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【求助】真菌基因敲除方法
本人预备在真菌中敲除一个基因,目前已知它的DNA序列.由于本人刚刚起步,所以对于它的具体敲除办法有些地方还是不太明白,例如:它的靶载体构建好后,我要如何将它与野生型真菌进行基因交换?只要提取出野生型真菌的原生质体就可以了吗?我需要哪些菌种及材料才能使该基因被置换下来?看了一些这方面的文章,但大部分都是细菌和动物的,对于真菌的具体操作办法了解太少,请各位高手帮忙,不胜感激!我没有做过真菌的试验，但做过细菌的基因敲除试验，因此道理都是差不多的。首先，你必须确定你的knock-out策略，是单交换，还是双交换的重组。现在比较流行使用单交换策略。理论上来说，单交换重组效率要比双交换的重组效率要高得多。而且，单交换经常用于构建无标记的缺失菌株。因为，双交换你必须要通过筛选标记来筛选，不可避免的带入各种筛选标记进入野生菌的基因组 。对于功能基因组的研究不可避免的带来影响。确定策略之后，开始构建重组中间转移质粒，也就是通常所说的打靶载体。打靶载体根据你重组策略的选择为依据。选择不同的筛选标记也非常重要，因为这有利于你快速筛选你的目标菌株。其实材料很简单：打靶载体，野生菌的基因组（真菌可能是原生质体），用于筛选用的培养基，电穿孔转化设备。丝状真菌是一类非常重要的微生物，在工业和农业生产上具有十分重要的作用，然而目前这方面的报道还比较少，目前真菌的转化方法主要包括以下方法：1）原生质体-PEG（Protoplasts/PEG）2）氯化锂（Lithium Acetate）3）电击转化（Electroporation）4）基因枪转化（Biolistics）5）农杆菌介导转化（Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation）6）限制性内切酶介导转化（Restriction enzyme mediated integration）目前真菌转化中常用的是原生质体法和农杆菌介导转化，其中又以农杆菌介导转化效率更高，尤其是对一些难以制备原生质体的真菌。国内真菌遗传转化方面的文章较少，但还是有几篇的，不过具体方法介绍的比较简单。建议还是看外文的参考文献，据我所知核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）这两种真菌的遗传转化方面的研究是有文献可查的。谢谢楼上两位的回答,另外To meilingra:你提到"单交换经常用于构建无标记的缺失菌株",我想问一个比较菜的问题,什么叫"无标记的缺失菌株"?不是野生型菌株吗?此外,在基因敲除的靶载体上不就带有标记基因吗,在交换过程中该标记基因不就是取代了目的基因进入了野生型的基因组中吗?这样对功能研究没有影响吗?谢谢谢谢楼上两位的回答,另外To meilingra:你提到"单交换经常用于构建无标记的缺失菌株",我想问一个比较菜的问题,什么叫"无标记的缺失菌株"?不是野生型菌株吗?此外,在基因敲除的靶载体上不就带有标记基因吗,在交换过程中该标记基因不就是取代了目的基因进入了野生型的基因组中吗?这样对功能研究没有影响吗?谢谢你去查查关键词the rice blast fungus或者Magnaporthe grisea，它是侵染水稻的一种丝状真菌，这个菌做 knockout好多年了，从开始的原生质体转化到现在的ATMT都有用来做敲除的例子。留个EMAIL我寄几篇文章给你无标记的缺失菌株是 选择标记在某种外界条件下又被踢出基因组的重组菌株目前敲除用的较多的方法主要是: PCR的方法和同源重组的方法,用的载体主要是:插入型的和替换型的.偶也作过细菌的敲除,不过偶作的方法很简单,感觉细菌的敲除比其它的容易一些.
