基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建立-共享资料网
基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建立
西北大学 硕士学位论文 基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建 立 姓名：耿婷婷 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：陈超;崔亚丽
基于金磁微粒的化学发光免疫学检 测梅毒螺旋体抗体方法的建立 中文摘要梅毒是由梅毒螺旋体（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｎ，ＴＰ）感染引起的性传播疾病，具有高度传染性，是严重危害人类健康的传染病之一。近年来我国梅毒发病率呈明显上升趋势，因此，在蛋白或核酸水平建立梅毒的快速、高灵敏检测 方法对该病的预防、治疗及预后至关重要。血清学检测梅毒螺旋体抗体是目前临床诊断梅毒的重要方法，包括性病实验室研究试验（ＶＤＲＬ）、荧光螺旋体吸收试验（ＦＴＡ。ＡＢＳ）、梅毒螺旋体血球凝集试验（ＴＰＨＡ）、酶联免疫吸 附试验（ＥＬＩＳＡ）等。近年来，随着梅毒螺旋体ＴＰ人工重组抗原技术的进步， 以酶标板为载体，结合梅毒混合抗原，通过免疫学双抗原夹心比色法检测梅 毒抗体已成为国内三甲级以上医院通用的诊断方法，也是血站对梅毒螺旋体 ＩｇＭ和ＩｇＧ抗体筛查的指定方法，但方法灵敏度尚需进一步提高。鉴于灵敏 度较高的核酸检测方法尚无法在医院和血站大规模推广，因此，提高梅毒螺 旋体抗体免疫学检测方法的灵敏度具有重要意义。 结合磁性纳米粒子的超顺磁性和金表面生物分子可修饰性的双重特质，本课题组研制了Ｆｅ３０以ｕ磁性复合微粒，并将其实现了商业化（金磁微粒ＧｏｌｄＭａｇ＠）。本研究以金磁微粒为载体，结合化学发光检测系统，建立了ＴＰ抗体的磁酶免化学发光检测方法。研究内容包括４个部分：①ＴＰ混合抗原 免疫磁珠的制备；②磁分离酶联免疫反应条件的优化；③化学发光检测系 统的优化；④ＴＰ抗体磁酶免化学发光法检测方法的评价。将重组梅毒螺旋体混合抗原（包括ＴＰ４７、ＴＰ４４．５、ＴＰｌ７和ＴＰｌ５）包被 在金磁微粒（平均粒径５ Ｉ．ｔｍ）表面，在与被检样品以及辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的混合抗原的双抗原夹心酶联免疫反应后，ＨＲＰ结合在磁粒表面，然后引入化学发光物质鲁米诺，通过ＨＲＰ催化鲁米诺的化学发光强度的读取实现对样品中梅毒螺旋体抗体的检测。结果表明，ＴＰ抗原包被量为５ｔＪｇ／ｍｇ，方阵实验结果显示ＨＲＰ标记抗原的最佳工作浓度为１：３０００稀释，选择免疫学反应的温育时间为３０ ｍｉｎ，以１×ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ ８．Ｏ）为化学发光缓冲介质，鲁米诺、过氧化氢及对碘苯酚的浓度分别为ｌ ｘ１０一ｍｏｌ／Ｌ，ｌｘ１０。ｍ饥和３ｘ１０一ｍｏｌ／Ｌ，建立了ＴＰ阳性血清稀释倍数与其相对发光强度之间的标准曲 线，方法具有良好的线性关系，Ｒ２＝Ｏ．９９８８。与以酶标板为载体测定ＴＰ抗体的商品化试剂盒（ＥＬＩＳＡ法）做了比较，单纯以金磁微粒为固相载体的检测 灵敏度可提高２倍，若进一步引入化学发光检测系统，其灵敏度可提高１６ 倍。本方法对阳性血清重复测定１１次的结果显示，其相对标准偏差（ＲＳＤ）为５．５％。以金磁微粒为载体的ＴＰ抗体磁酶免化学发光法具有灵敏度高，操作简单的优点，该方法对标准血清盘的测试仍在进行中，方法在血站筛查及临床 检测领域具有潜在的应用价值。关键词：梅毒螺旋体，抗体，金磁微粒，免疫学检测，化学发光ｎＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇＧｏｌｄＭａｇ＠ｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓｃａｒｒｉｅｒＡｂｓｔｒａｃｔＴｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ（ＴＰ）ｉｓｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｓｙｐｈｉｌｉｓ ｗｈｉｃｈ ｉｓａｋｉｎｄ ｏｆｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆ ｓｙｐｈｉｌｉｓａａｓｃｅｎｄｓｇｒａｄｕａｌｌｙ ｉｎｔｏＣｈｉｎａ ｌａｓｔ ｄｅｃａｄｅ ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｄｅｔｅｃｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ／ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｈｅｏｒｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｒｓｙｐｈｉｌｉｓｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ．ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ＴＰ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ＴＰａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｓｅｒｕｍ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｖｅｎｅｒｅａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＶＤＲＬ），ｒａｐｉｄ ｐｌａｓｍａｒｅｇａｉｎ（ＲＰＲ），ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍｔｒｅｐｏｎｅｍａｌａｎｔｉｂｏｄｙ―ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｅｓｔ（ＦＴＡ―ＡＢＳ），ｔｅｓｔ（ＴＰＨＡ）ａｎｄｅｎｚｙｍｅ―ｌｉｎｋｅｄｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）．Ｗｉｔｈｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｏｆ ＴＰｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｍｉｅｒｏｐｌａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｓａｎｄｗｉｃｈｅｓＥＬＩＳＡ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄＩｇＭｏｒＩｇＧ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｓｓｙｐｈｉｌｉｓｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｏｎｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｎｏｔ ｙｅｔａｌｉｍｉｔｅｄ．Ｎｏｗａｄａｙｓ，ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｔｏｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ＴＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔ ｉｓ ｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｄｅｖｅｌｏｐｎｅｗ ｈａｖｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｅＦｅ３０ｄＡｕｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｗｅｃｏｍｐｏｓｉｔｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｈｉｃｈｈａｖｅａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｂｏｔｈ ｍａｇｎｅｔｉｃｗｅｒｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｃｏｌｌｏｉｄｇｏｌｄ．ＴｈｅｓｅＡｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓｕｓｉｎｇｎａｍｅｄａｓＧｏｌｄＭａｇ＠ａｎｄ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ．ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄＧｏｌｄＭａｇ＠ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＰ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ：１．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＰａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；２．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆ ｔｈｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ；３．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ；４．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＴｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓａｓｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ．ｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：ｔｈｅ ＧｏｌｄＭａｇ＠ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ＴＰ １ ５）ｗａｓｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｘｅｄｓｅｒｕｍＴＰａｎｔｉｇｅｎｓ（ＴＰ４７，ＴＰ４４．５，ＴＰ １ ７ ａｎｄ ＨＲＰ―ｌａｂｅｌｅｄｐａｒｔｉｃｌｅｓａｍｐｌｅａｎｄｔｈｅｎ ｔｈｅｏｎＴＰ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｗａｓａｄｄｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍｅｄｓａｎｄｗｉｃｈ ｃｏｍｐｌｅｘｍａｇｎｅｔｉｃｓｕｒｆａｃｅ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｉｎ０１．