（左图白色，中间和右图虚线）中，神经母细胞持续表达Slp1（绿色）而没有启动Tll的表达（天蓝色）。g，概括模型。h，五种转录因子之间交互调节的总结模型。星号表示充分但不必需。Notch依赖性的细胞二元结局选择前述的神经母细胞时间性性顺序作用至少对四种神经元加胶质细胞的特化起作用（事实上，考虑到神经母细胞在每个阶段进行几次分裂并在相邻时间性转录因子之间的叠加，超过十种神经元再加胶质细胞的特化都是在这种时间性顺序作用下完成的）。由于这并不足以产生70种髓质神经元，我们提出疑问是否在神经元子代从神经母细胞中产生的特定时间性阶段中有其他的进程参与增加其多样性。基因Apterous（Ap）已知可以对70种髓质神经元的半数进行标记。在幼虫的髓质中，Ap在从所有时间性阶段产生出的子代神经元中的表达呈现盐与胡椒的混合方式（图4a，b）。从Hth+神经母细胞中产生的子代中都含有Hth，其中部分也表达Ap。然而，从其他转录因子表达阶段神经母细胞中产生的神经元中，只有一半维持神经母细胞转录因子的表达。比如，在Ey+神经母细胞的子代，Ey+的神经元与数量相当的Ey-但表达Ap的神经元混合在一起（图4a）。神经母细胞克隆包含Ey+和Ap+的混合神经元（图4d）。这种现象对于Slp+神经母细胞的子代也一样，即Slp+的神经元与Slp-Ap+的神经元混合在一起（补充图3a）。在D+的神经母细胞子代中，D和Ap共表达在同一个神经元中，这种神经元与既不表达D也不表达Ap的神经元混合在一起（图4b，虚线以上）。如之前我们提到的，在神经结构深层的神经元（相对于Ey+和Hth+的神经元层更深的神经元，图4b，虚线以下）也独立性地表达D，这些神经元不表达Ap。Ap的表达从幼虫到成熟阶段很稳定（补充图3c，d）。Ap+和Ap-神经元的混合现象说明可能GMCs的非对称分裂产生一个Ap+和一个Ap-的神经元。我们构建了双细胞的克隆来观察一个GMC的两个子细胞。在各种情况下（n=11），一个神经元是Ap+，另一个是Ap-（图4c，补充图3b），说明GMCs的非对称分裂通过控制Ap的表达而使髓质神经元的命运多样化。在果蝇GMCs的非对称分裂中存在Notch（N）-依赖性二元性命运的选择。在髓质的发育阶段，Notch途径参与神经上皮向神经母细胞的转变，而缺失Notch信号传导中的转录性效应物Su（H）则导致神经系统生成及神经母细胞形成进程的加快。然而，Su（H）突变的神经母细胞仍然遵循同样的转录因子顺序并产生GMCs及神经元子代（补充图3e，f，4f），这使得我们可以对于缺失Notch功能对产生GMC子代多样性的影响得出分析结果。值得注意的是，在Su（H）突变克隆中神经元完全失去了Ap的表达。在Hth+阶段生成的所有突变神经元仍然表达Hth但不表达Ap，说明Hth+GMCs的Notch途径启动的子代是表达Ap和Hth的神经元（补充图3h）。与野生型克隆相反（图4d），所有在Ey+阶段产生的Su（H）突变的神经元都表达Ey而不表达Ap（图4e）。同样，所有在Slp+阶段产生的突变神经元都表达Slp1而不表达Ap（补充图3g）。这些数据说明对于Ey+或Slp+的GMCs，Notch途径关闭的子代维持神经母细胞转录因子的表达，而Notch途径开启的子代则失去原神经母细胞转录因子的表达而表达Ap。在D+阶段产生的野生型子代中，Ap+的神经元共表达D。而在D+阶段产生的Su（H）突变克隆子代中Ap和D都失去表达（图4f），证实了D的表达是从D+神经母细胞传递到Ap+且Notch途径开启的子代中。相反，在深层（相对于Ey+和Hth+阶段产生的Notch途径关闭的子代）D+Ap-的神经元以牺牲Ap+神经元为代价而扩展到Su（H）的突变克隆中（图4f，星号）。因此，在从Hth+和Ey+GMCs产生的Notch途径关闭的子代中，这种更深层神经元D的表达是独立开启的。最后，在野生型中，我们发现在神经元周围散乱分布着相当数量的调亡细胞，说明在一些谱系中某种GMCs的一个子代发生了调亡（补充图3i）。综上数据说明GMCs的Notch依赖性非对称分裂将通过时间性转录因子顺序产生的神经元特征进行了进一步的多样化（图4g）。Figure 4 | Notch-dependent asymmetric division of medullaGMCs. Allpanelsare cross-sectional views with Ap (green) and Ey (blue). a, A subset ofHth+neurons (red) are Ap+, whereas Ey+neurons are intermingled with Ap+neurons. b, D+neuronsabove the dashed line co-express Ap; D expressionbelow the dashed line is inAp2 neurons.c, Two daughters of a GMC arelabeled by GFP (red). One isAp+,the other is Ap-.d, Wild-type tub-gal4 MARCM clones marked by GFP (red) containboth Ap1 andEy1 neurons.e, f, Su(H) mutantMARCMclones (GFP, red in e, blue inf). e, Ap is lost and Eyexpanded. f, D (red) in neuroblasts isnot affected (open arrow) but D and Apare lost in D1neuroblast progeny (above the dashed line, white arrow); thedeeper layer ofDexpression inAp2 neurons(below the dashed line, asterisk) isexpanded. g,A simplified schematic model.图4
髓质GMSc的Notch依赖性非对称分裂。所有组图为剖面视图且Ap（绿色），Ey（蓝色）。a，部分Hth+（红色）神经元为Ap+，而Ey+的神经元与Ap+的神经元混在一起。b，虚线上D+神经元与Ap共表达，虚线下D表达在Ap-的神经元中。c，一个GMC的两个子细胞由GFP（红色）标记，一个为Ap+，另一个为Ap-。d，由GFP（红色）标记的野生型tub-gal4MARCM克隆包含Ap+和Ey+的神经元。e，f，Su（H）突变MARCM克隆（GFP标记，e中为红色，f中为蓝色）。e，Ap表达失去但Ey表达扩展。f，在神经母细胞中D（红色）的表达未受影响（空心箭头），但在D+神经母细胞子代中D和Ap的表达都失去了（虚线上部分，白色箭头）；在Ap-神经元中更深层D的表达扩展（虚线下部分，星号）。g，简单草图模型。时间性转录因子控制神经元的命运神经母细胞转录因子时间性顺序与Notch依赖性二元命运选择是如何一起在髓质中控制神经元特征的呢？我们在实验中使用了特异性表达在髓质部分神经元而不是神经母细胞中的转录因子标记物，这些标记物包括Bsh（Brain-specifichomeobox）和Dfr（Drifter），以及在我们在抗体筛选中确认出来的其它转录因子如Lim3和Toy。Bsh对于Mi1细胞的命运是充分且必要的，Dfr则是髓质中九种类型神经元形态形成所必需的，其中部分神经元是Mi10，Tm3，TmY3和Tm27Y。