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(最多只允许输入30个字)Genome | 宠辱不惊，一心问学！种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的，对应关；表3IlluminaCasava碱基识别与Phr；Phred分值；；不正确的碱基识别；1/101//10000；碱基正确识别率；90??.9?.99%；Q-scoreQ10Q20Q30Q40；对于RNA-Seq技术，碱基质量值分布具有两个特；（1）碱基质量值会随着测序序列（
种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的，对应关系如下表所示：表3 Illumina Casava碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系表Phred分值不正确的碱基识别1/101//10000碱基正确识别率90??.9?.99%Q-scoreQ10Q20Q30Q40对于RNA-Seq技术，碱基质量值分布具有两个特点：（1）碱基质量值会随着测序序列（Sequenced Reads）长度的增加而降低，这个特点是Illumina高通量测序平台都具有的特征；（2）前6个碱基的测序质量值较其他位置会低一些，推测前6个碱基测序错误率较高的原因为随机引物和RNA模版的不完全结合。以过滤后高质量序列的碱基位置作为横坐标，每个位置的平均测序质量值作为纵坐标，得到下面的测序质量分布图：图8 样品测序质量分布图2.4 测序碱基分布碱基含量分布检查用于检测有无AT、GC分离现象，而这种现象可能是测序或者建库所带来的，并且会影响后续的定量分析。在Illumina测序平台的转录组测序中，反转录成cDNA时所用的6bp的随机引物会引起前几个位置的核苷酸组成存在一定的偏好性。这种偏好性与测序的物种和实验室环境无关，但会影响转录组测序的均一化程度。除此之外，理论上G和C碱基及A和T碱基含量每个测序循环上应分别相等，且整个测序过程稳定不变，呈水平线。以过滤后序列的碱基位置作为横坐标，以每个位置的ATCG碱基含量的比例作为纵坐标，得到碱基含量分布图。 图9 样品碱基含量分布图3 比对分析3.1 比对率分析将各样品过滤后的测序序列与参考基因组进行比对，使其定位到基因组。对动植物样本，一般采用TopHat软件比对(Trapnell, et al., 2009)。TopHat是专门用于转录组数据比对的软件，其优点在于可将前期未比对上的序列切分后进行二次比对，从而达到鉴定Exon-Exon剪接位点的目的。Tophat软件进行序列比对时调用软件Bowtie2(Langmead, et al., 2009)对序列进行比对，使比对更加准确快速。TopHat比对原理示意图如下:图10 Tophat比对分析原理Tophat比对分析原理本项目分析中，我们使用TopHat版本号为v2.0.12，选用默认参数。在参考基因组选择合适并且组装完整，样品无外源物种污染的情况下，比对率通常都会大于80%。由于基因组中会存在重复区域，在比对中，会出现一条序列比对到基因组多个位置的情况（MultiMap Reads）。同时，因不同物种基因组中的重复区域比例不同，这种比对到多个位置序列的比例会随着物种的变化而有差异。下表为比对率统计结果示意图表：表4 样品的比对率统计表#libraryTotal ReadsMapped ReadsMapping RateUnmapped ReadsMulti Map ReadsMulti Map RateSample144,.0.0200
（1）Total Reads：过滤后总的序列数；
（2）Mapped Reads：比对上基因组的序列数；
（3）Mapping Rate：比对上基因组的序列数的比率；
（4）Unmapped Reads：未比对上基因组的序列数；
（5）Multi Map Reads：比对到基因组多个位置的序列数；
（6）Multi Map Rate：比对到基因组多个位置的序列数的比率。
比对上序列在染色体的分布指能唯一比对到基因组的Reads在各染色体（分正负链）的密度分布。通常以1K的滑动窗口（Window Size）为单位，计算该窗口中比对上的Reads的中位数，取对数值（log2）。一般情况下，染色体越长，定位到该染色体的Reads数也越多。根据染色体长度与定位的Reads数作图，可更直观展现比对上序列在染色体的分布，如下图： 图11 唯一比对序列在参考基因组染色体的分布3.2 基因区域分布比对上序列在基因区域的分布是指根据相关数据库中该物种的基因注释文件，统计基因三种功能元件（Exon，Intron和Intergenic）上唯一比对序列（即只比对上基因组一个位置的序列）的数目和比例。一般情况下，如果该物种的注释信息比较全面，大部分序列应该比对到Exon区域，可变剪接、噪音表达等会导致一些序列来源于Intron区域，新转录本、表达噪音等会导致源于基因间区序列产生。下表为一个样本唯一比对序列在参考基因组区域分布统计示意表：表5 唯一比对序列在参考基因组区域分布统计#SampleExonIntronIntergenicSample125,074,331(98.73%)142,165(0.56%)180,991(0.71%)下图为对应示意图：图12 唯一比对序列在参考基因组基因各区域的分布
根据序列的比对信息，分别统计比对到外显子、内含子和基因间区的序列数，并根据比例做出柱状图。
单样本唯一比对序列在参考基因组各区域分布图如下： 图13 单样品唯一比对序列在参考基因组基因各区域的分布3.3 均一性分析均一性是指测序的核酸序列的随机程度。若测序序列不偏向于基因的特定区域，则称其均一性好。若测序结果均一性很差，将直接影响转录组各项分析结果。一般情况下，由于随机引物反转录的随机性和测序的随机性，整个实验对基三亿文库包含各类专业文献、各类资格考试、中学教育、专业论文、高等教育、外语学习资料、有参转录组结题报告23等内容。　
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标准一： 1. read前20bp无N（这一条可以考虑不要） 2. 整条read中质量值低于20的碱基不超过20% 3. 整条read中质量值低于13的碱基不超过10% 4. 整条read的碱基平均值不小于20
标准二： 1. 前20bp没有N 2. 质量值低于10的碱基比例不超过10% 3. 质量值低于13的碱基比例不超过20% 4. reads平均质量值大于等于20
标准三： 1) 去除由于测序仪器硬件原因产生的信号强度极端的reads； 2) 去除总体质量偏低的reads，即Q>=20碱基比例小于50%的reads，其中，Q=-10logerror_ratio； 3) 去除3’端质量Q低于10的碱基，即碱基错误率为0.1； 4) 去除reads中含有的模糊的N碱基，可能是由于测序荧光强度不够造成； 5) 去除reads中含有的接头序列； 6) 去除长度小于20的reads； 7) 去除ribosome RNA等ncRNA reads。
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