Ｈ２０２．ＰＩＰ）ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＨＲＰ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｗｅｒｅ ｒｅａｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ＴＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｓｅｌｑｌ／ｎ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ Ｗａｓ ５肛ｇａｎｔｉｇｅｎｓｏｎ１ ｍｇ ｐａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄ３０ ｐｇ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｅｒｅＩｌＩｕｓｅｄａｓｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒｏｎｅｔｅｓｔ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＨＲＰ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｗａｓ１：３０００ ａｎｄ ３０ ｍｉｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｆｏｒｍ ｔｈｅｓａｎｄｗｉｃｈ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｌｕｍｉｎｏｌ，Ｈ２０２ ａｎｄ ＰＩＰ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ １ ｘｌＯ―ｍｏｌ／Ｌ，１ ｘｌＯ。ｍＬ／Ｌ ａｎｄ ３ｘｌＯ。 ｍｏｌ／Ｌ ｉｎ １×ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ８．０），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｒｅｌａｔｉｖｅｃｕｒｖｅｗａｓ ｐｌｏｔｔｅｄ ｂｙｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙＶＳｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆａＴＰ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ（Ｒ２＝０．９９８８）．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ｂａｓｅｄ １ １ ｔｉｍｅｓｏｎＴＰ Ｗａｓ １ ６ ｔｉｍｅｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ．Ｔｈｅ（ＲＳＤ）Ｗａｓ ５．５％ｉｎＴｈｅｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｓｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ． ｔｈａｔ ｔｈｅ ＧｏｌｄＭａｇ＠ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂａｓｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓａｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ＴＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｒｅｌｉａｂｌｅ，ａｎｄ ｅａｓｉｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅａｎｄｐｒｅｍｉｓｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｉｎ ｓｙｐｈｉｌｉｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＴＰ，ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＧｏｌｄＭａｇｌｍｍｕｎｏａｓｓａｙｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＥＬＩＳＡ，ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＷ西北大学硕士学位论文缩略语表缩略语１１Ｐ英文名称Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ中文名称 梅毒螺旋体 酶联免疫吸附试验ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙＲ队ＨＲＰＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ放射免疫测定 辣根过氧化物酶３，３ ７，５，５’一四甲基联苯胺ＴＭＢ３，３’，５，５＇－ＴｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ心ＦＩＴＣ ＰＢＳ碱性磷酸酶异硫氰酸荧光素 磷酸盐缓冲液ＴｒｉｓＴｒｉ－０ａｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ三羟甲基氨基甲烷临界值 相对标准偏差ＣＯＶ ＲＳＤＣｕｔｏｆｆＶａｌｕｅＲｅｌａｔｉｖｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＤｅｖｉａｔｉｏｎＭＡ认ＣＬｍａｇｎｅｔｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｍｍｕｏａｓｓａｙ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ磁分离酶联免疫化学发光 化学发光免疫分析ＣＬ队ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＣＬＥＩＡ化学发光酶免疫分析Ｅｎｚｙｍｅ ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＥＤＴＡ ＰＣＲｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ乙二胺四乙酸 聚合酶链反应 免疫磁性微粒 免疫磁珠 单克隆抗体 暗视野显微镜法ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓＩＭＭＳ ＩＭＢｍＡｂ ＤＦＭＩｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃＩｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙＤａｒｋ Ｆｉｅｌｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ西北大学学位论文知识产权声明书本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：）ｎｑ年‘月ｚ日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 擎位姗懈签轹．◆ｍ 型ｑ年硒阳 亏训第一章文献综述第一章文献综述１梅毒概述梅毒（Ｓｙｐｈｉｌｉｓ）是一种由梅毒螺旋体（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ，ＴＰ）引起的性传染病，该病潜伏期长短不等，临床表现复杂，可感染人体各种器官并产生多种临床表现。近年来我国梅毒发病率急剧上升，年增长５１．６３％ｔ１１。梅毒病人是梅毒螺旋体唯一的传染源，可通过胎盘先天传给胎儿，后天性梅毒主要通过性交传染， 少数可通过血液传染。 １．１梅毒的流行病学 梅毒在１５世纪末传遍整个欧洲，１６世纪，梅毒也曾带来许多与当今艾滋病一样的社会特征【２１。世界各国梅毒的流行情况差别很大，１９９７年，美国的早期梅毒发病率统计数据为３．２／１０万，但其东南部某些城市，早期梅毒发病率高达２８．４／１０万【３１。流行病调查的结果还表明，梅毒发病率高的地区，相应感染艾滋病毒的增长率也快【４】。１６世纪初，梅毒传入我国并广泛流行，新中国成立后，各级政府积 极采取一系列的防治措施，于２０世纪６０年代基本消灭。上世纪８０年代以来，梅 毒在我国再次复燃，据全国性病控制中心统计，首例梅毒病例在１９７９年重庆市报 告后，我国病例数逐年增多，１９９３年后呈现大幅上升趋势，全国梅毒报告发病率 至１９９８年达４．３１／１０万，是１９９３年的２５倍，年均增长达９０．９％【５１，且神经梅毒和先天梅毒发病率上升【６】。２００５年统计结果显示出更为严峻的形势，较２００４年增长了２８．７４％【｜７１。国家卫生部２００７年公布的甲、乙类法定报告传染病中，梅毒发病人 数已从２００５年的第５位跃居第３位【８１。因此，梅毒在我国己成为一个严峻的公共 卫生问题。 梅毒病人是唯一的传染源，主要通过性交由破损处传染，性接触传染占９５％。 梅毒螺旋体大量存在于皮肤粘膜损害表面，也见于唾液、精液、乳汁、尿液中。 梅毒亦可通过干燥的皮肤和完整的粘膜感染，当接触部位附有梅毒螺旋体时，还 可通过哺乳、接吻等密切接触而传染。感染一年内未经治疗的病人最具传染性， 随着病期延长，传染性变小，病期超过４年者，通过性接触无传染性。此外输血 时如供血者为梅毒患者可感染受血者。１９１５年，世界上首次报道了梅毒经输血传 播［９１。因梅毒螺旋体为厌氧性，体外不易生存，且对干燥极为敏感，故不易通过各 种器物间接传染。先天梅毒是患有梅毒的孕妇通过胎盘传染给胎儿，妊娠前四个２月北＾学日Ｊ’学位论文月，因滋养体的保护作用，梅毒螺旋体一般不能通过，故妊娠前四个月胎儿不被 感染，以后滋养体萎缩，梅毒螺旋体可通过胎盘进入胎儿体内传染给胎儿。１２梅毒螺旋体生物学特征 梅毒螺旋体属于螺旋体目（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ）螺旋体科（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ）密螺旋体属（Ｔ陀ｐｏｎｅｍａ）。梅毒螺旋体是～种呈螺旋状的厌氧微生物，长６－２０ ｕｍ，直径为００１．０１８ｕｍ（图１－１）㈣，小而纤细，透明而不易着色。１９０５年，首次由Ｓｃｈａｕｄｉｒｍ和Ｈｏｆｆｍａｎ在二期梅毒损害的渗出物涂片中发现梅毒螺旋体，因其苍白透明，所以常在暗视野显微镜下观察㈣。研究用梅毒螺旋体标准株（Ｔｍｐｏｎｅｍｃｌｐａｌｌｉｄｕｍ．