我们首先通过检验神经元与继承的神经母细胞转录因子共表达的情况验证出这些神经元是在哪一个神经母细胞时间性阶段产生的。然后我们检验了神经母细胞转录因子是否调节这些标记物的表达以及是否控制神经元的命运。每个神经母细胞阶段的结果分述如下。Hth+神经母细胞阶段Bsh在也表达Ap的部分Hth+神经元中表达（图5a），说明Bsh是Hth+GMCs的Notch途径开启的子代。确实，在Su（H）及hth突变克隆中Bsh失去了表达（图5b，c）。这样，Notch的活性及Hth是特化Mi1细胞命运所必需的，这与之前报道的Hth是Mi1命运所必需的结果是一致的。在老一些的神经母细胞中Hth的异常表达足以产生异常表达Bsh的神经元，尽管所产生的表型比晚期谱系的表现得不那么明显（图5d）。这些数据说明Hth对于特化早期产生的神经元是必要且充分的，但作为回应阻断Hth表达而进行这种特化的能力随时间推移而降低。这一现象与胚胎的中枢神经系统神经母细胞的情况类似，在后者中异常Hb的表达只能在特异的时间阶段特化早期产生的神经元。Ey+神经母细胞阶段Lim3表达在Hth+及Ey+神经母细胞产生的所有不表达Ap的子代中（补充图4a）。Toy和Dfr则表达在由Ey+神经母细胞产生的部分神经元中，如在Ey+神经元子代层中的表达所示。最外层Ey+Ap-的神经元表达Toy（和Lim3），说明它们是Ey+的GMCs最新生成的Notch关闭的子代（补充图4c）。Dfr与Ap共表达在与Ey+神经元混在一起的两三层神经元中（图5e，f），说明它们是Ey+的GMCs的Notch开启的子代（图6i）。除了这些Ap+Dfr+的神经元外，Dfr还表达在一些后期产生的神经元中，在这些神经元里Ap不表达，但表达另一个转录因子Dac（Dachshund），位置在髓质新月形特定区域（图5e）。我们对神经母细胞中的Ey是否调节神经元中Dfr的表达进行了检验。如逾期的那样，在ey缺失的突变克隆中没有Dfr表达的神经元（图5g），说明这些神经元需要神经母细胞中Ey的活性，虽然Ey并不在Ap+Dfr+神经元中维持其表达。还有，在神经母细胞驻留在Ey+阶段的slp突变克隆中，Ap+Dfr+的神经元群体扩展到晚期生成的神经元中（5h），说明在神经母细胞从Ey+到Slp+阶段的转变对于停止Ap+Dfr+神经元的产生是必要的。此外，在Su（H）突变克隆中没有Ap+Dfr+神经元的存在（补充图4b）。这样，在神经母细胞中Ey的表达与Notch途径一起控制Ap+Dfr+神经元的产生。Figure 5 | Hth and Ey are required for neuronal diversity. Allimages arecross-sectionalviews of larval medulla. a, In wild type, Bsh (blue) is inneurons expressing both ap-LacZ(ap-Z;green), an enhancer trap that perfectlymimics Ap expression, and Hth (red). b, Bsh (blue), but not Hth (red), is lost inSu(H) mutant clones (GFP, green). c, Bsh (blue) is lost in hthP2 mutantclones(GFP,green). d, Bsh (blue) is ectopically expressed whenUAS-GFP::Hth isdrivenby tub-gal4 ina MARCM clone (GFP, red). e, In wild type, Dfr (red)is expressed in two-threerows of Ap1 (green)neurons. There are also Dfr1Dac1 (blue)Ap2 neuronsin a more superficial layer. f, TheAp1 Dfr1 neurons(below the dashed line) areintermingled with Ey1 (blue)neurons. g, Dfrexpression (red) is lost in eyJ5.71 mutant clones marked by lack of GFP (greeninleft,dashed line in right). h,Dfr1 (red)neurons are expanded in slpmutantclones(GFP, green). In this region there are very few Dfr1 Dac1 (blue)neurons. The expanded Dfr1 neurons do not express Dac.图5
Hth和Ey对于神经元的多样性是必需的（所有图像均为幼虫髓质剖面视图）a，野生型中Bsh（蓝色）在共表达Hth（红色）和Ap（绿色）的神经元中。ap-LacZ（ap-Z，绿色）是一种很好模拟Ap表达的增强子肼（enhancertrap）。b，Bsh（蓝色）而不是Hth（红色）在Su（H）突变克隆（GFP，绿色）中失去表达。c，Bsh（蓝色）在hth突变克隆中（GFP，绿色）失去表达。d，Bsh（蓝色）在UAS-GFP::Hth在MARCM克隆（GFP，红色）中被tub-gal4驱动时的异常表达。e，在野生型中，Dfr（红色）在两三层Ap+神经元（绿色）中表达。在更表面的层中还有Dfr+Dac+（蓝色）Ap-的神经元存在。f，Ap+Dfr+神经元（虚线以下）与Ey+（蓝色）神经元混在一起。g，在由缺失GFP的eyJ5.71突变克隆中Dfr（红色）的表达失去。h，Dfr+（红色）的神经元扩展到slp突变克隆中（GFP，绿色）。在这一区域很少存在Dfr+Dac+（蓝色）神经元。扩展的Dfr+神经元不表达Dac。Slp+和D+神经母细胞阶段Toy除了在EY+GMCs最新生成的Notch途径关闭的子代中表达外，还在由Slp+和D+神经母细胞产生的更外层的Ap+且Notch途径开启的神经元中表达（补充图4c，d及图6a，i）。与此相一致的是，在Su（H）突变克隆中，我们看到在Ey子代神经元层中Toy+Ey+神经元的扩展，接着是在Slp和D子代层中Toy表达的失去（补充图4e）。我们对于是否在神经母细胞中需要Slp才能从Ey+神经母细胞产生Toy+Ap-神经元子代转变成为产生Toy+Ap+的神经元子代进行了检验。确实，在slp突变神经母细胞中，Toy+Ap+的神经元大量消失，而Toy+Ap-神经元则得到扩展（图6b）。我们对Ap和Toy在特异性成熟神经元中的表达进行了检测。OrtC1-gal4主要标记Tm20，Tm5以及少量的TmY10神经元，而这些神经元既表达Ap也表达Toy（图6c-f）。为检验这些神经元类型的特化是否需要Slp，我们使用可抑制细胞标记物嵌合分析（mosaicanalysis with a repressible cell marker，MARCM）技术，通过在早期幼虫阶段进行一小时热休克处理并分析在成虫髓质中OrtC1-gal4标记的神经元的数量这种方法来产生野生型或slp突变克隆。在野生型克隆中，每个髓质OrtC1-gal4标记了约100个神经元（95.1±19.3（mean±s.d.），n=8）（图6g，补充图4f，h）。相反，在slp突变克隆中很少有神经元被OrtC1-gal4标记（9.7±11.2，n=17）（图6h，补充图4g，i）。Slp不像是直接调节Ort的启动子因为Slp的表达并没有在Ap+Toy+神经元中维持。还有，在基质L3神经元中，OrtC1-gal4的表达水平并没有受到slp突变的影响（图6h）。这些数据说明在神经母细胞中缺失Slp的表达会强烈影响Tm20和Tm5神经元的生成。概括起来，我们的数据展示了在髓质神经母细胞中转录因子呈顺序地表达控制了具有产生顺序依赖性的不同类型神经元转录因子标记物的表达，这样来控制不同神经元类型有顺序地产生（图6i）。Figure 6 | Slp is required for neuronal diversity. a, b, Cross-sectional views oflarval medulla, with Toy inred and Ap (or ap-LacZ)in blue. a,In wild type,Toy+neurons in the deeper layer are Ap-. The superficial Toy1 neurons areAp1 and are intermingled withSlp11 neurons(green). b,In slp mutantclones(GFP,green in left, dashed outline in right), Toy1 Ap1 neurons disappear.c, d, Adult medulla with OrtC1-gal4. UAS-CD8::GFP (green), ap-lacZ(blue)andToy (red). c,Horizontal view. d,Viewthrough the medulla cortex. e, f, Flipoutclones in adults (OrtC1-gal4,hsFLP,UAS-FRT-STOP-FRT-CD8::GFP).Arrowspoint to neuron cell bodies. e,Tm20. Photoreceptor axons in blue.f,Tm5 and TmY10. g,h,OrtC1-gal4 MARCMclones in adults. g,Wild type.DNCad,DN-cadherin. h,slp mutant.i,Simplified model showing neuronaltranscription factor markers expressed in progeny of neuroblastsof differentstages.The lineage is approximate and does not take into account regionaldifferences. The brackets for‘D’ indicate that D is not maintained in all NONprogeny of D1 neuroblasts.图6
Slp是神经元多样性所必需的a，b，幼虫髓质剖面视图。Toy为红色，Ap（或ap-LacZ）为蓝色。a，野生型中更深层Toy+神经元为Ap-。外表面Toy+神经元为Ap+，并与Slp1+（绿色）神经元混在一起。b，在slp突变克隆（GFP，左图中绿色，右图中虚线轮廓），Toy+Ap+神经元不存在。c，d，带有OrtC1-gal4&UAS-CD8::GFP（绿色），ap-lacZ（蓝色）和Toy（红色）。c，侧视图。d，从髓质皮层方向的视图。e，f，在成虫（OrtC1-gal4，hsFLP，UAS-FRT-STOP-FRT-CD8::GFP）中的flip-out克隆。箭头指向神经元细胞体。e，Tm20神经元。光受体轴突为蓝色。f，Tm5和TmY10神经元。g，h，成虫中OrtC1-gal4MARCM克隆。g，野生型。DNCad指DN-cadherin。h，slp突变。i，简化模型展示在神经母细胞不同阶段产生的子代中神经元转录因子标记物的表达。谱系为近似描述，并不说明各区域的差异性。带括号的D表示D的表达并没有在D+神经母细胞产生的所有Notch开启的子代中。讨论虽然一种时间性转录因子顺序模式化存在于果蝇神经索神经母细胞中的现象十多年前就被报道，但并不清楚在其他环境条件下神经细胞前体存在着同样的或是相似的转录因子顺序模式。我们对于果蝇髓质中模式化新的时间性转录因子顺序的确认说明神经细胞前体这种时间性模式是产生神经元多样性的主要原因，在不同环境条件下可能有不同的转录因子顺序被调用。在这两种神经母细胞时间性顺序之间既有共性又有差异。在Hb-Kr-Pdm-Cas-Grh顺序中，一个基因的异常表达足以激活下一个基因而抑制前一个基因，但是这些交互的调节作用对于不同阶段的转化并不是必需的，Castor是唯一的例外。在Hth-Ey-Slp-D-Tll顺序中，移走Ey，Slp或D确实会干扰时间性状态转化必需的交互调节作用（Hth-Ey的转变是一个例外）。然而，大多数情况下这些交互调节作用不足以实现时间性状态的转化，说明转化还需要另外的控制时间的机制或因子的参与。为了把问题简单化，我们把髓质神经母细胞的转化过程看作五种转录因子阶段，而实际上阶段的数量明显大于5种（图6i）。首先，神经母细胞在表达五种转录因子之一时分裂超过一次，而每个GMC可以有不同的亚时间性特征。还有，在有序的时间性神经母细胞转录因子之间具有一定程度的叠加：表达两个转录因子的神经母细胞更容易产生与表达一个或没有转录因子的神经母细胞相比不同的神经元类型。虽然我们仍在致力于髓质神经母细胞整个的谱系研究，我们在此展示了一种新的时间性转录因子顺序是产生组成髓质的各种不同神经元所必需的。在髓质及胚胎神经母细胞中对于转录因子顺序的需要说明这是一种产生神经元多样性的普遍性机制。有意思的是，哺乳动物的Slp1的同源物FOXG1，在皮层神经前体细胞中抑制早期产生的皮层神经细胞的命运。这样，神经细胞前体转录因子依赖性时间性模式也许是脊椎动物和非脊椎动物中产生神经系统的共同主题。（Article 1全文完）Article2Title：Combinatorial temporal patterning inprogenitors expands neural diversity题目：在神经细胞前体中时间性模式的组合扩展了神经细胞的多样性Abstract