ＮｉｃｈｏｌｓＳｗａｉｎ）是Ｎｉｃｈｏｌｓ于１９１２年从梅毒病人的脑脊液中分得到的［”】，至今未能在体外培养成功，但梅毒螺旋体可在组织（如兔子的睾丸）内有限度的扩增培养㈣。斟１－Ｉ梅毒螺旋体的扫描‘Ｕ镜幽ＦｉｇＩ?１ ＳＥＭＩｍ８９ｅ ｏｆ＇Ｌｐａｌｌｉｄｕｍｌ３致病机理及临床表现 梅毒螺旋体的致病性是由其表面存在的荚膜样粘多耱导致，梅毒螺旋体不能自行合成英膜中所含的Ｎ一￡酰－Ｄ。半乳椿胺，需要从宿主细胞获得。梅毒螺旋体通过自身粘多糖酶，吸附在奇主组织细胞表面的粘多糖受休上，分解宿主细胞的粘多糖，从而获取Ｎ．乙酰一Ｄ一半乳糖胺。山于粘多糖是宿１‘组织和血管支架的重要摹 质组成成分，粘多糖被梅毒螺旋体分解后，奇主组纵受到损伤破坏，引起血管的第一章文献综述塌陷、血供受阻，从而造成管腔闭合性动脉内膜炎、动脉周围炎及坏死和溃疡等 病变。 根据梅毒发展可分为一期梅毒（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、二期梅毒（ｓｅｃｏｎｄｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｌａｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｙｐｈｉｌｉｓ，ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、三期梅毒（ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｙｐｈｉｌｉｓ．ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｓｙｐｈｉｌｉｓＮｅｕｒｏｓｙｐｈｉｌｉｓ）以及先天梅毒（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｓｙｐｈｉｌｉｓ）［１４－１６】。自然条件下性接触时，被梅毒螺旋体损害生殖器的一方性伴可将梅毒螺旋体传给性伴另一方的粘膜。梅 毒螺旋体在感染部位增殖，继而侵入皮下，数分钟内即可到达局部淋巴结，数天 内播散到全身。通常４天内梅毒螺旋体就可以侵蚀局部淋巴结，引起肿胀和淋巴 结病继而扩散，随后大量进入血液。在９～９０天，为局限性淋巴结病和原发侵蚀（硬 下疮）期，平均为２１天。６０％的感染者对硬下疮期无明显感应，实际上９７％的感 染者的确显示有原发侵蚀。约２￣６周后，硬下疮自发愈合，但淋巴结病仍然存在。 大约平均第４６天（３０～７０天），一期感染向二期损害发展。如果没有进行有效治疗， 梅毒螺旋体将随血液迁移，感染后６￣１２周，即发生硬下疮后２～８周后发展为二期， 此时抗体检测呈强阳性。梅毒螺旋体一旦进入血液，则继续快速侵入人体所有脏 器和体液。进入二期梅毒期后，临床表现最为典型，出现高含量梅毒螺旋体血症 峰值期，并发生全身感染，具有全身各系统及粘膜表现。二期梅毒期间，梅毒螺 旋体可从血流中清除，这可能是由于可进入补体溶解过程。未经治疗的二期梅毒 持续时间平均为３．６个月（１～１２月）。 ５０％病例在二期后不再有传染性或不再有任何症状，可认为已经痊愈。另外 ５０％患者则进入持续潜伏期，无症状表现，此期如果梅毒血清学试验阳性，则仅说 明感染【１７１。梅毒潜伏期无症状，唯一感染的证据是血清学试验阳性，梅毒螺旋体 呈静止状态，没有皮肤表现或临床症状，但在靶器官中梅毒螺旋体可能繁殖旺盛。 虽然大多数潜伏期患者无症状，但１／３患者的三期梅毒持续时间约为１０．３０年，也 有可能持续终生，或经过数年或数十年病情恶化，而成为三期梅毒，严重者可引 起梅毒瘤，主动脉和中枢神经系统梅毒疾病‘１ ７】等。２梅毒螺旋体的检测２．１梅毒螺旋体病原学检测 在梅毒一期，梅毒螺旋体抗体尚未产生或滴度很低，采取血清学反应检测， 绝大多数呈阴性并且临床上常无自主症状，易被漏诊或误诊。早期梅毒皮肤粘膜 损害检查，可直接观察分泌物中的梅毒螺旋体，主要有暗视野涂片检测、镀银染４西北大学硕士学位论文色检测和免疫荧光染色检测。这些梅毒螺旋体病原学检测方法虽然灵敏度低，但却是最特异、准确的早期梅朵螺旋体感染的诊断方法［１８】。 ２．１．１暗视野显微镜法 暗视野显微镜法（ＤａｒｋＦｉｅｌｄＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＤＦＭ）是梅毒病原体检测的主要方法之一，适用于有皮肤粘膜损害的早期梅毒诊断。通过暗视野显微镜直接观察 病灶分泌物，如观察到典型的梅毒螺旋体，结合临床症状即可直接诊断为梅毒。 该方法特异性高、经济快速，是最直接、准确的方法之一，对早期显性梅毒的诊 断以及与生殖器疙疹、软下疮的鉴别诊断均具有重要意义。但由于受条件致病螺 旋体、内用抗生素及外用药物、检测人员技术水平以及病程等多种因素影响，导致其敏感性较低，约为７４．６％ｔ１９】。因此，通过暗视野显微镜检查为阴性者并不能排除梅毒的可能，此方法也并不适用于口腔病灶材料以及晚期及隐性梅毒患者。２．１．２梅毒螺旋体镀银染色法镀银染色能使梅毒螺旋体呈棕褐色或棕黑色，染色层次清楚，反差明显，形 态清晰，背景为黄色，其阳性检出率高于暗视野检查法。但因为类似梅毒螺旋体 的其它物质也被染色，该方法不能观察梅毒螺旋体运动方式，需谨慎判断镀银染 色的阳性结果。‘ ２．１．３梅毒螺旋体免疫荧光染色法 将抗梅毒螺旋体抗血清或单克隆抗体结合在非致病性螺旋体培养物表面，与 异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）相结合，梅毒螺旋体在荧光显微镜下呈绿色荧光，分为 直接免疫荧光法和间接免疫荧光法。 直接免疫荧光法是将受检标本均匀涂布于载玻片上（直径小于１．０ ｅｍ），待自然 干燥后用丙酮固定１０ ｍｉｎ，用抗梅毒螺旋体抗血清与ＦＩＴＣ结合，适当稀释后涂于 备有标本的载玻片上，３７℃温浴３０ ｍｉｎ，最后彻底清洗，甘油封固，荧光显微镜 检查。 间接免疫荧光法的受检样本制作及固定与直接法相同，但其加入经吸收后的 抗血清，３７。Ｃ温浴３０ ｍｉｎ，彻底冲洗干净，甘油封固后镜检。可区分出梅毒螺旋体与其它致病性螺旋体，对口腔、肛门等部位的损害有鉴别价值，但因为受检样本、ＦＩＴＣ、抗血清质量以及操作技术等方面影响可能导致假阴性。第一章文献综述２．１．４多功能显微诊断仪多功能显微诊断仪（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＭＤＩ）是近年来国外开发的一种综合相差对比、暗视野及偏振光的可变投影显微镜，放大 ４０＂－１５００倍。其优点是待检标本不需染色及任何加工处理，而是直接观察“活的＂ 真实标本，并可对观察结果实时观察并同时拍照，具有直接、方便、快速、准确 等优点。ＭＤｌ用于一期梅毒诊断的阳性率可达８３．５％ｔ１９】。但该方法所需整套检测 仪器、显示器、录像机、打印机，设备价格昂贵，很难普及应用。 ２．２梅毒螺旋体血清学检测 目前诊断梅毒最常用的方法是梅毒螺旋体血清学试验【２０】，特别是在梅毒诊断 二期、三期梅毒，梅毒的发展和痊愈以及判断药物疗效方面，该方法都十分重要。 梅毒螺旋体侵入机体破坏组织后，组织中磷脂粘附于螺旋体表面形成复合抗原， 刺激机体产生自身抗体（亦称反应素）及非特异性抗心磷脂质抗体。此外，针对 菌体还产生具有种属特异性的ＩｇＭ和ＩｇＧ抗体，即抗梅毒螺旋体抗体，具有很强 的特异性。因此梅毒血清学检查包括非特异性梅毒螺旋体血清学试验和特异性梅毒螺旋体血清学试验两个方面。２．２．１非特异性梅毒螺旋体血清学试验 包括性病研究实验室试验（Ｖｅｎｅｒｅａｌ血清不加热的反应素试验（ＵｎｈｅａｔｅｄＤｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｓｔ，ＶＤＲＬ）、Ｓｅｒｕｍ ＲｅｇａｉｎＴｅｓｔ，ＵＳＲ）、快速血浆反应素环状卡片试验（ＲａｐｉｄＰｌａｓｍａ Ｒｅａｇａｉｎ Ｃｉｒｃｌｅ ＣａｒｄＴｅｓｔ，ＲＰＲ）和甲苯胺红不加热血清 Ｔｅｓｔ，ＴＲＵＳＴ）。此方法测定血反应素试验（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ Ｒｅｄ Ｕｎｈｅａｔｅｄ ＳｅｒｕｍＲｅｇａｉｎ清中的心磷脂抗体，属初筛试验。操作简便，成本低廉，可快速诊断，适用于基 层推广和人群调查。ＶＤＲＬ用心磷脂、卵磷脂及胆固醇为抗原，可作定量及定性 试验，试剂及对照血清已标准化。此法可用显微镜读取结果，但对一期梅毒敏感 性不高。ＲＰＲ采用改良后的ＶＤＲＬ抗原，敏感性及特异性与ＶＤＲＬ相似，但可通 过肉眼读取结果。ＵＳＲ也是ＶＤＲＬ使用抗原经改良后建立的方法，敏感性及特异 性与ＶＤＲＬ相似。将ＲＰＲ试验和暗视野显微镜法相互结合可对一期梅毒作出早期 诊断【２ｌ】。由于多种疾病患者血清中均含有引起免疫学反应的心磷脂，故该检测方法特异性较差，假阳性结果可见于红斑狼疮、类风湿关节炎以及吸毒、妊娠等阎多种病理状况。此外，标本溶血、血清不新鲜及器具污染等人为因素对试验结果 也有干扰。早期梅毒患者经有效治疗后，反应素可能消失，早期未经治疗到晚期６西北大学硕士学位论文时，部分病人体内反应素也会减少或消失，因此此类试验只适用于二期梅毒的诊 断，不适用于一、三期梅毒【２３１，包括潜伏梅毒、神经梅毒的诊断。国家标准将此 类试验作为梅毒的初筛试验，阳性标本需用特异性梅毒螺旋体血清学试验确认。 ２．２．２特异性梅毒螺旋体抗体血清学试验该方法以梅毒螺旋体和非致病密螺旋体或其特定蛋白成分作为抗原测定抗梅 毒螺旋体抗体，敏感性和特异性均很高，可作为确认试验。方法主要检测血清中 抗梅毒螺旋体ＩｇＧ或ＩｇＭ抗体，即使经过治疗梅毒螺旋体抗体仍能长期存在，血清反应持续呈现阳性，因此不能作为观察疗效的指导方法。 对梅毒螺旋体抗体的检测方法包括梅毒螺旋体血球凝集试验（ＴｒｅｐｏｎｅｍａｌＰａｌｌｉｄｕｍＨｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎＡｓｓａｙ，ＴＰＨＡ）、荧光密螺旋体抗体吸收试验（ＦｌｕｏｒｅｓｅｎｔＡｎｔｉｂｏｄｙ－ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎＴｒｅｐｏｎｅｍａｌＴｅｓｔ．ＦＴＡ．ＡＢＳ）、梅毒螺旋体明胶凝集试验（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ Ｐａｌｌｉｄｕｍ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｐａｒｔｉｃａｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ，ＴＰＰＡ）和梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ―ｅｎｚｙｍｅ Ｔｐ―ＥＬＩＳＡ）等。ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，（１）梅毒螺旋体血球凝集试验（ＴＰＨＡ）：以细胞（火鸡或绵羊血红细胞）做载 体，吸附从兔睾丸中提取的粗制梅毒螺旋体粉碎物作为抗原，检测血清中特异性 梅毒螺旋体抗体，并以未经抗原包被的细胞做对照。将阳性标本和致敏红细胞混合，经过抗原抗体结合，引起致敏红细胞凝集，在血凝板的微孔底部形成凝集块，如为阴性标本，则在微孔底部形成致密的沉淀。目前国内医院常用该方法对梅毒血清确认试验，具有很高的敏感性和特异性。但血球凝集试验测定过程中包括多次稀释过程，结果依赖于操作者肉眼判断和解释，易造成判断差错【２４】。另外，由 于ＴＰＨＡ使用完全抗原，可能存在非特异性交叉反应，使该方法受到一定的限制。 