Human outer subventricular zone (OSVZ)neural progenitors and Drosophila type II neuroblasts both generate intermediateneural progenitors (INPs) that populate the adult cerebral cortex or centralcomplex, respectively. It is unknown whether INPs simply expand or alsodiversify neural cell types. Here we show that Drosophila INPs sequentiallygenerate distinct neural subtypes , that INPs sequentially express Dichaete,Grainy head and Eyeless transcription factors, and that these transcriptionfactors are required for the production of distinct neural subtypes. Moreover,parental type II neuroblasts also sequentially express transcription factorsand generate different neuronal/glial progeny over time, providing a secondtemporal identity axis. We conclude that neuroblasts and INP temporalpatterning axes act together to generate increased neural diversity within thea OSVZ progenitors may use similar mechanisms to increaseneural diversity in the human brain.摘要
人类的外脑室下区（out subventricular zone，OSVZ）神经元前体和果蝇II类神经母细胞都可以产生中间型神经元前体细胞（intermediateneural progenitors，INPs），这些中间型前体细胞位于成人的大脑皮层中或果蝇的神经中枢复合体中。我们并不知道INPs是仅仅简单扩增神经细胞类型还是对其具有多样化的作用。在此我们展示果蝇的INPs有顺序地产生特异的神经细胞类型，INPs有序地表达Dichaete，Grainyhead和Eyeless转录因子，而且这些转录因子是产生特异神经细胞类型所必需的。还有，II类亲本神经母细胞也有序地表达转录因子并随时间产生不同的神经元类或胶质类子代细胞，提供了第二条时间性特征轴。我们得出结论，神经母细胞和INP的时间性模式轴在成熟的神经中枢复合体中一起作用来产生增加的神经元多样性；OSVZ前体细胞可能使用相似的机制在人脑中增加神经元的多样性。（文章原文）正确的脑发育需要从相对很小的干细胞/前体细胞集合中产生出大量不同的神经元及胶质细胞。空间模式机制沿前后轴及腹背轴产生前体细胞的多样性，但单个前体细胞使用时间模式来通过时间制造不同的神经元细胞类型的作用仍然不很清楚。果蝇的神经元前体（称为神经母细胞）是研究时间模式的一个模型系统。大多数胚胎及幼虫的神经母细胞经历一种I类谱系出芽方式产生一系列小神经节母细胞（GMCs），每个GMCs则产生一对儿神经元或胶质细胞（图1a），且特化时间性细胞特征的转录因子也在胚胎神经母细胞及幼虫神经母细胞中被确认清楚。我们还有其他组最近在果蝇幼虫脑叶背中线位置发现了六种II类的神经母细胞（DM1-DM6）及在更侧面的位置发现两种II类的神经母细胞（图1a）。II类神经母细胞经历自我更新的非对称细胞分裂产生一系列的更小的INPs，然后每个INP也经过自我更新的复制来产生一系列约六种GMCs，它们每个通常产生两个神经元或胶质细胞。这样，神经母细胞和INPs都随时间的推移而产生一系列的子代。为了更清楚地说明问题，我们称II类神经母细胞随时间从早期向晚期进行转变，而INPs则随时间从年轻向年老进行转变。II类神经母细胞产生大量的神经元及胶质细胞克隆，它们聚集在果蝇成虫脑中心复合体（CCX）中。这样，果蝇II类神经母细胞与人的OSVZ前体具有同样的特征：两种前体都产生INPs，二者都在脑的特异区域来增加神经元的数量。虽然在果蝇成虫CCX中有至少60种形态各异的神经元存在，我们对于亲本神经母细胞或INPs如何产生这样的神经元多样性却一无所知。INPs有顺序地表达三种转录因子我们想知道单个INPs是否有顺序地表达一系列转录因子，这是时间性模式的标志。我们使用之前了解的R9D11-gal4株系，这一株系驱使UAS-GFP构建物来标记所有从DM1-DM6神经母细胞谱系中产生的INPs及其子代（图1b）。INPs可以被确认为小Deadpan（Dpn）阳性及绿色荧光蛋白（GFP）阳性的细胞，它们紧邻Dpn+GFP-的II类神经母细胞；并且它们与Dpn-GMCs及神经元形态差异很大。重要的是，一个INP的年龄可以通过其与亲代II类神经母细胞的距离判断出来：新生的INP距亲本II类神经母细胞很近，而老龄的INP则很远。可以确认处于进程中的老龄INP的能力使我们能对于只存在于青年、中年或老年INP中的转录因子进行筛选。我们对神经元转录因子的60种抗体进行了筛选（补充表1），并发现有三种呈顺序地在INPs中表达。在幼虫孵育后（ALH，afterlarval hatching）晚期96小时和120小时，靠近亲本神经母细胞的新生的INPs含有SOX家族成员转录因子Dichaete（D）；在离亲本较远的老龄INPs中没有D的表达（图1c，d中显示DM3，类似的表达仔其他背中线谱系中也可见到，补充图1）。相反，Pax6的转录因子Eyeless（Ey）则只出现在老龄INPs中而不在新生的D+INPs中；并且很少有D和Ey双阳性或双阴性的INPs存在。与此相似的是，含有一个2.7kb的D增强子序列片段的R12E09-gal4株系在新生的INPs中表达，而在ey等位基因的OK107-gal4增强子肼则在老龄INPs中表达（详细的表达模式见补充图2，从今后在本文中称以上二者分别为R12E09D和OK107ey）。在所有检测的II类谱系中都能见到D到Ey系列，它也存在于所有幼虫阶段（DM1-DM6，ALH24-230小时；图1f，补充图表2，3，补充图1）。这样，所有INPs-从II类不同神经母细胞以及从早期或晚期神经母细胞中产生-都呈顺序性地表达D和Ey（图1h，i）。此外，我们发现中年INPs含有CP2家族DNA结合因子Grainyhead（Grh）。Grh之所以认为属于中年INPs是因为其表达与D和Ey在它们的表达边界处都有重叠（图1e）。这样，INPs的转化经历四个分子阶段（图1h，g）；似乎在每个阶段都有几个GMCs产生，但为简明的缘故，我们在概述中的每个阶段只显示了一个GMC。由D到Grh到Ey的系列可以在从多种II类神经母细胞产生的INPs中见到（DM2-DM6，DM1中没有Grh），在所有幼虫期的INPs中也能见到（图1g，补充表4，5，补充图1）。除了在INPs中的表达，Grh也在II类神经母细胞中表达，在非成熟的INPs中亦有瞬时表达。我们得出的结论是大多数INPs经历一种固定的D到Grh到Ey的转录因子系列进程（图1h，i）。Figure 1 | INPs sequentially express candidate temporalidentity factors.a, Position of type II neuroblasts (NB)(left). Cell lineage of type I and IIneuroblasts (right). iINP, immature INP; n, neurons. b, Left, type II neuroblastslineages in one brain lobe(OL, optic lobe), z-projection,R9D11-gal4UAScd8::GFP. Right, high magnification view of the DM3lineage showing theparentalneuroblast (Dpn1 GFP2, arrowhead), the smallerINPs (Dpn1 GFP1), and GMCs/neurons (Dpn2 GFP1). Yellow line surrounds GFP1 cells.c, d, f, Dichaete marks young INPs and Eyelessmarks old INPs; DM3 lineageshown.R9D11-gal4UAS-cd8::GFP marks INPs and their progeny (yellow line).f, Quantification. n56 brains, lineages in a single lobecounted, percentagespereach lineage were averaged. e, g, Grainy head marks middle-aged INPs,which include the oldestDichaete1 INPsand the youngest Eyeless1 INPs;DM3 lineage shown. R9D11-gal4 UAS-cd8::GFP marksINPs and their progeny(yellowline) and Grainy head1 cells(white line). In addition, Grh1GFP2 immatureINPs are observed between the parental neuroblast and the GFP1 INP pool. g, Quantification as in f. h,i,Summary of Dichaete, Grainy head andEyeless sequential expression in INPs. Gal4 lines expressed inINPs areindicated.Scale bars, 10 mm.图1
INPs有顺序地表达时间性特征因子代表物a，II类神经母细胞（NB）的位置。I类及II类神经母细胞的细胞谱系。iINP指未成熟INP，n指神经元。b，左图：在一个脑叶（OL指视叶）中的II类神经母细胞，z-投影，R9D11-gal4UAS-cd8::GFP。右图，DM3谱系高度放大视图，显示亲本神经母细胞（Dpn+GFP-，箭头所指），较小的INPs（Dpn+GFP+）及GMCs/神经元（Dpn-，GFP+）。黄线圈出GFP+细胞。c，d，f，DIchaete标记年轻的INPs，Eyeless标记老龄的INPs；DM3谱系显示。R9D11-gal4UAS-cd8::GFP标记INPs及其子代（黄线）。f，定量分析结果。N=6脑，在每个单个脑叶中的谱系计数，每个谱系所占百分比被平均。e，g，Grainyhead标记中年INPs，包括最老的Dichaete+INPs和最年轻的Eyeless+INPs；DM3谱系显示。R9D11-gal4UAS-cd8::GFP标记INPs及其子代（黄线）还有Grainy head阳性细胞（白线）。此外，Grh+GFP-的未成熟INPs可以在亲本神经母细胞和GFP+的INP之间见到。g，如同f的定量分析。h，i，在INPs中有序表达的Dichaete，Grainyhead和Eyeless的总结。在INPs中Gal4的表达如图示。图中比例尺为10um。在INP中表达的转录因子之间的交互调节作用我们接着要确定D，Grh和Ey是否在INPs中具有交互调节作用。我们使用wor-gal4，ase-gal80在Dichaete杂合子背景下来驱动UAS-DRNAi（称之为D的RNAi），这样将可检测到的D从INP谱系中移除（补充图4）。与野生型相比，D的RNAi导致早期产生的Grh+Ey-INPs明显缺失（图2a-d），对晚期产生的Grh+Ey+INPs的数量没有影响（图2c，补充图4）。在D突变克隆中也得到了同样的结果（补充图4）。相反，错位表达D并没有导致异常的Grh表达。这样，在INP谱系中D是时效性激活Grh所必需的，尽管不依赖于D的输入也存在（图2m）。为检测Grh是否调节D或Ey，我们使用R9D11-gal4在grh杂合子背景下驱动UAS-grhRNAi（称之为grh的RNAi），这样可以在中年INPs中显著性地减少Grh的水平（补充图5）。grh 的RNAi以失去Ey+INPs为代价增加了D+INPs的数量（图2e，f），对总的INPs的数量并没有改变（对照组33.2±5.1，grhRNAi组31.7±3.3，P=0.57）。如预期那样，grh的RNAi在DM1谱系中没有改变D+和Ey+INPs的数量，DM1谱系中没有Grh的表达（补充图5），Grh的错位表达也没有导致异常的Ey的表达（补充图5）。我们得出的结论是在INP谱系中Grh抑制D而激活Ey（图2m）。为确定Ey是否调节D或Grh，我们使用R12E09D-gal4 UAS-FLPactin-FRT-stop-FRT-gal4在INPs中驱动UAS-eyRNAi的永久性表达（称之为R12E09D&&act-gal4或INP特异性ey的RNAi，见图3a）。我们确证了INP特异性ey的RNAi将Ey在INPs中的表达移除了（图2g，补充图7），对Ey在蘑菇体或视叶中的表达没有影响（补充图6）。ey的RNAi导致老龄的D-Grh+的INPs数量显著增加，对年轻的D+INPs的数量没有影响（图2g，h，补充图7）。相反，在INPs中Ey的错位表达显著性地减少了Grh+的INPs的数量（图2i，j，补充图7），对总的INPs的数量没有影响（对照组31.7±2.5，Ey 错位表达组34.7±3.4，P=0.11），我们还见到了D+INPs的增加（图2j，补充图7），这与调节等级性是一致的，Ey抑制Grh，而Grh抑制D。这种效应并不是由于异常性Ey表达直接激活D造成的，因为错位表达Ey在DM1谱系中并不影响D+INP的数量，DM1谱系中没有Grh的表达（补充图7）。我们得到的结论是在INPs中Ey对于终止Grh的表达阶段是必要而且充分的。我们为D到Grh到Ey的交互调节作用构建了一个“正向激活/反向抑制”的模型（图2m）。我们注意到ey的RNAi导致INPs总的数量的增加。这可能是由于INP细胞系寿命延长造成的，或是由于INPs转化为扩展INP群体的对称性细胞分裂造成的。为区分这些可能，我们使用可抑制细胞标记物嵌合分析（MARCM）技术在ALH24小时的野生型及ey的RNAi的INPs诱导永久性的标记克隆，并在幼虫期结束时（ALH120小时）进行分析来确定它们是否在每个克隆中维持一个单个的INP。野生型克隆从未含有一个INP，表明在这一阶段INP谱系的终止（图2k），而ey的RNAi则总是在克隆中包含一个INP（图2l）。此外，所有Grh+的INPs显示正常的INP标记（Dpn+Ase+nuclearPros-），并保持产生核Pros+Elav+神经元的能力（补充图8）。我们的结论是ey的RNAi将单个INP细胞谱系的寿命延伸到超过野生型的INPs。