梅毒螺旋体乳胶凝集试验（ＴＰＰＡ）用乳胶颗粒代替红细胞作为载体，采用梅毒螺 旋体天然抗原作为诊断抗原，不受生物因素影响，有更高的特异性ｆ２副。但由于梅毒螺旋体至今不能体外人工培养，抗原来源难度较高，因而ＴＰＰＡ试剂盒成本高，不能自动化，方法受主观判断影响，使方法的使用受到一定的限制。（２）荧光密螺旋体抗体吸附试验（ＦＴＡ－ＡＢＳ）：用完整的梅毒螺旋体作抗原， 在患者血清中加入吸收剂除去非特异性抗体后，用间接免疫荧光技术检测患者血 清中是否存在抗梅毒螺旋体抗体。ＦＴＡ．ＡＢＳ试验对各期梅毒特异性达９２％，敏感７第一章文献综述性分别为一期为８０％、二期为９９％．１００％、三期为９５．１００％［２６１。美国常用此试验作为梅毒的确认试验【２７１。但ＦＴＡ．ＡＢｓ试验的提取物为活菌，存在潜在危险性，且需 荧光显微镜［２８】。此外还需要具有一定专业技能和工作经验的操作者，因此方法还 具有一定的局限性。（３）梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（Ｔｐ．ＥＬＩＳＡ）：将ＴＰ重组抗原应用于酶联 免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）后，极大地提高了检测灵敏度和特异性。该方法将ＴＰ重组抗原包被在酶标板上，加入辣根过氧化物酶（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ）标记 的重组抗原以及待测样本进行免疫学反应，通过双抗原夹心ＥＬＩＳＡ法测定患者血 清中的梅毒螺旋体特异性抗体［２９－３１】，ＨＰＲ催化底物显色后，测定４５０ ｎｌｎ处吸光度 值可间的结果。因重组抗原具有高纯度、高特异性、易于制备等优点，加之酶标法易于操作及标准化，该方法已被指定为血站血源初筛和临床诊断的重要方法。目前，梅毒螺旋体全基因组ＤＮＡ序列已被解析【３２】并已经根据结果成功表达了２０多种重组梅毒螺旋体抗原，包括Ｔｐｌ５，Ｔｐｌ７，Ｔｐｌ９，Ｔｐ２９－３５，Ｔｐ４４．５，Ｔｐ４７等。以基因重组技术制备ＴＰ抗原代替天然抗原，建立的酶联免疫吸附试验已经用 于血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测【３３１。这种检测方法有以下优点：（１）使用基 因工程技术表达的ＴＰ特异性重组抗原，解决ＴＰ体外难以培养而带来的抗原来源问题；（２）传统ＴＰ抗原制备方法在裂解提取过程中存在很大的纯度差别，存在交叉反应和污染问题，而使用特异性ＴＰ重组抗原极大地提高了方法的特异性，保证了检测结果的准确性；（３）针对某些特定抗原的血清抗体水平可随有效的抗菌素 治疗呈下降趋势的特点，也可作为判断疗效的有效方法。 研究表明，ＴＰ．ＥＬＩＳＡ是目前检测梅毒的优选方法，和ＴＰＨＡ、ＴＰＰＡ等方法 有良好的相关性，敏感性为９３．Ｏ％．１００％，特异性为９８．３％．９９．８％【３４，３５１。Ｍａｔｔｈｅｗ ＭｃＫｅｖｉｔｔ等【３６】克隆表达ＴＰ抗原，发现至少有１２种蛋白有很强的反应原性。其中Ｔｐ ４７、Ｔｐ １５、Ｔｐ１７三个内膜脂蛋白具有很强的抗原性［３７－３９１。Ｓａｍｂｒｉ课题组【柏】利用免疫印迹试验研究证实，至少有９种梅毒螺旋体多肽可用作主要免疫原，其中５ 种重组抗原Ｔｐ１５、Ｔｐ１７、Ｔｐ ３。７、Ｔｐ４４．５、Ｔｐ４７等在梅毒血清学诊断中具有重要价值。单独或联合使用这些重组抗原建立的梅毒螺旋体抗体血清学检测方法，在 应用中体现出较好的敏感性和特异性【４卜４７】，显示出在梅毒特异性血清学检测中具 有广阔的应用前景。西北大学硕士学位论文３．免疫磁珠及其应用将磁性复合微粒简称磁性微粒用于免疫学研究领域，科学家形象地将其称为免疫磁性微球（Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｅ ｍｉｅｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，ＩＭＭＳ），或称免疫磁珠（Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ，ＩＭＢ）。３．１磁性复合微粒的概念及组成磁性复合微粒是２０世纪７０年代末发展起来并被广泛用于生物医学领域的超顺磁性纳微米复合粒子，是由高分子或无机材料与磁性超细粉末（包括磁性金属如Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ或其金属氧化物等）构成的胶态复合物。通常情况下，磁性复合微 粒通过热运动保持胶体的稳定性，在外加磁场作用下，磁性粒子的超顺磁性可保 证既可被快速分离，本身又不会被永久磁化。纳微米级磁性复合微粒具有较高的 比表面积，表现出较强的吸附能力。通过物理吸附，或利用修饰在磁性复合微粒 表面的活性基团可将酶、抗体、寡核苷酸及核酸等生物活性物质偶联在其表面。 表面固定有链亲和素的磁性复合微粒还可与生物素标记的生物分子特异结合而将 其固定在磁性微粒表面【４８１。因此，偶联有生物分子的磁性复合微粒可广泛应用于环境监测、酶的固定化、细胞分离、靶向给药、免疫分析、核酸分离纯化等领域。按其结构的不同，磁ｊＩ生微粒可分为简单结构、核壳结构、夹心结构；按其组 成成分的不同，又可分为有机／无机磁性微粒和无机／无机磁性微粒。有机／无机磁性 复合微粒主要以磁性材料（铁．、铁氧化物、钴、镍、正铁盐等）与天然高分子、有机合成高分子、有机小分子等组成的复合材料。无机／无机磁性复合微粒是由无机物与磁性纳米粒子复合而成，常用的无机物有Ｓｉ、Ｓｉ０２、Ａｕ、Ｃ等。这些无机／无机磁性复合微粒赋予了磁性微粒新的特性。如Ｔｅｎｇ Ｘ．Ｗ等【５ｌ】合成的Ｐｔ＠丫．Ｆｅ２０３纳米微粒，Ｅｌｋｉｎｓ Ｋ．Ｅ等【４９】、Ｃｈｅｎ Ｍ等【５０］用还原的方法合成粒径大小 可调的Ｆｅ．Ｐｔ纳米微粒，因Ｐｔ、Ｎｉ等的复合，可改善其磁学性质，增强纳米微粒的饱和磁化强度，从而提高磁响应性。３．２磁分离酶联免疫法的原理及应用 磁分离酶联免疫法（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＭＡＩＡ）是２０世纪８０年代中期由瑞士Ｓｅｒｏｎｏ诊断中心发明的一种免疫检测新技术（美国专利号４６５９６７８）， 该技术将酶联免疫检测系统与磁性微粒相结合，与传统的ＥＬＩＳＡ及ＲＩＡ相比，第一章文献综述ＭＡＩＡ技术使用磁性微粒替代传统酶标板作为固相载体，磁性微粒颗粒微小，比表 面积大，生物分子等物质在其表面偶联容量大；悬浮稳定性好，更有利于抗体抗 原间反应充分，因而ＭＡＩＡ技术具检测速度快、特异性高、灵敏度高、重复性好、 无放射性污染等优点，该方法在食品安全检测、环境监测及医学检测等领域有着 很好的应用前景。 瑞士Ｓｅｒｏｎｏ公司首先应用０ｃ．纤维素包裹Ｆｅ３０４的磁性微粒作为羊抗．异硫氰酸 荧光素（ＦＩＴＣ）抗体的载体，建立了磁性均相酶联免疫分析系统，并推出系列产 品，其设计原理如图１．２。该系统采用直径约为２ ｇｍ的磁性微粒，大大增加固相 载体的比表面积，缩短了反应时间，试剂有效期从放免试剂的１个月提高到１２个 月，检测的灵敏度和准确率也得到了相应提高。―一图１?２Ｆｉｇ．１－２外加磁场Ｓｅｒｏｎｏ公司磁性均相酶联免疫分析系统不意图Ｓｃｈｅｍｅ ｏｆ ＭＡＩＡ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂｙ Ｓｅｒｏｎ Ｉｎｃ．Ｆａｎ等【＿７４】在磁性微粒上固定抗体，与待测物中的抗原结合，加入胶体金标记的 抗体，形成抗体．抗原．抗体的夹心复合物后，将标记在磁性微粒上的金在酸性条件 下氧化形成Ａｕ３＋，并利用Ａｕ３＋催化的鲁米诺发光系统来检测人ＩｇＧ，其灵敏度可达 １０‘１２Ｍ，可用于免疫检测和核酸杂交检测中。Ｊｗａ．Ｍｉｎ Ｎａｍ等【７５】利用磁性微粒和胶 体金上ＤＮＡ的放大作用建立了蛋白质的超灵敏检测方法，在磁性微粒上固定针对 ＰＳＡ靶物的特异性抗体，在标记有双链寡核苷酸探针的胶体金上同时固定有针对 ＰＳＡ抗体的二抗，因此可与磁性微粒结合并从溶液中分离出来，将胶体金上互补的ｌＯ西北大学硕士学位论文寡核苷酸探针变性解离，由于胶体金上标记大量的ＤＮＡ片段，因此可对待测物起 到放大作用。洪霞等【９５】等利用Ｆｅ３０４／葡聚糖纳米微粒建立了磁性微粒介导的免疫层析试纸条，配合高灵敏的磁测仪开发，该研究为磁性微粒免疫层析试纸条的研究 应用奠定了基础。 ３．３金磁微粒的组成及应用 胶体金很早就被用于生物分子的标记和检测，将磁性纳米粒子在外磁场中的 可分离性和胶体金特性结合起来，制备组成为Ｆｅ／Ａｕ、Ｆｅ３０ｄＡｕ、Ｃｏ／Ａｕ等磁性微 粒。金磁微粒是一种新型磁性无机物复合微粒，由胶体金颗粒与磁性粒子复合形 成的，这种材料兼有磁性粒子在外磁场中的可分离性以及对生物分子的快速固定 化等特点，在生物与医学领域具有重要的应用前景。Ｏ’ＣｏｎｎｏｒＣ．Ｊ［５４－５７】等人，采用反相胶束法开展Ｆｅ＠Ａｕ纳米颗粒的制备工作，合成了核为６ ｎｎｌ，壳为２ ｎｉｎ的Ｆｅ＠Ａｕ纳米微粒。Ｃｈｅｎ【５８】课题组合成了针状和球状两种Ｆｅ＠Ａｕ纳米微粒，包金后，即使在热酸溶液中针状Ｆｅ＠Ａｕ纳米微粒的矫顽力也未见明显的变化，且其饱和磁化强度比包覆前略有增强：而球形Ｆｅ＠Ａｕ纳 米磁粒表现为较弱的铁磁性，因在金包覆过程中的部分氧化，导致其饱和磁化强 度降低。Ｒａｖｅｌ．Ｂ ｉｓ９】等利用反相胶束法合成了粒径均一的Ｆｅ＠Ａｕ纳米微粒，并 首次采用ＸＡＳ测定铁在复合微粒中的价态。另外，Ｃｏ＠Ａｕ复合纳米微粒的制备也有所报道【６０捌】，Ｂａｎ课题组在非水溶剂中制备了Ｃｏ＠Ａｕ核壳纳米微粒，经过８％ ＨＣＩ处理后，利用ＸＲＤ、ＴＥＭ、ＳＱＵＩＤ等进行了表征，平均粒径约１０ ｎｌｌｌ，高分辨电镜下可见核壳结构，在３００Ｋ时表现为超顺磁性，该粒子在酸条件下稳定，适 用于生物应用。２００１年，Ｃｕｉ．ＹＬ［６２－６３］等人开展了Ｆｅ３０４＠Ａｕ的制备机理的探讨， 课题组成功制各纳米级具有核壳结构和微米级具有组装结构的Ｆｅ３０ｄＡｕ金磁微 粒，之后制备了其光学性质和磁学特性［６４】，并将其用于抗体固定化和免疫学检测【６５】。Ｌｙｏｎ．Ｊ．Ｌ１６６］和Ｗａｎｇ．Ｌ．Ｙ掣６刀分别在水相和有机相中合成Ｆｃ３０＃＠Ａｕ纳米磁粒，Ｗａｎｇ．Ｌ．Ｙ等【６８】进一步将所合成的Ｆｅ３０４＠Ａｕ组装在有机薄膜上，制备生 物传感器。Ｄａｎｉｅｌａ Ｃａｒｕｎｔｕ等【６９】在Ｆｅ３０４磁粒表面硅烷化修饰氨基功能基团，在磁 性表面引入正电荷，将２―３ ｎｌｎ的胶体金组装到其表面，获得粒径均一、分散性好 的Ｆｅ２０３＠Ａｕ复合微粒。Ｓａｉｎｉ．Ｇ等【７０】制备出金磁微粒，并将其用于磁共振呈像， 还利用该粒子进行了细胞毒性方面的研究。Ｓｅｂａｓｔｉｅｎ．Ｇ等【７ｌ】利用粒径分布较窄的 ７－Ｆｅ２０３为核心粒子，合成不同厚度的单质金层包覆？－Ｆｅ２０３＠Ａｕ，在其表面偶联白第一￥文献综连蛋白，用于磁靶向治疗，成为磁流体热疗的理想载体。Ｔｅｎ２ＣＨ等［７２１用溶胶凝胶法先在磁性纳米颗粒表面包一个硅层，再用３．巯丙基三甲氧基硅烷化试剂对磁粒表面进行修饰，最后利用Ｓ―Ａｕ间的作用力，将金纳米颗粒结合在磁粒表面。Ｍｏｓｉｅｒ－Ｂｏｓｓ ＰＡ等人ｆ７３Ｉ取氨基修饰的ＢｉｏＭａｇ磁性微粒与金纳米颗粒反应，所得微球粒径为微米级。图１．３是文献报道的两种典型结构盒磁微粒的透射电镜照片：：。贮●●辩≯懿一答－７－ ＪＢａｏ，ｅｌ ａｌ，ＡＣＳＮａｎｏ，１（４）：警Ｄ Ｃｈｅｎ．ｅｔａ１．．