Figure 2 | Cross-regulation between INP temporaltranscription factors.a, c, e, g, i, INP temporal transcription factorexpression in DM2 lineage at120 h ALH. INPs were marked with GFP (yellow outline) driven by:wor-gal4 ase-gal80(a,c),R9D11-gal4 (e, i), or R12E09D-gal4 (g). See Methods for fullgenotypes. White line denotesthe Ey border. Parental type II neuroblasts aremarked by an arrowhead, or an asterisk whenout of focal plane. a, b, Wild-typeexpression of Grh and Ey in INPs. c, d, D RNAi delays Grh expression in INPs,such that no Grh+Ey-INPsare observed. For Ey, see Supplementary Fig. 4a, b.Quantification of Ey1 and Grh1 Ey2 INP number is in d (n=6).LOF,loss-of-function.e, f, grh RNAi extends D expression and delays EyexpressioninINPs (n≥5).g, h, ey RNAi extends Grh expression in INPs (n$4). GOF,gain-of-function. i, j, Ey misexpression reduces Grh expressionin INPs (n≥5).k, l, eyRNAi extends the INP cell lineage. k, Wild-typeMARCMclonesinducedearlyin single INPs never contain an INP at the end of larval life. l, ey RNAiMARCM clones maintain asingle INP at the end of larval life (n≥10 clones).m, Summary. Black arrows, blackT-bars,grey arrows, external positive regulation. Scale bars, 10 mm. All datarepresent mean6s.d. NS, not significant. **P,0.01;***P,0.001.图2
INP时间性转录因子之间的交互调节作用a，c，e，g，i，INP时间性转录因子在DM2谱系中ALH120小时的表达。INPs由GFP标记（黄色轮廓线），由wor-gal4ase-gal80驱动（a，c）；R9D11-gal4（e，i）或R12E09D-gal4（g）。白线表示Ey边界。亲本II类神经母细胞由箭头标示，不在聚焦面时则由星号表示。a，b，在INPs中野生型Grh和Ey的表达。c，d，D的RNAi在INPs中延迟了Grh的表达，没有Grh+Ey-的INPs被观测到。对于Ey，见补充图4a，b。组图d中Ey+及Grh+Ey-的INP数量定量分析结果（n=6）。LOF指loss-of-function。e，f，grh的RNAi延伸了D的表达并推迟了Ey的表达（n≥5）。g，h，ey的RNAi在INPs中延伸了Grh的表达（n≥4），GOF指gain-of-function。i，j，Ey的错位表达在INPs中减少了Grh的表达（n≥5）。k，l，ey的RNAi延伸了INP细胞谱系。k，在早期诱导的野生型MARCM克隆单个INPs从未在幼虫期结束时含有一个INP。l，ey的RNAiMARCM克隆在幼虫期结束时含有一个INP（n≥10克隆）。m，概要。黑色箭头指正向调节；黑色T线指负向调节；灰色箭头指外部正向调节。INPs随时间推移产生不同的神经元及胶质细胞下面，我们检测是否在每个转录因子表达期间产生了不同类型的神经元或胶质细胞。为确定由年轻的D+INPs或老龄的Ey+INPs产生的细胞类型，我们使用永久性谱系示踪技术（图3a）。由R12E09D而不是OK107ey标记的细胞是由年轻的INPs产生的，而由OK107ey标记的细胞是由老龄的INPs产生的（图3b，e，补充图3）。我们对所有60个转录因子抗体进行了筛选，发现有两个存在于年轻的INPs产生的子代中，有两个存在于老龄的INPs产生的子代中。转录因子D及脑特异性同源异型框（Bsh，Brain-specifichomeobox）标记在稀少的，并不重叠的部分由年轻INPs产生的子代中（图3c，d），但没有在由老龄INPs产生的子代中（图3f，g，补充图9）。这样，年轻的INPs产生Bsh+神经元，D+神经元以及许多并不表达Bsh或D的神经元。相反，胶质细胞类转录因子Reverse polarity（Repo）及神经元类转录因子Twinof eyeless（Toy）则标记稀少的且不重叠的由老龄INPs产生的部分子代（图3h-j，补充图9）。一定有另外的机制来对于由年轻或老龄INP产生的子代的每一种标记物（D，Bsh，Repo和Toy）进行限制，比如，在II类神经母细胞谱系中每一群体可能只从年轻或老龄的INPs中产生。我们得出的结论是INPs有顺序地表达D，Grh和Ey转录因子，它们在连续性转录因子表达阶段产生不同的神经元及胶质细胞类型（图3k）。据我们所知，这些数据在INPs经历时间性模式的所有有机体中提供了第一个证据。Figure 3 | INPs sequentially generate distinct temporalidentities.a, Genetics of permanent lineage tracing. b–d, Permanent lineage tracing of allINP progeny using R12E09D-gal4.Summary of GFP expression (b)andexpressionof D and Bsh in the GFP1 INPprogeny (c,d).Dashed linesurroundsGFP1 cells.e–i, Permanent lineage tracing of old INPprogeny usingthelate INP OK107ey-gal4 line.Summary of GFP expression (e);D1 andBsh1 neurons are excluded fromlateINP progeny (f,g),whereas Toy1neuronsand Repo1 glia are among the late bornINP progeny (h,i);dashed linesurroundsGFP1 cells.j,k,Quantification (j)and summary (k).GFP1 INPprogeny in DM1–6
n$3 brain lobes for eachmarker.Regionof dorsomedial brain imaged at 120 h ALH (boxed in cartoon). Scalebars, 5 mm. All data represent mean6s.d. ***P,0.001.图3 INPs有顺序地产生特异的时间性特征细胞a，永久性谱系示踪的遗传学原理。b-d，使用R12E09D-gal4对所有INP子代进行永久性示踪。GFP表达总结（b）以及D和Bsh在GFP阳性的INP子代中的表达（c，d）。虚线圈出GFP阳性细胞。e-i，使用晚期INP的OK107ey-gal4谱系的永久性谱系示踪。GFP表达总结（e）；晚期INP子代中没有D+和Bsh+神经元（f，g）而取而代之的是Toy+神经元和Repo+胶质细胞（h，i）；虚线圈出GFP阳性细胞。j，k，定量分析及总结。在DM1-DM6谱系中GFP+的INP子代进行计数；n≥3脑叶对每个标记物。脑的背中线区域在ALH120小时的图像。比例尺为5um。INP的因子对特异的神经元亚型进行时间性特化作用我们要确定D，Grh和Ey是否在其表达阶段作为时间性确证因子对INP的子代的性质进行特化作用。首先我们研究Ey在晚期生成的INP的子代特化中的作用。INP特异性ey的RNAi导致晚期生成的Toy+神经元及Repo+神经网胶质细胞完全缺失，但并没有改变早期生成的D+及Bsh+神经元的数量（图4a-i）。使用toy的RNAi将Toy+神经元移除不改变Repo+胶质细胞的数量，反过来使用gcm的RNAi将Repo+胶质细胞移除也不改变Toy+神经元的数量（补充图10）；这样Ey对于形成两种晚期INP子代类型是非依赖性需要的。相反，在早期INPs中永久性错位表达Ey会增加晚期生成的Toy+神经元的数量并减少早期生成的Bsh+神经元的数量（图4j-n），这与Ey具有特化晚期INP的时间性特征相一致。没有预料到的是，异常性Ey的表达减少了晚期生成的Repo+胶质细胞的数量（图4n，补充图11）。我们得出的结论是Ey是一种INP时间性的特征因子，它对于晚期生成的Toy+神经元及Repo+胶质细胞具有独立性特化作用（图4o）。我们接着检验D和Grh对于早期和中期INP时间性特征具有特化作用。INP特异性D的RNAi导致早期生成的Bsh+神经元少量但显著性的数量减少（补充图11），而INP特异性grh的RNAi则大量地减少了早期生成的Bsh+神经元的数量（补充图11），但没有影响到INP的增殖（补充图5）或晚期的INP子代（补充图11）。这与Bsh+神经元是从D+Grh+表达阶段衍生出来这一点相一致。有意思的是，错位表达D或Grh并不能增加Bsh+神经元的数量（补充图11）；也许生成Bsh+神经元需要D/Grh的共错位表达。我们得出的结论是对于早期INP子代Bsh+的生成，D和Grh都是必需的但不充分。Figure 4 | Eyeless is a temporal identity factor for lateborn INP progeny.a–i, ey RNAi in INP lineages does not affect earlyborn INP progeny (a–d), buteliminates late born Toy1 neurons (e, f) and Repo1 neuropil glia(g, h). Quantification (n$4 brain lobes) in i. j–n, Ey misexpression in INPlineages leads to loss ofearly born Bsh1 neurons(j,k),and increases thenumberof late born Toy1 neurons(l,m).Quantification (n$5) inn. o, Summary. Region of dorsomedial brainimaged at 120 h ALH (boxed incartoon).G denotes Grh. Scale bars, 5 mm.All data represent mean6s.d.**P,0.01; ***P,0.001.图4
Eyeless对于晚期生成的INP子代是一种时间性的特征因子a-i，在INP谱系中ey的RNAi没有影响早期生成的INP子代（a-d），但使晚期生成的Toy+神经元（e，f）和Repo+胶质细胞（g，h）发生缺失。定量分析结果在i中（n≥4 脑叶）。j-n，在INP谱系中Ey的错位表达导致早期生成的Bsh+神经元的缺失（j，k），并增加了晚期生成的Toy+神经元的数量（l，m）。定量分析结果在n中（n≥5）。o，总结。在ALH120小时的脑背中线区域图像。G代表Grh，比例尺为5um。CCX的形态构建需要晚期生成的INP子代在成熟脑发育中早期或晚期生成的INP子代的功能并不为人所知。在此我们确定在发育过程中晚期生成的INP子代神经元和胶质细胞的作用以及它们在成熟果蝇中间复合体（centralcomplex，CCX）中的功能，CCX是一种进化保守性的昆虫脑结构，包含许多II类神经母细胞的子代。CCX由四种在原脑中线处相互连接的组分构成，这四种组分是：椭球体（ellipsoidbody）；扇形体（fan-shapedbody）；双侧成对小结（bilaterralypaired noduli）以及前脑桥（protocerebral bridge）。每种组分都是由大量不同的神经元组成的。首先，我们使用永久性谱系示踪（OK107ey&& act-gal4 UAS-cd8::GFP）来确定晚期生成的Ey+INP子代对于成熟CCX的作用。我们检测到在CCX的背后区域有Ey+INP子代细胞体的存在，并且它们的轴突投射对于整个椭球体，扇形体和前脑桥都有广泛的神经支配作用，只是在成对小结中的标记信号相当弱（图5a-d）。我们得出的结论是老龄INPs主要为CCX的椭球体、扇形体及前脑桥区域提供神经元。其次，我们使用INP特异性ey的RNAi来删除晚期生成的Toy+神经元和Repo+胶质细胞。缺失晚期生成的INP子代在整个成虫CCX中形成了严重的神经解剖性缺陷：椭球体和成对小结缺失，扇形体增大，而前脑桥部分变得支离破碎（图5f-l；定量分析5o，总结5p）。这种表型的一部分可以在除去Toy+神经元或Repo+胶质细胞后见到（图5m-o，补充图12），说明它们对CCX部分特性的形成起作用。以前有研究描述过类似在幼虫期的ey亚等位基因、toy突变及广泛性胶质细胞删除等都会造成类似或程度稍轻的CCX形态缺陷。此外，我们发现ey的RNAi成虫具有正常的运动能力，但在背地性方面则存在明显缺陷（图5q，补充视频1）。我们得出的结论是Ey是一种时间性特征因子，对于晚期生成的神经元和胶质细胞具有特化作用，而这些晚期生成的神经类细胞是形成成虫中心复合体所必需的。