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１９：３３９９－３４０文２００７２９３―２９８，２００７圈１－３典型结构金磁微粒的透射电镜照片（ａ：核壳结构，ｂ：组装结构）ＦｉｇＩ－３ＴＥＭｉｍａｇｅｏｆＧｏｌｄＭａｇｐａｎｉｅｌｅｓ（ａ：ｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌ Ｓｃｌ＇ＵＣＵｌｒｅ，ｂ：ａｓｓｅｂＩｅｍｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）胶体金能与含或修饰有巯基、氩基等功能基团的抗体以及寡核苷酸探针等生物分子牢固结合口“，且结合后生物分子的生物学活性不发生改变，因而胶体金在免疫组化，抗原或抗体的快速检测以及核酸杂交检验等方面应用广泛【５３】，利用金 磁微粒的金组分，也可达到同样的效果。４化学发光免疫学分析化学发光免疫分析（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｒａｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＬＩＡ）方法最早于】９７７ 年由Ｈａｌｍａｎ根据放射免疫分析的原理【㈣１建立，结合酶催化化学发光体系与抗原抗体免疫学反应，经过３０多年的发展完善，方法得到了广泛应用。化学发光免疫分析包括免疫反应系统和化学发光分析系统两个部分［７６１。免疫反应系统指包被在 固相载体表面的抗原／抗体与被检样品以及特定物质（化学发光物质、酶等）标记 的抗原或抗体阃所发生的特异性免疫反应，形成免疫学反应复合物的过程。通过 相应标记物或由酶（ＨＲＰ、ＡＰ等，介导底物产生化学发光信号。进行检测。４１化学发光的原理化学发光是化学物质在特定化学反应过程中产生的光辐射。通过高能中问体分解，在化学发光反应中激发单线态分子，分子被激发后很不稳定，需要释放出西北大学硕士学位论文多余的能量从而回到基态，其中一部分能量以发光形式释放出来【７８】，另一部分激 发态分子的能量通过系间串跃和系内串跃而消失，如图１－４所示【７９１。因此，任何 一个化学发光反应都包括激发和发光两个过程。＾Ｃｌ图１＿４化学发光产生的光物理过程示意图Ｆｉｇ．１－４ Ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＣＬ（其中，Ａ，Ｂ分别代表反应物和生成物；Ｂ?是Ｂ的激发态。Ｔ１，Ｔ２为 单重及二重激发三线态，ｓｏ，Ｓ１分别是电子的基态和激发单线态。）４．２化学发光免疫分析化学发光免疫分析法是化学发光法和免疫分析法结合的产物。它同时具有化 学发光高灵敏度和免疫分析高选择性的优点。ＣＬＩＡ是用化学发光剂或催化剂等标 记抗原或抗体，标记后的抗原和抗体与待测样品经过一系列的免疫反应，最后通 过测定发光物质的信号强度来确定待测物的含量。化学发光物质经过催化剂的催 化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当激发态中间体回到稳定的基态 时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器测量光量子产率【Ｊ７７１。 章竹君等在国内最早建立了偶合反应化学发光酶联免疫分析法【８０】，成功的对 乙型肝炎病人表面抗原和抗体、出血热病人的ＩｇＭ、甲胎蛋白、铁蛋白等进行化 学发光免疫测定。他们还将双孵式免疫技术改进成单孵式多层免疫技术，并以ＨＲＰ 标记粪样中的轮状病毒，通过鲁米诺增强化学发光测定了轮状病毒，方法的灵敏度 提高至常规化学发光酶联免疫分析的４倍，特异性、阳性检出率均有很大提高。 Ｂｒｏｗｎ等用苯氧取代的吖啶酯作为发光信号分子，用作葡萄糖氧化酶活性的长寿命发光指示荆８１】，进行促甲状腺激素（ＴＳＨ）化学发光免疫检测，线性范围为０．２―１．６５ｐｍｏｌ／ｊ：［，，最低检测限可达０．１８ｆｉｎｏｌ。第一章文献综述４．３化学发光免疫分析法的主要类型 根据其标记物的不同，化学发光免疫分析法可分为三类【７９】，即标记化学发光 物质的化学发光免疫分析、标记酶的化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。 ４．３．１标记化学发光物质的化学发光免疫分析 标记化学发光免疫分析是用化学发光试剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测 定方法。用于标记的化学发光试剂符合以下条件：（１）与抗原或抗体偶联后能形成 稳定的结合物；（２）偶联后能保持发光试剂高的量子产率： （３）保证被标记物的理化特性，尤其不改变其免疫活性。鲁米诺和吖啶酯类化学发光试剂是最常用的标 记发光试剂。４．３．２化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＬＥＩＡ）属于酶免疫分析，不直接将发光物质标记在抗原或抗体分子上，通过反应后抗原／抗体所标记的酶对发光剂进行催化发光。化学发光酶免疫分析的操作步骤与酶免疫 分析相似：以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用 于发光底物，测定发光强度进行定量分析。目前，常用的标记酶有辣根过氧化物 酶（ＨＲＰ）和碱性磷酸酶（ＡＰ），它们有各自的发光底物。 （１）辣根过氧化物酶催化的化学发光体系 辣根过氧化物酶（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，简称ＨＲＰ，ＥＣ．１．１１．１．７）是一种含亚铁血红素的糖蛋白，可以从植物辣根中提出。具有很好的稳定性，活性高，特异性强，分布较广，易于分离提纯和价格低廉等优点。ＨＲＰ在酶联免疫及化学发 光酶免疫分析中是应用最广的一种酶，它可以与Ｈ２０２催化氧化许多电子给予体的 底物。 ＨＲＰ＋Ｈ２０２＿ＣＰＤＩ＋Ｈ２０２ＣＰＤＩ＋ＡＨ２―啼ＣＰＤＩＩ＋ＡＨ?ＣＰＤＩＩ＋ＡＨ２＿ＨＲＰ＋ＡＨ?＋Ｈ２０ ＨＲＰ在反应中起催化作用，ＣＰＤＩ和ＣＰＤ ＩＩ为化学发光反应中氧化的中间产 物，ＡＨ２是电子给予体，Ａｌｌ?是带有自由基的氧化产物。氧化产物用化学发光进行 检测。 ＨＲＰ常用的发光底物是鲁米诺或其衍生物，其反应机理如图１．５所示【７９】。在１４西北大学硕士学位论文化学发光酶免疫分析中，使用ＨＲＰ标记抗原或抗体，进行免疫反应后，利用鲁米 诺为发光底物，在ＨＲＰ和起动发光试剂（ＮａＯＨ和Ｈ２０２）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中ＨＲＰ的浓度。但此体系（ＨＲＰ．Ｈ２０２．Ｌｕｍｉｎ０１）为瞬时闪光，具有发光强度低、不易测量等缺点［８２１。研究者在发光系统中加入发光 增强剂，如萤火虫荧光素，含有取代基的酚类化合物【８３，８４］， ６．羟基噻唑酚化合物【８５１等，萘酚，取代的溴酸化合物‘８６，８７１，对．碘苯酚【８８１等，乙酰苯胺类化合物【８９】，这 些增强剂的加入极大的增强了发光信号，提高了分析灵敏度和准确性，并可在较 长时间内保持稳定，便于测量。瞄篡争瞳燃，．髓ｑ孵一啸ｈ＇ｌｆｈ Ｏ≥．（２）碱性磷酸酶催化的化学发光体系碱性磷酸酶（ＡＰ）具有活性高，分子量小，稳定性好，易分离提纯等优点，己 被用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。它可与１，２．二氧环乙烷构成发光体系，是目前最灵敏的一类化学发光体系。Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等提出ＡＬＰ．ＡＭＰＰＤ发光体系∞】是具 有代表性化学发光酶免疫分析体系。ＡＭＰＰＤ（３．（２．螺旋金刚烷）．４．甲氧基．４．（３．磷 氧酰）一苯基．１，２．二氧环乙烷）作为一种超灵敏的ＡＬＰ底物，性质十分稳定，热分 解活化能Ｅａ＝１３６ ｋＪ／ｍｏｌ，固态的ＡＭＰＰＤ在５。Ｃ下保存几乎不分解【９１１。在溶液中 ＡＭＰＰＤ的磷酸酯键很稳定，非特异性酶催化的水解非常慢，在ｐＨ＝１２，０．０５ ｍｏｌ／Ｌ碳酸钠缓冲溶液中，失活半衰期可达７４年，并且几乎没有试剂本身的发光背景１９１］，属于ＡＰ催化体系理想的化学发光底物。第一章文献综述４．３．３电化学发光免疫分析 电化学发光（ＥＣＬ）是指由电化学反应引起的化学发光过程。当在电极上加载 一定的电流或电压时，会发生电化学反应，在电极与反应产物之间、电极反应产 物与溶液中某种组分之间发生化学反应而产生激发态中间分子，当激发态返回到 基态时释放光子，产生发光现象。 电化学发光的现象很早就被发现［９２＇９３１，直至２０世纪８０年代初出现运用电化 学发光进行检测分析的文献报道Ｍ】，９０年代开始将电化学发光用于试剂的临床检 测中。整体上讲，电化学发光免疫分析是电化学、免疫测定和化学发光的结合， 它包括了电化学、免疫反应和化学发光三个过程，故是化学发光免疫分析的一种 发展。实际应用中的电化学发光体系主要是钌联吡啶［Ｒｕ（ｂｐｙ）３】２＋体系。 电化学发光免疫分析具有标记物稳定，灵敏度高，可实现多元检测、均相免 疫分析以及全自动化的优点。正是因为电化学发光免疫分析具有的优越性，成为 了一种很有发展前途的免疫分析法，日益受到人们的重视。目前已用于抗原、半 抗原及抗体的免疫学测定研究中。 ４．４化学发光免疫分析商业化简况 ＣＬＩＡ分析方法多样，适用面广，广泛地用于抗原、抗体和半抗原的免疫测定， 具有特异性强、灵敏度高等优点。其线性范围较宽，更好地符合临床检验的需要。 ＣＬＩＡ技术为临床诊断和科学研究提供了一种超微量的非同位素免疫检测手段，在 食品分析、环境等方面也具有广阔的应用前景。国外知名公司已经将相关技术方 法实验商业化，国内近年来研究增多，但大都处于研究阶段，具有自主知识产权的产品极少。各种操作简便、测量准确的化学发光分析仪的问世，也使得化学发光分析法 逐渐普及应用，国外高灵敏度的化学发光检测试剂盒及配套化学发光分析仪，已 在我国的大医院开始应用。如美国贝克曼库尔特公司的ＡＣＣＥＳＳ全自动微粒子化 学发光免疫分析系统，采用ＡＭＰＰＤ．ＡＬＰ微粒子化学发光系统进行样品检测，极 大缩短了分析时间，提高了灵敏度、准确性和精密度［１０１－１０３１Ｉ。美国雅培公司 ＡｘＳⅥⅥ全自动免疫发光分析仪可用于非均相标记微粒子酶免疫发光分析 （ＭＥ认）、均相标记荧光偏振免疫发光分析（ＦＰＩＡ）和离子捕捉发光分析（ＩＣ认）， 已有多个检测项目可供临床应用【１０４】。美国ＰＩＥＲＣＥ公司的开发的Ｌｕｎｉｍｏｌ增强技 术，使其产品ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ系列灵敏度高、信号持久，并且保存方便。Ａｍｅｒｓｈａｍ公１６西北大学硕士学位论文司开发的Ａｍｅｒｌｉｔｅ化学发光分析系列产品采用Ｌｕｍｉｎ０１．Ｈ２０２．ＨＲＰ．ＰＩＰ系统，可对甲状腺功能检测和性激素等小分子进行检测。美国拜耳公司的ＡＣＳ：８０系列全自 动化学发光免疫分析系统采用吖啶酯化学发光系统，测量ＡＥ标记物化学反应所产生的相对光子数，灵敏度可达１ ０―１５ ｐｇ／ｍＬｔｌ０５】。 我国也在自行研制化学发光分析仪及相关配套试剂，如中国科学院生物物理 所研制开发了微弱发光测定仪‘ＢＰＣＬ（．１．ＫＧＣ），已被应用于进行一些化学发光 酶免疫测定，但性能上与国外产品有一定差距，王永宁等【１嗍利用ＢＰＣＬ（．１．ＫＧＣ） 微弱发光仪已对血清中促甲状腺激素（ＴＳＨ）进行了检测。福州大学化学系研制的 ＦＧ８３．１型化学发光仪也已经被应用于样品中癌胚抗原（ＣＥＡ）的化学发光免疫分 析检测。５．