Figure 5 | Eyeless is required for adult brain centralcomplex morphology and behavior. a–d, Permanent lineage tracing of old INPs andtheir progeny(OK107ey&&act-gal4)extensively labels the adult central complex. EB, FB, fan-NO, PB, protocerebral bridge. e–n, eyRNAi(f–l), toy RNAi(m),or gcm RNAi(n)in INPs lineages produce distinct defectsin CCX morphology. Adult brains, frontal view. The z-coordinates of singleconfocal sections are shownrelative to ellipsoid body position. Theprotocerebral bridge was cropped out of the brain and displayedas a projectionofindicated z-coordinatesin d,k andl.Scale bars, 20 mm.o, Quantification ofthe width of CCX compartments(n≥5). p, Summary of CCX morphologyafter loss of late born INPprogeny. q, ey RNAi flies have deficits in negativegeotaxis. See Methods for controls. All data representmean± s.d.*P&0.05;**P&0.01;***P&0.001.图5
Eyeless是成虫脑中心复合体形态及行为正常所必需的a-d，对于老龄的INPs及其子代（OK107ey&&act-gal4）永久性示踪广泛地在成虫中心复合体中进行标记。EB，椭球体；FB，扇形体；NO，小结；PB，前脑桥。e-n，在INPs谱系中ey的RNAi（f-l），toy的RNAi（m）或gcm的RNAi（n）在CCX形态上产生特征性缺陷。成虫脑，前视图。单个共聚焦切片的z轴坐标以相对于椭球体的位置数值示出。前脑桥部分被从脑中切出，并以d，k，l中所示的z轴投影展示。比例尺20um。o，CCX组分宽度定量分析（n≥5）。p，缺失晚期生成INP子代后CCX形态变化总结。q，ey的RNAi果蝇在背地性方面具有缺陷。时间性模式的组合增加了多样性我们发现Bsh+神经元和Repo+胶质细胞分别在新生和老龄的INP子代中零散地存在，说明有其他机制协助这些神经类细胞亚型的形成。一种机制可能是II类神经母细胞中的时间性模式。为确定II类神经母细胞是否随时间的推移而改变其转录因子的表达特性，我们对于II类神经母细胞谱系在五个时间点（ALH24，48，72，96和120小时）检测了已知的时间性转录因子的表达。我们发现II类神经母细胞中不表达Hunchback，Kruppel，Pdm1/2和Broad，同时所有的II类神经母细胞在所有的时间点都表达Grh。然而，我们在II类神经母细胞中确认出三种转录因子具有时间性表达。D和Castor（Cas）特异性地在早期II类神经母细胞中表达：ALH24小时有3-4个神经母细胞，ALH48小时有0-1个神经母细胞，更晚时期则没有神经母细胞表达这两种转录因子（图6a，b）。虽然我们从未在ALH24小时的所有II类神经母细胞中同时检测到D的表达，使用R12E09D对所有II类神经母细胞标记（补充图3）的永久性谱系示踪表明所有II类神经母细胞都瞬时性地表达D。第三个转录因子，Sevenup（Svp），显示在ALH48小时的部分II类神经母细胞中呈脉冲性地表达，但通常在新生或老龄的II类神经母细胞中没有表达。Cas和Svp都可以在最前端II类神经母细胞中检测到（也许对应DM1-DM3），这样至少这些II类神经母细胞呈顺序地表达D或Cas，然后是Svp。我们得出的结论是II类神经母细胞可以随时间推移而改变基因的表达。接下来，我们要确定是否II类神经母细胞随时间推移产生不同的INPs。我们在II类神经母细胞进程中晚期时间点构建永久性标记克隆（图6c，d）。如果II类神经母细胞随时间推移而产生不同的INPs，那么在早期和晚期的神经母细胞克隆中应该含有不同的神经细胞类亚型。我们对克隆进行了Repo+胶质细胞及Bsh+神经元的检测，只所以选择这些标记是因为公认Repo+神经网胶质早期出现在II类神经母细胞谱系中，而与不同生成顺序相一致的Bsh+神经元则远离Repo+胶质。Bsh+神经元的数量只有在最晚时间点开始诱导的克隆中开始减少（图6e，g，i），说明它们在II类神经母细胞谱系中于晚期生成（图6j，灰色）。相反，Repo+胶质细胞只在那些早期诱导的克隆中检测到（图6f，h，i），说明它们是由早期II类神经母细胞特异性生成的（图6j，蓝色）。这使我们将Repo+胶质细胞指定为谱系中“早期神经母细胞，老龄INP”部分，而Bsh+神经元则为“晚期神经母细胞，年轻INP”部分（图6j）。我们得出的结论是II类神经母细胞经历时间性模式，并推论神经母细胞时间性模式与INP时间性模式共同作用来在成虫脑中增加神经类细胞的多样性（图6k）。图6
INP时间性模式与神经母细胞时间性模式组合作用来增加神经类细胞的多样性a，b，在最前端II类神经母细胞中D，Cas和Svp的表达。II类神经母细胞使用pointed-gal4UAS-GFP（GFP，绿色）和Dpn（品红）确认。c，d，使用R12E09D-gal4在早期（c）或晚期（d）幼虫阶段诱导的INP永久性谱系示踪示意草图；检测时间点为ALH120小时。灰色阴影为标记的INP及子代。e，f，Bsh+神经元及Repo+胶质细胞在II类神经母细胞谱系早期被永久性标记。聚焦面：Bsh，邻近神经母细胞；Repo，远离母细胞（-34um）。g，h，Bsh+神经元而不是Repo+胶质细胞在晚期II类神经母细胞谱系中被标记。聚焦面：Bsh，邻近神经母细胞；Repo，远离母细胞（-40um）。比例尺5um。i，定量分析。对于每个时间点n=5。NS指没有显著性。***P&0.001。j，从早期与晚期II类神经母细胞中产生的子代特异性比较。k，神经母细胞与INP的时间性模式共同作用来产生神经类细胞的多样性。讨论我们展示了INPs有顺序地表达三种转录因子（D，Grh和Ey），并且不同的神经类亚型是从连续的转录因子表达阶段产生的。似乎多个GMCs在已知的四个INP基因每个表达的阶段都能产生；而从某个特异性基因表达阶段产生的GMCs都具有同样的特征，或许可以像在胚胎性I类神经母细胞谱系中那样通过“亚时间性基因”而进一步特化。我们还展示了每个时间性因子对于产生特异的时间性神经类亚型是必需的。缺失D或Grh会导致Bsh+神经元的缺失；缺失Ey导致Toy+神经元和Repo+胶质细胞的缺失，虽然缺失细胞的命运并不清楚。一个未预料到的发现是Ey对INPs的寿命有限制作用。阻止INP去分化作用的机制已经清楚-缺失脑肿瘤翻译抑制子（Brat）或转录因子Earmuff（Erm）导致IINPs去分化而转化为肿瘤形成性II类神经母细胞-但终止正常INP增值的因子还未被确认。D到Grh到Ey的INP时间性特征因子在果蝇发育阶段的其他条件下也都用到。许多胚胎类神经母细胞有顺序地表达D和Grh。Ey在蘑菇体神经母细胞中表达，是成虫脑蘑菇体发育所必需的。有意思的是，D和Ey的哺乳动物同源物（SOX2和PAX6）在神经类前体细胞中表达，包括OSVZ前体，但还未被检测是否在时间性模式中起作用。我们展示了II类神经母细胞谱系中两个时间性模式轴：神经母细胞和INPs都随时间改变表达从而产生不同的神经元及胶质细胞，因而扩大了神经类的多样性。研究由OSVZ神经干细胞产生的INPs是否经历类似的时间性模式（也许使用SOX2和PAX6）以及组合的时间性模式是否对人类新生大脑皮层的神经类复杂性起作用将是非常重要的。（Article 2
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