立题依据和主要工作近年来，随着生物医学检验技术的进展，输血及血液制品安全性有了很大的 改善，但仍然存在较大的安全隐患，引致输血传播性疾病中，ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＴＰ、ＨＩＶ等是对输血安全性构成严重威胁的主要病原体，经血源性传播的疾病风险度依然很高。流行病学调查结果还表明，２００７年公布的甲、乙类法定报告传染病中， 梅毒发病人数已从２００５年的第５位跃居第３位目前。目前临床检测和血站筛查梅 毒的方法主要是酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ），但因受传统免疫学诊断方法的灵敏度 的限制，依然不能完全杜绝阳性血样的漏检，常需做进一步的分析，才可对其进 行正确的检测及评估。 磁分离酶联免疫法是一种以磁性复合微粒为载体免疫检测技术，该技术具有 高灵敏度、高特异性、检测快速及无放射性污染等优点，可及时准确地提供实时 的检测结果。化学发光免疫分析法具有极高的灵敏度和较宽的线性范围，将其与 磁分离酶联免疫系统结合，将会显示其各方面的优势。该领域国外知名公司已开发出相关试剂盒产品，国内大多处于研究阶段，具有自主知识产权的产品甚少。 本研究以课题组自主研制的金磁微粒为载体，运用磁酶免系统并结合化学发 光检测技术，建立比传统ＥＬＩＳＡ灵敏度高、操作简便的磁酶免化学发光法检测，检测反应原理如图１．５所示：１７第一章文献综述◆＋丫＋＾＆＂离酶联免痤应Ｍ―－１１：０二――●化学发光杖抟测化学发光榆测圈１＊磁酶免化学发光法检测ＴＰ抗体原理Ｆｉｇ １｛Ｓｃｈｅｍｅｆｏｒ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ主要内容包括以Ｆ方面：ＩＴＰ抗原免疫碰珠的制各。确定抗原包被及封闭最优条件。２免疫学检测体系的优化。确定最佳抗原包被条件与酶标抗原稀释倍数，确定免疫反应的最佳时间与稀释体系。对比磁分离载体与传统酶标板载体对酶联免 疫反应的影响，为后续化学发光检测做好基础。３将ｌｕｍｉｎｏｌ－Ｈ２０２－ＰＩＰ体系与ＴＰ抗体的免疫学反应偶联，对化学发光试剂浓 度、缓冲体系等各反应条件进行优化，确定化学发光最适反应条件。 ４确定方法的线性、灵敏度、重复性等，对建立的方法进行初步评价。西北大学碗＝Ｉ：学位论文第二章：梅毒螺旋体抗原免疫磁珠的制备与传统酶标板相比，磁性微粒悬浮在液体中，具有更高的比表面积，能 够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，因而具有灵敏度高、 检测速度快、重复性好等优点。组装型金磁微粒（Ｆｅ３０ｄＡｕ微粒）是一种新 型磁性复合微粒，由修饰有功能基团的微米级磁性氧化物颗粒和大量的纳米 级金粒子组装而成ｍ】。不需共价偶联试剂，生物分子通过与磁粒表面静电作 用、疏水相互作用、氨基酸残基侧链巯基与金的相互作用等，可一步偶联在 磁粒表面。本研究对组装型金磁微粒偶联ＴＰ抗原的条件（包括固定化及封 闭条件）进行优化。固定化过程示意图如图２ １所示：幽２ １金磁微粒包被ＴＰ抗原及封闭示意图ＴＰ抗原在金磁微粒表面的固定化效率可以２８０ ｎｍ蛋自特征紫外吸收测定，但制备得到的免疫磁珠表面ＴＰ抗原的活性，尚需通过酶免显色反应与 化学发光测定对其进行评价。选取常规ＴＭＢ显色法和鲁米诺化学发光常用 条件对抗原活性进行了初步评价。原理如图２ ２所示：弋＋孓酶标仪检洲 化学发光仪枷测恻２．２酶联免缝反应，以酲ｆ标仪与化学发光检测仪检删偶联ＴＰ抗原的活性示意图第二章梅毒螺旋体抗原免疫磁珠的制各１材料与方法１．１试剂和样品 金磁微粒（浓度５ ｍｇ／ｍＬ，平均粒径５ ｇｍ）陕西北美基因股份有限公司 产品；基因重组ＴＰ４７、ＴＰ４４．５、ＴＰｌ７和ＴＰｌ５抗原及辣根过氧化物酶（ＨＩ冲） 标记抗原（Ｈｌ冲．ＴＰ４７、ＨＲＰ．ＴＰ４４．５、ＨＲＰ．ＴＰｌ ７和ＨＲＰ．ＴＰｌ５）由厦门大学 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心惠赠；阳性血清病人样品，第四军医大学西京医院输血科提供；阴性血清，陕西省医院输血检验科提供； 梅毒螺旋体抗体检测试剂盒，北京万泰生物药业有限公司产品：脱脂奶粉，完达山牌；ＮａＯＨ、ＨＣｌ、Ｈ２Ｓ０４、三羟甲基氨基甲烷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾等均为西安化学试剂厂产品（分析纯）；所用水为Ｍａｘｉｍａ超纯水器制备。 试剂配制： １）１０×磷酸盐缓冲液（１０ｘＰＢＳ）： 准确称取ＮａＣｌ，８０．０ｇ；ＫＣｌ，２．０ ｇ；Ｎａ２ＨＰ０４，１４．４ｇ（或Ｎａ２ＨＰ０４‘｜２Ｈ２０，３６．３ ｇ）；ＫＨ２Ｐ０４，２．４ｇ；溶解至８００ ｍＬ超纯水中调节ｐＨ至７．４，定容至１，０００ ｍＬ，灭菌，室温或４。Ｃ存放备用。使用前用超纯水１０倍稀 释。 ２）１０×偶联缓冲液： 准确称取Ｔｒｉｓ粉，２．４２８ｇ；ＮａＣｌ，２．９２５ｇ：溶解至８００ ｍＬ超纯水中调节ｐＨ至７．４，定容至１，０００ ｍＬ，灭菌备用。使用前用超纯水１０倍稀释。 ３）ＰＢＳＴ． 移液器移取２５０ ｇＬ的Ｔｗｅｅｎ．２０加入５００ ｍＬ的１×ＰＢＳ缓冲液中，颠 倒混匀，室温或４。Ｃ存放备用。 ４）血清稀释液、ＨＲＰ标记抗体稀释液：ＰＢＳＴ，４．０ｍＬ：新生牛血清，１．０ ｍＬ。５）显色液Ａ： 配制０．１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝５．０柠檬酸．柠檬酸钠缓冲液：Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸缓 冲液８２ ｍＬ与Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠缓冲液１１８ ｍＬ混合，溶液配好后加 入菲那西汀煮沸使其溶解（使菲那西汀终浓度为０．００８％），加入过氧化脲（使过氧化脲终浓度为Ｏ．０５％），充分混匀，棕色瓶４＂Ｃ保存。西北大学硕士学位论文６）显色液Ｂ： 准确称取ＥＤＴＡ?２Ｎａ，Ｏ．１４６ ｇ；柠檬酸，１．０５ ｇ；ＴＭＢ?ＨＣｌ，０．４ ｇ；溶 解至８００ ｍＬ超纯水中，调节ｐＨ至７．４，定容至１０００ ｍＬ；棕色瓶４＂Ｃ 保存。 ７）终止液（２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｓ０４）： １１超纯水８９ ｍＬ，将浓Ｈ２Ｓ０４ 颠倒加入顺序。 ８）鲁米诺储备液：ｍＬ缓慢加入其中，注意防止喷溅，禁止准确称取鲁米诺０．８８５８ ｇ，溶解于８０ ｍＬ的Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液中， 定容至１００ ｍＬ，得到Ｏ．０５ ｍｏｌ／Ｌ的储备液，铝箔包裹，避光４＂Ｃ保存。 ９）对碘苯酚储备液： 准确称取对碘苯酚０．１１ ｇ，溶解于二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）ｑｂ，定容至１０ ｍＬ， 配制成０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的储备液，４。Ｃ保存。１．２仪器 磁性分离器：陕西北美基因股份有限公司产品； 恒温培养振荡器：ＺＨＷＹ－２１０２Ｃ型，上海智城分析仪器制造有限公司； 紫外．可见分光光度计：８４５３型，美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司： 生化培养箱：ＨＰＳ．２８０型，哈尔滨市东明医疗仪器厂； 酶标仪：ＥＬｘ８００ｕｖ型，美国Ｂｉｏ．Ｔｅｋ公司； 化学发光检测仪：Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ．９６０型，德国Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司。１．３方法 １．３．１金磁微粒表面抗原的固定化 取０．２ ｍＬ金磁微粒，磁性分离，弃上清，用Ｏ．４ ｍＬ的偶联缓冲液（Ｏ．０２ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）清洗２次平衡磁粒的ｐＨ。磁粒中加入２００ ｌａＬ抗原溶液（根据 实验需要选择适当浓度的抗原），置于摇床反应（１８０ ｒｐｍ，３７℃，３０ ｍｉｎ）。包 被有抗原的磁粒用０．４ ｍＬ的偶联缓冲液清洗两次。加入１ ｍＬ封闭液（５％脱 脂奶粉／ＰＢＳ＋２％小牛血清），放入恒温培养振荡器反应（１８０ ｒ／ｍｉｎ，３７℃．２ ｈ）２１第二章梅毒螺旋体抗原免疫磁珠的制各以封闭磁粒。磁性分离弃上清，用ＰＢＳＴ清洗３次；最后，将磁粒保存在ｌ ｍＬ ＰＢＳ中，颠倒混匀，４。Ｃ保存备用。１．３．２验证ＴＰ抗原偶联效果 １．３．２．１偶联效率的测定 通过紫外．可见分光光度计测定ＴＰ抗原在包被前、后溶液的ＯＤ２８０，根据以下公式计算ＴＰ抗原在金磁微粒表面的固定化效率，其中ＯＤ２８０（昨）为包 被前抗原溶液在２８０ ｎｌＴｌ处的光吸收值，ＯＤ２８０ｔｐｏｓｔ）为包被反应后上清液在２８０ｎｍ处的光吸收值。包被率＝―业皆×１０。包被量＝包被抗原加入量×包被率 １．３．２．２包被抗原活性的测定 参照文献常用的免疫学反应条件，通过酶联免疫反应对偶联于磁粒表面 的ＴＰ抗原的生物活性进行进一步检测。取３０“Ｌ包被有ＴＰ抗原的磁粒于各反应管中，在相应管内加入阳、阴性对照血清各５０儿，并加入按照一定比例稀释的ＨＲＰ标记抗原（金磁微粒加入相应体积ＰＢＳ缓冲液的管设为空白）， ３７０Ｃ温浴反应３０ ｍｉｎ，ＰＢＳＴ清洗六次。根据需要选择如下两种方法进行进 行检测： ＴＭＢ常规显色法：加入显色液Ａ和显色液Ｂ各１００ ｇＬ，显色５ ｍｉｎ后 加入２００ ｐＬ终止液（２ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４），磁性分离后移取２００ ｐ．Ｌ上清液用酶标仪测定４５０／６３０ ｎｍ下各管吸光度值。化学发光法检测：加入ｌｕｍｉｎｏｌ、Ｈ２０２、ＰＩＰ各２０ ｐＬ，放入化学发光检 测仪中检测，记录最大峰值。１．３．３ＴＰ抗原偶联条件的优化 １．３．３．１包被时间的选择 为确定最佳包被时间，金磁微粒中加入ＴＰ抗原后，３７０Ｃ震荡反应，分别在１ｍｉｎ、５ ｍｉｎ、１０ ｍｉｎ、１５ ｍｉｎ、２０ ｍｉｎ、６０ｍｉｎ时取出磁粒，磁性分离，通过方法ｌ－３．２．１上清以紫外．可见分光光度计测定样品ＯＤ２８０并计算偶联效西北大学硕士学位论文率。１．３．３．２抗原包被量的初步选择分别取相当于２．５ ｐｇ、５肛ｇ、７．５“ｇ、１０昭、１２．５“ｇ、１５ ｐｇ的抗原固定 于１ ｍｇ金磁微粒表面并将磁粒分别悬浮在１ ｍｌ ＰＢＳ缓冲液中。按照方法 １．３．２．２进行ＴＭＢ常规显色法与化学发光检测。 １．３．３．３金磁微粒应用量的选择 分别取相当于１０ ｒｔｇ／孑Ｌ、３０．ｇ／孑Ｌ、５０．ｇ／孔、１００ Ｊ＿ｔｇ／孑Ｌ的金磁微粒， 包被量２８０ ｎｇ／孑：Ｌ，按照方法１．３．２．２进行化学发光检测。１．３．４封闭条件的选择１．３．４．１封闭反应条件的优化 取３管ｌｍｇ已偶联有ＴＰ抗原的金磁微粒，各加入ｌ ｍＬ的５％奶粉＋２ ％小牛血清，分别按下列３种条件进行封闭处理：４０Ｃ过夜；３７０Ｃ震荡２ ｈ， ４０Ｃ过夜；３７０Ｃ震荡过夜。封闭后按照方法１．３．２．２进行酶联免疫检测。 １．３．４．２封闭剂的选择．取３管ｌｍｇ已偶联有ＴＰ抗原的金磁微粒，分别加入１ ｍＬ的１％明胶、０．５％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、１‘Ｏ％小牛血清、５％奶粉、１０％奶粉、５％奶粉 ＋２％小牛血清，３７０Ｃ震荡２ ｈ，４０ｃ过夜。封闭完后按照方法１．３．２．２进行酶 联免疫检测。２．结果与讨论２．１ＴＰ抗原在金磁微粒表面的固定化 蛋白分子通过与磁粒表面静电作用、疏水相互作用、半胱氨酸残基侧链的巯基与金的作用等，可一步偶联在金磁微粒表面。对包被前ＴＰ抗原溶液 及包被反应后剩余溶液的紫外吸收进行检测，结果如图２．３所示：第二章梅毒螺旋体抗原免疫磁珠的制备图２．３ ＴＰ抗原包被前后的紫外吸收曲线包被前ＴＰ抗原溶液在２８０ ｎｌｌｌ处具有明显的特征吸收，包被反应后剩余 溶液在２８０ ｎｌｌｌ处几乎没有特征吸收，说明ＴＰ抗原几乎全部包被在了金磁微 粒表面。２．２免疫磁珠包被时间的优化 以方法１．３．３．１方法进行包被时间的优化，结果如图２．４所示。金磁微粒 结合ＴＰ抗原反应迅速，２０ ｍｉｎ左右即可完成偶联反应，为保证反应完全，尽可能提高ＴＰ抗体利用率，实验过程中选取包被时间３０ ｍｉｎ为最佳包被时间。１．４１．２３１．０ 《∞ ｏ口∞岳ｏ．８ｏ乏ｏ．６０．４０２０加６０Ｔｉｍｅ（ｒａｉｎ） 图２４ ＴＰ包被时间梯度对包被量的影响西北大学硕士学位论文２．３金磁微粒使用量的选择 组装型金磁微粒平均粒径５ ｐｍ，微粒本身不透光，当悬浮在液体中时呈现深棕色，对光线具有一定的遮蔽，因此选择合适的磁粒用量尤为重要。以 １．３．３．３方法进行金磁微粒使用量选择，结果如图２．５所示：藕 书 栗 霞 罂每孔磁粒的量（ｐｇ） 图２．５每孔磁粒量梯度化学发光信号各反应中金磁微粒使用量不同，但磁粒表面ＴＰ抗原的包被量相同，均为２８０ ｎｅｄ孑Ｌ。由检测结果可知，磁粒为１０¨ｇ时化学发光检ＮＩＳＥＩ性信号偏低，这可能由于磁粒量过少导致的清洗损失所致。磁粒为５０ ｐ∥孔、１００ ｏｇ／孔悬 浮在反应皿中时，随着磁粒量增加，清洗时少量的磁粒损失对体系整体影响 降低，但是由于磁粒浓度增大带来的光线遮蔽现象逐渐明显，总体作用同样导致化学发光检测阳性信号降低。磁粒为３０ ｒｔｇ／孑Ｌ时，磁粒增加导致的信号增强与磁粒过多导致的信号降低达到平衡，，化学发光强度值达到最大，本实 验选择３０¨∥孔进行后续研究。２．４抗原包被量的初步选择 按照１．３．３．２所述步骤，选择３０ｒｔｅｄ孑Ｌ金磁微粒作为载体，通过对阴性和阳性血清的测定确定包被抗原的最佳使用量，结果见图２．６：第二章梅毒螺旋体抗原免疫磁珠的制各籁 ‰ 米 靛 罂抗原包被量（ｇｔｇ／ｍｇ）图２＿６仲抗原包被量梯度每毫克金磁微粒表面包被量小于５ ｐｇ时，阳性血清信号强度较低。随着 Ｔｐ抗原包被量的增加，抗原．抗体．酶标抗原复合物形成增多，阳性发光强度值相应增加。当包被量在５嵋与７．５ ｐｇ之间时，化学发光强度呈最大值，之后阳性发光强度呈下降趋势。当Ｔｐ抗原包被量大于１２．５¨ｇ时，阳性发光强 度陡降，这可能是由于抗原在磁粒表面分布越来越密集，空间位阻逐渐增大，甚至形成包被抗原．抗体．包被抗原复合体，因而导致发光强度降低。因此选择每毫克磁粒包被ＴＰ抗原５ ｐｇ，进行后续研究。 ２．５封闭条件的选择封闭（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）是金磁微粒包被抗原后，用高浓度无关蛋白质结合磁粒表面未剩余的活性位点，以防止后续抗原抗体的非特异性结合。每毫克金磁微粒对蛋白的最大偶联量可达到３００峙，而ＴＰ包被抗原最佳使用浓度较低，必须对金磁微粒表面的空白位点进行封闭。 （１）封闭反应条件的优化： 常用封闭条件为４０Ｃ过夜，但实验中发现４０Ｃ过夜并不适用于金磁微粒 的封闭，达不到理想的封闭效果，阴性值较高，如表２．１所示。这是因为磁 性微粒４０Ｃ过夜时基本完全沉降在管底，不能充分反应导致。增加３７０Ｃ震 荡２ ｈ，明显加强了封闭效果，阴性值较低。所以本实验之后选择３７０Ｃ震荡２ｈ加４０Ｃ过夜，进行后续研究。按照１．３．４．１所述步骤，通过对阴性和阳性西北大学硕士学位论文血清的测定确定封闭的最佳条件结果见表２．１：表２．１封闭反应条件不同时的检测结果阳性 ４０Ｃ过夜３７０Ｃ １．９０６ １．７４５ １．８８４ ０．０８０阴性０．０７３ ０．０１９阳性／阴性２４．７７７２．６５２ｈ＋４０Ｃ过夜１．８１５０．０３０（２）封闭试剂配方的选择： 最常用的封闭液是０．０５％一０．５％的牛血清白蛋白（ＢＳＡ），也有用１０％ｄ、牛 血清、１％明胶作或５％奶粉为封闭液的，按照１．３．４．２所述步骤，通过对阴性和阳性血清的测定确定最佳封闭剂，结果见表２．２：表２－２封闭剂不同时的检测结果 阳性 １％明胶 １０％小牛血清０．５％ＢＳＡ １．７６５阴性阳性／阴性１．７２３２．１６０．４９６０．４３５０．３１３ ０．１４２３．７５７．８８ １４．１８２．２９９２．２２７０．２５３０．１７８５％奶粉 ｌＯ％奶粉 ５％奶＋２％小牛血清２．３０９１．７４５１．８１５Ｏ．０３０．０１９７２．６５如表所示，１％明胶作为封闭剂时，由于明胶与磁粒有发生了很强的吸附作用，溶液粘稠，无法磁性分离，不能进行后续试验。单纯用１０％ｄ、牛血清 和０．５％的（ＢＳＡ）为封闭剂不能完全封闭磁性微粒的位点，阴性值很高。５％脱脂奶粉可以很好的封闭金磁微粒中的活性位点，但阴性值仍然偏高，但继续增加脱脂奶粉浓度至１０％时，奶粉已经很难溶化，封闭液十分粘稠，无法 进行后续实验。另一方面，小牛血清中由于含有与人血清相似的蛋白成分， 可以补充脱脂奶粉的不足，进一步对金磁微粒表面的活性位点进行封闭。所 以结合脱脂奶粉与小牛血清，封闭液中含有５％脱脂奶粉与２％小牛血清，３７０Ｃ震荡２ ｈ加４０Ｃ过夜，得到满意的封闭效果。３．本章小结金磁微粒作为固相载体，偶联ＴＰ抗原（ＴＰ４７、ＴＰ４４．５、ＴＰｌ７和ＴＰｌ５），２７第二章梅毒螺旋体抗原免疫磁珠的制各具有如下优点：（１）金磁微粒在外加磁场的作用下可方便地分离，不需要离心过滤等方法，清洗操作简单。 （２）组装型金磁微粒表面结合有大量的胶体金颗粒，不需共价偶联试剂， 只需要３０ ｍｉｎ，ＴＰ抗原即可一步偶联在金颗粒表面。 。（３）ＴＰ抗原通过与金颗粒表面静电作用、疏水相互作用、残基侧链的 巯基与金的作用物理性结合，避免了共价结合导致生物分子活性的降低。结果表明，选择磁粒３０ ｐ∥孔，每毫克磁粒包被量５ ｐｇ，３７。Ｃ震荡３０ ｍｉｎ 进行ＴＰ抗原免疫磁珠的包被。以５％脱脂奶粉与２％小牛血清封闭剂，３７０Ｃ 震荡２ ｈ加４。Ｃ过夜进行封闭，制各出供磁酶免化学发光检测ＴＰ抗体的的 ＴＰ抗原免疫磁珠。目＃大学《Ｌ学位论文第三章磁酶免反应条件的优化样品血清中的ＴＰ抗体可通过双抗原夹心法检测，原理如图３―１所示。经 过反应与清洗，通过酶联免疫法显色检测得到结果。将阳性血清与阴性血清 分别加入偶联有ＴＰ抗原的余磁微粒中后，加入酶标抗体。阳性血清中含有 梅毒抗体，可形成抗原一抗体．酶标抗原复合物。经过清洗去掉体系中游离的 其他物质，加入底物显色，在酶标仪中检测ＯＤ一５们阴性血清中因为不台有 梅毒抗体，不能形成抗原一抗体一酶标抗原复合物，因而ＯＤ４５０很低。对于免疫 学反应的影响因素很多，包括反应时间、包被抗原与标记抗原的浓度、ＨＲＰ．标记抗原稀释液等。◆丫卜吖‰。塞。吸光壁与样品浓度成正比蚓３－ｌ双抗原夹心测梅毒抗体示意图１材料与方法ｌｌ试剂和样品 金磁微粒（浓度５ ｍｇ／ｍＬ，平均粒径５ ｒａｍ）陕西北美基因股份有限公司产品：基因重组ＴＰ４７、ＴＰ４４ ５、ＴＰｌ７和ＴＰ］５抗原及辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的抗原（ＨＲＰ．ＴＰ４７、ＨＲＰ－ＴＰ４４ ５、ＨＲＰ．ＴＰｌ７和ＨＲＰ．ＴＰｌ５）厦门大学 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心惠赠；阳性血清样品，第四军 医大学西京医院输血科提供：阴性血清，陕西省医院输血科提供：梅毒螺旋 体抗体检测试剂盒，北京万泰生物药业有限公司产品。ＮａＯＨ、ＨＣＩ、Ｈ２Ｓ０４、磷酸氢二钠、磷酸二氧钠、氯化钠、氯化钾等均 为西安化学试女Ｕ厂产品（分析纯）；所用水为Ｍａｘｉｍａ超纯水器制备。 所用试剂的配制：）１０×磷酸盐缓冲液（１０×ＰＢＳ）：准确称取ＮａＣ］，８００ ｇ：ＫＣＩ，２．０ ｇ：Ｎａ２ＨＰ０４，１４ ４１９ｇ（或Ｎａ２ＨＰ０４１２Ｈ２０第三章磁酶免反应条件的优化３６．３ ｇ）；ＫＨ２Ｐ０４，２．４ｇ：溶解至８００ ｍＬ超纯水中调节ｐＨ至７．４，定容至１，０００ ｍＬ，灭菌，室温或４。Ｃ存放备用。使用前用超纯水１０倍稀 释。２）１０×偶联缓冲液：准确称取Ｔｒｉｓ粉，２．４２８ｇ；ＮａＣｌ，２．９２５ｇ；溶解至８００ ｍＬ超纯水中调节ｐＨ至７．４，定容至ｌ，０００ ｍＬ，灭菌备用。使用前用超纯水１０倍稀释。 ３）ＰＢＳＴ： 移液器移取２５０ ｇＬ的Ｔｗｅｅｎ．２０加入５００ ｍＬ的ｌ×ＰＢＳ缓冲液中，颠 倒混匀，室温或４℃存放备用。 ４）血清稀释液、ＨＲＰ标记抗体稀释液：ＰＢＳＴ，４．０ｍＬ：新生牛血清，１．０ｍＬ。５）显色液Ａ：配制Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝５．０柠檬酸．柠檬酸钠缓冲液：Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸缓 冲液８２ ｍＬ与０．１ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠缓冲液１１８ ｍＬ混合，溶液配好后加 入菲那西汀煮沸使其溶解（使菲那西汀终浓度为０．００８％），加入过氧化 脲（使过氧化脲终浓度为Ｏ．０５％），充分混匀，棕色瓶４。Ｃ保存。 ６１显色液Ｂ： 准确称取ＥＤＴＡ－２Ｎａ，Ｏ．１４６ ｇ；柠檬酸，１．０５ ｇ；ＴＭＢ－ＨＣｌ，０．４ ｇ；溶 解至８００ ｍＬ超纯水中，调节ｐＨ至７．４，定容至１０００ ｍＬ；棕色瓶４。Ｃ 保存。 ７）终止液（２ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｓ０４）： 超纯水８９ ｍＬ，将浓Ｈ２Ｓ０４ 颠倒加入顺序。１ｌｍＬ缓慢加入其中，注意防止喷溅，禁止１．２仪器 磁性分离器：陕西北美基因股份有限公司产品； 恒温培养振荡器：ＺＨＷＹ－２１０２Ｃ型，上海智城分析仪器制造有限公司；生化培养箱：ＨＰＳ．２８０型，哈尔滨市东明医疗仪器厂；酶标仪：ＥＬｘ８００ｕｖ型，美国Ｂｉｏ．Ｔｅｋ公司；西北大学硕士学位论文１．３方法１．３．１ＨＰＲ标记抗原稀释液的选择 ＨＰＲ标记抗原分别以ＰＢＳ、ＰＢＳＴ、ＰＢＳＴ＋５％小牛血清、ＰＢＳＴ＋ｌＯ％小牛血清、ＰＢＳＴ＋２０％小牛血清、ＰＢＳＴ＋３０％小牛血清稀释到１：３０００。取３０“Ｌ 包被有ＴＰ抗原的磁粒于各反应管中，在相应管内加入阴性对照血清、酶标 抗原各５０ ｐＬ，３７０Ｃ温浴震荡３０ ｍｉｎ，ＰＢＳＴ清洗六遍。加入显色液Ａ和显 色液Ｂ各１００ Ｉ．ｔＬ，显色５ ｍｉｎ后加入２００ ｐＬ终止液，磁性分离后移取２００ 上清液用酶标仪测定４５０／６３０ ｒｌｌｎ下各管吸光度值。 １．３．２免疫反应时间的优化 取３０ ｐＬ包被有ＴＰ抗原的磁粒于各反应管中，在相应管内分别加入阳 性血清、阴性血清各５０肛Ｌ，再加入１：３０００的酶标抗原５０¨Ｌ，分别考察反 应时间为１０ ｍｉｎ、１５ ｍｉｎ、２５ ｒａｉｎ、３０ｒａｉｎ、４０ ｍｉｎ、５０ ｍｉｎ后，阳性及阴性 的信号值，确定温浴的最佳反应时间。 １．３．３包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的优化 为确定包被抗原的最佳使用量及酶标抗原的最佳工作浓度，分别取２．５ｐｇ，５“ｇ，７．５“舀１０ ｐｇ，１２．５ Ｉ．ｔＬｐｇ和１５肛ｇ的抗原偶联于１ ｍｇ金磁微粒表面并将磁粒分别悬浮在１ ｍｌ ＰＢＳ缓冲液中。取３０嵋磁性微粒于各反应管中，加入 阳、阴性血清，再加入不同稀释度（１：２０００，１：３０００，１：４０００，１：５０００，１：６０００） 的ＨＲＰ标记抗原，３７０Ｃ 色液Ａ、Ｂ各１００１８０ｒｐｍ震荡反应３０ ｍｉｎ。ＰＢＳＴ清洗六次。加入显 Ｈ２Ｓ０４终止液２００ １．ｔＬ终止反应，用酶标仪测Ｉ．ｔＬ，２ ｍｏｌ／Ｌ定４５０／６３０ ｎ／ｉｉ下各孔吸光度值。１．３．４磁酶免法、ＥＬＩＳＡ商品化试剂盒灵敏度比较将同一份阳性血清以阴性血清倍比稀释为，１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、 ｌ：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００、１：６４００、ｌ：１２８００，分别用两种方法检测：（１）万泰ＴＰ抗体ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，按照说明书操作；（２）磁酶免ＥＬＩＳＡ法，按照第三章优化方法，通过显色液Ａ、Ｂ显色，检测。第三章磁酶免反应条件的优化２结果与讨论２．１ＨＲＰ标记抗原稀释液的选择 包被有ＴＰ抗原的金磁微粒中加入阴性血清与ＨＲＰ酶标抗原进行反应时，ＨＲＰ酶标抗原会非特异性吸附在磁粒及包被抗原表面，经过ＰＢＳＴ六次 清洗仍然很难去除干净。如有残留，非特异性吸附的ＨＲＰ酶标抗原会参加后 续反应，造成阴性值偏高。在反应体系中加入表面活性剂可降低非特异性吸附，另外高浓度的无关蛋白可以竞争非特异结合位点，亦可降低ＨＲＰ酶标抗原非特异性吸附。本实验结合表面活性剂Ｔｗｅｅｎ．２０与小牛血清作为酶标抗原 稀释液，得到了良好的阴性信号，结果见图３．２。编号ｌ２３４５６ＰＢＳＴＰＢＳＴＰＢＳＴＰＢＳＴ稀释液ＰＢＳＰＢＳＴ§％小牛血清 阴性０．２３０－Ｉ－０．０３０ ０．２１３ｉ－０．０５０ ０．１ ３７ｉ－０．０４３１０％ｄ＇牛血清Ｏ．１１５ｉ－０．０５５２０％小牛血清Ｏ．０１ ５：Ｌ－０．０３０３０％ｄ＇牛血清Ｏ．０１２±０．０４０捌 型 呆 蓥酶标抗体稀释液 图３．２不同酶标抗体稀释液对阴性值的影响由图３．２可以看出，加入０．０５％Ｔｗｅｅｎ．２０可以部分降低阴性信号。另外 加入小牛血清竞争非特异吸附位点，随着小牛血清加入量的增加，阴性信号 逐渐下降，当到达２０％时基本进入平台期。本实验选择ＰＢＳＴ＋２０％小牛血清 作为ＨＲＰ标记抗原稀释液进行后续研究。３２西北大学硕士学位论文２．２最佳反应时间的选择包被抗原、待检抗体、酶标抗原的结合是一个动态平衡反应，分别考察反应时间为１０、１５、２５、３０、４０、５０ ｍｉｎ时的检测结果，见图３―３１．８ １．６ １．４ １．２趔１．０ 刨 柴ｏ．８軎５ 。０．６ ０．４ ０．２ ０．０１０ １５ ２０ ２５ ３０ ３５ ４０ ４５ ５０ ５５照 照时间（ｒａｉｎ） 图３－３吸光度值随温育时间的变化由图３．３可以看出，应用金磁微粒作为免疫学检测载体时，在所观测的ｌＯ．５０ｒａｉｎ内，阴性对照ＯＤ值随温育时间的延长略有升高，但变化不明显；阳性对照ＯＤ值随温育时间的延长而变化明显。当温育时间１０～３０ ｍｉｎ之间 时，阳性对照的ＯＤ值逐渐升高；在大于３０ ｍｉｎ之后，阳性对照的ＯＤ值变 化不大，说明３０ ｍｉｎ时，抗原抗体反应已达平衡。因此，选择３０ ｍｉｎ作为抗原抗体反应的最佳时间。２．３包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的选择 按照１．３．３所述步骤，通过对阴性和阳性血清的测定确定包被抗原的最佳 使用量及酶标抗原的最佳工作浓度，结果见表３．１。 按照常规的ＥＬＩＳＡ法，将阴性对照平均值的２．１倍设为系统Ｃｕｔｏｆｆ值， 如果实验测得的阴性对照值小于Ｏ．０５，以Ｏ．０５计：若其所测得的值大于Ｏ．０５， 则以其实际值计。依此确定系统的Ｃｕｔｏｆｒ值为０．１０５。由表２．１可以看出，当捕ＴＰ抗原包被量分别为５ ｐｇ／ｍｇ，酶标抗原为１：３０００稀释时，实验测得的阳性对照ＯＤ值为１左右，阴性对照ＯＤ值均在Ｏ．０５以下（小于０．０５，以０．０５第三章磁酶免反应条件的优化计）。因此，本实验选择ＴＰ抗原包被量为５ ｇｇ／ｍｇ，酶标抗原为ｌ：３０００稀释 为最佳工作条件。表３－１固定抗原量和ＨＲＰ．标记抗原工作浓度的方阵试验（Ｐ：阳性血清：Ｎ：阴性血清）Ｐ Ｎ Ｐ Ｎ Ｐ０．７８５ ０．０２４ ０．８５５ Ｏ．０１８１．２８７ ０．００９ １．１５７ Ｏ．０１３ １．０２０ Ｏ．０１７ ０．８６３ ０．０１８１．２４０ ０．０２０ １．２８３１．６８０ Ｏ．０２３ １．２７２ Ｏ．０ｌＯ １．０７０ Ｏ．０００ ０．９７０ ０．００１ ０．７９８ ０．０２１１．５６４ Ｏ．０１１ １．４９３ Ｏ．０２３１．６７００．０１０ １．２８３ Ｏ．ｏｏＯ １．０７８ ０．０ｌｌ ０．８３６Ｏ．∞Ｏ１．０２６ Ｏ．０１５ ０．８８８ ０．００２ ０．６９９ Ｏ．００２０．６５３０．００５ ０．６６４ Ｏ．０１５ ０．５１ｌ Ｏ．０１０１．２８４０．０２８ ０．９４６ ０．００５ ０．６８０ Ｏ．００７ＮＰ ｌ：５０００ Ｎ Ｐ Ｎ０．０３００．６２６ Ｏ．０１７０．７３３Ｏ．０１３２．４金磁微粒为载体的酶联免疫反应效果的评价按照方法１．３．４将同一阳性血清（取于西京医院输血检验科，并已确定为 ＴＰ阳性样品）做倍比稀释，进行检测，并与万泰ＥＬＩＳＡ法检测试剂盒结果 对比，如表３．２所示，商品化试剂盒（ＥＬＩＳＡ法）对阳性血清的检测可达１：５０ 倍稀释。以金磁微粒为固相载体进行酶免检测，并加入常规显色液进行测定， 灵敏度可提高２倍。表３－２金磁微粒检测系统与试剂盒灵敏度比较检测结果 阳性血清 稀释倍数 商品化试剂盒（ＥＬＩＳＡ）１：１ １：２５ １ｌ＋磁酶免法（ＭＡＩＡ）＋＋＋５０＋＋１：１００ １：２００ １：４００ ｌ：８００．＋．?｝．西北大学硕士学位论文商品化试剂盒（ＥＬＩＳＡ法）采用的是聚乙烯酶标板作为固相载体，酶免 反应只能在酶标板表面的进行。用金磁微粒作为固相载体进行常规ＥＬＩＳＡ检测，金磁微粒悬浮在液体中，由于比表面积增加，可提高灵敏度，但灵敏度提高幅度尚未达到理想状态，所以在后续研究中进一步引入化学发光法检测 可更好地提高检测灵敏度。３．本章小结利用ＴＰ抗原免疫磁珠进行ＥＬＩＳＡ酶联免疫反应，具有操作简便，灵敏度高、无放射性污染等优点，在本部分中优化酶免反应条件，为后续的化学 发光检测做好基础。并对比酶标板与金磁微粒作为固相载体对酶免反应的影 响。 优化免疫学结果表明：选择ＨＲＰ标记抗原稀释液为ＰＢＳＴ＋２０％ｄ＂牛血清，每毫克磁粒ＴＰ抗原包被量５ ｌａｇ，ＨＲＰ标记抗体的稀释度为１：３０００，温育时间为３０ ｍｉｎ为最佳条件。在该条件下ＴＰ抗原免疫磁珠、血样中ＴＰ抗 体与酶标抗原反应达到最优条件。 经过与商品化试剂盒（ＥＬＩＳＡ法）的对比，实验证明，引入金磁微粒过 作为固相载体进行酶免检测，可以提高灵敏度，但由于仍是使用常规方法显 色（ＴＭＢ显色系统），灵敏度提高不够，所以在后续研究中进一步引入化学 发光法检测可更好地提高检测灵敏度。第四章化学发光条件的优化第四章：化学发光条件的优化目前ＣＬＩＡ最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）和碱性磷酸酶（ＡＰ）【９７１。ＨＲＰ常用的底物为鲁米诺（Ｌｕｍｉｎ０１），或其衍生物如异鲁米诺。传统Ｈ１冲发光体系通常为几秒内瞬时闪光、发光强度低、不易测量【嗍。为此，常向其 中加入一些化学发光增强剂，可显著地增强酶催化的化学发光强度，并延长发光持续时间。常见的发光增强剂有对碘苯酚、对苯基酚、对溴酚、对羟基联苯、对羟基苯丙烯酸等苯酚衍生物。 本部分采用了Ｌｕｍｉｎ０１．Ｈ２０２．ＨＲＰ发光体系，以对碘苯酚（ＰＩＰ）作为化 学发光反应的增强剂，对影响化学发光的各个条件进行优化。ｌｕｍｉｎｏｌ在ＨＲＰ 酶的催化作用和氧化剂的存在下，形成激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时便发射出光子，通过化学发光检测仪测量光信号强度。 在一定浓度范围内，发光强度与酶的含量成正比，从而确定待测物质的含量。原理如图４．１所示。障当肆氧化枘―＿＿―＿―――一Ｉ●，＋Ｎ２ｏＨ‘图４。１ Ｌｕｍｉｎｏｌ参与化学发光的原理ｌ材料与方法１．１试剂和样品 ＴＰ抗原免疫磁珠，保存于ＰＢＳ中；鲁米诺（Ｌｕｍｉｎ０１），购于Ｓｉｇｍａ公司； 对碘苯酚（ＰＩＰ），购于Ｓｉｇｍａ公司；过氧化氢３０％，三羟甲基氨基甲烷、 Ｔｗｅｅｎ一２０、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、浓硫酸 等均为西安化学试剂厂分析纯；所用水均为Ｍａｘｉｍａ超纯水器制各。西北大学硕士学位论文实验所需试剂的配制： １）鲁米诺储备液： 准确称取鲁米诺Ｏ．８８５８ ｇ，溶解于Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ ８０ ｍＬ中，定容至１ ００ｍＬ，配制成Ｏ．０５ ｍｏｌ／Ｌ的储备液，铝箔包裹，避光４＂Ｃ保存。 ２）对碘苯酚储备液： 准确称取对碘苯酚０．１１ ｇ，溶解于二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）ｑｂ，定容至１０ ｍＬ， 配制成０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的储备液，４℃保存。其它所用试剂的配制见第二章与第三章１．１。１．２仪器 化学发光检测仪：Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ一９６０型，德国Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司。 １．３方法１．３．１化学发光反应缓冲体系的优化 ＴＰ免疫磁珠３０肛ｇ按照第三章优选的免疫学反应条件，在在磁粒表面完成夹心复合物的形成过程，加入１０ｇＬＰＢＳ，进而用于优选化学发光检测体系。加入化学发光专用９６孔板相应的孔中。将发光剂与增强剂：Ｌｕｍｉｎｏｌ、 Ｈ２０２、Ｐ口分别配制在四种缓冲液Ｔｒｉｓ―ＨＣＩ（０．０２ｍｏｌ ｐＨ７．４）、ｌ×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１×ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）、ＣＢＳ（Ｏ．１ｔｏｏｌ ｐＨ ９．５）中，分别取２０ ｇＬ加入９６孔板相应孔中，立即将９６孔板放入化学发光检测仪中动态监测，记录各孔在３０ 中的发光曲线。 １．３．２化学发光缓冲体系Ｔｗｅｅｎ．２０浓度的优化ｍｉｎ取经过酶免疫反应完成的免疫磁珠１０ ｐＬ，加入化学发光专用９６孔板中 相应的孔中。分别取Ｔｗｅｅｎ．２０梯度（Ｏ％，０．０５％，Ｏ．１０％，０．１５％，０．２０％， Ｏ．３０％）的ＰＢＳＴ缓冲体系，配制发光剂和增强剂，各取２０¨Ｌ加入９６孔板 相应孔中，立即将９６孔板放入化学发光检测仪中检测３０ ｍｉｎ，记录各孔在３０ｍｉｎ中的发光曲线。１．３．３化学发光反应体系ｐＨ值的优化 取经过酶免疫反应完成的免疫磁珠ｌＯ ｐＬ，加入化学发光专用９６孔板中