真菌的敲除跟动物\植物真核的敲除方法差不多,跟植物的操作基本一致,主要是用敲除的自杀质粒.给你推荐本书---军事医学科学院的杨晓主编的---名字好象是&基因敲除方法&optron wrote:你去查查关键词the rice blast fungus或者Magnaporthe grisea，它是侵染水稻的一种丝状真菌，这个菌做 knockout好多年了，从开始的原生质体转化到现在的ATMT都有用来做敲除的例子。留个EMAIL我寄几篇文章给你optron有好文章请传给偶一份 先谢谢了谢谢大家的帮助,另外也谢谢optron的热心,我的邮箱是zhoufengyan1988 wrote:谢谢楼上两位的回答,另外To meilingra:你提到"单交换经常用于构建无标记的缺失菌株",我想问一个比较菜的问题,什么叫"无标记的缺失菌株"?不是野生型菌株吗?此外,在基因敲除的靶载体上不就带有标记基因吗,在交换过程中该标记基因不就是取代了目的基因进入了野生型的基因组中吗?这样对功能研究没有影响吗?谢谢不好意思， 前段时间太忙了。knock-out 如果用带有筛选标记的方法去获取突变株，从筛选的效率上来讲要高的多了。你以markless作为关键词在NCBI中搜索，可以发现很多的信息。希望对你有些帮助。这篇是我当时毕业论文时翻译的一篇国外的综述，希望对你有用。
负向选择标记：细菌遗传学和病原学研究中的新工具.doc (107.5k)本来想找原文给你的，电脑不在身边，改天给你。你还可以以试试以这些关键词搜索：Markerless ， unmarker， counterselection好的,谢谢,我会认真看的文章我已发到comeonflareup 和了，载体构建大致原理是：在选择性标记hph序列（抗潮霉素的）的上游和下游分别连接上要敲除的基因的上游和下游片段，片段长度1-2kb，然后用peg或者atmt等方法转化。
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微生物遗传变异与育种
第六章 微生物遗传变异与育种第一节 工业微生物菌种的筛选开发微生物资源的关键是获得所需要的菌种，优良的微生物菌种是工业微生物技术 的关键和基础。理想的工业发酵菌种必须具有下述特性： (1)纯种培养物； （2）遗传性状稳定； （3）生长速度快； （4）能利用廉价、来源广、成 分简单的培养基； （5）能忍耐不良环境因素如温度、pH、离子强度、剪切力等； （6）快速生 产目的产物，不产或少产毒性物质或副产物。一、微生物菌种获得的途径 （一）微生物的自然分布要获得理想的目的菌的最基本问题是自然界或人工环境有没有目的菌存在的可能 性。自然界中蕴藏着大量的微生物，这些微生物在生物生态上起着重要的作用，土壤、 空气、水、动植物体以及各种极端环境都有微生物的踪迹，有机物的分解、氮的固定过 程都离不开它们。一般微生物的种类和数量要受到所处环境中有机物、氧、温度、水分、 pH 值、光线等各种因素的影响。据报道：1g 土壤约栖息 1 亿个细菌，1000 万个放线菌， 100 万个真菌，55 万个藻类，目前全世界能分离培养的微生物还不到其总数的 1%。土壤 中的大量微生物已成为分离各种抗生素、生理活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来源。 &放线菌 （10 个/g） &霉菌 （10 土壤中的微生物分布的数量： 按种类递减， 细菌 （10 个/g） 个/g）&酵母菌（10 个/g）&藻类（10 个/g）&原生动物（10 个/g） 。5 4 3 8 7 6（二）微生物菌种获得的途径但自然环境下的微生物是混杂生长的，要获得理想的菌株，必须要有快速、准确、 高通量的菌种分离和筛选方法。在实际研究工作中，我们可通过以下途径进行收集和筛 选工作： （1）工业微生物的直接来源 有生命的动植物，废水等。 （2）向菌种保藏机构索取有关的菌株 国内外有名的菌种保藏机构有：中国微生物保 藏管理委员会 （CCCCM） 美国典型菌种保藏中心 ， （ATCC） 英国国家典型菌种保藏所 ， （NCTC） ， 日本大阪发酵研究所（IFO）等。 典型的微生物菌种分离筛选过程可分为采样、增殖培养、分离纯化、性能测定等。见 图 6-1。 包括土壤，水，新鲜的、发酵的和腐烂的水果和食物，图 6-1 菌种分离筛选流程二、工业微生物的筛选 (一) 微生物样品采集采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素， 确定具体的时间、环境和目标物。 1．土壤采样 自然界中土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸含微生物样品极其丰富，但总体来 讲土壤样品的含菌量最多，土壤具备了微生物所需要的营养、空气、水，是我们采集样 品的首选目标。每克土壤的含菌量大体有如下递减规律：细菌&放线菌&霉菌&酵母&藻类& 原生动物。微生物由于生理特性不同，季节、表面的植被、温湿、通风情况、养分、水 分、pH 值酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布： （1）土壤有机质含量和通气状况 有机质丰富的土壤如耕土、菜园土、近郊土壤， 通气保水性能好，适合细菌、放线菌生长繁殖；森林土植被多，枯叶多，有机质丰富，但阴暗潮湿，适合霉菌、酵母生长繁殖；沙土、无植被的山坡土等有机质含量少的，微 生物含量少。 （2） 土层的纵剖面：采土样最好的土层是 5―25cm。 1－5cm 的表层土由于阳光照射， 蒸发量大，紫外杀菌，微生物数量少；25cm 以下的土层因土质紧密，空气、营养、水分 缺乏，含菌量逐步减少。 （3）土壤 pH 值：偏碱的土壤（pH7.0-7.5）环境适合于细菌、放线菌生长；偏酸的 土壤（pH7.0 以下）环境适合于霉菌、酵母菌生长。 （4）表面的植被：植物根部的分泌物有所不同也对微生物分布有一定影响。葡萄或 其他果树的根部附近土壤中酵母菌多；豆科植物根部的根瘤菌数量占优。 (5)地理条件：热带和亚热带的南方土壤比北方土壤的微生物的数量和种类多，原因 是南方温度高，气候温暖潮湿，植物多和植被覆盖面大，土壤有机质丰富。 （6）季节条件：秋季采土样最为理想，经过夏季到秋季，温度高，植被丰富，土壤水 分和通气合适，微生物数量最多。而冬季温度低，气候干燥，微生物生长慢而少；春季 气温升高，微生物生长旺盛，但雨水多，土壤含水量高，通气不良； 土壤采样方法：采土样地点选好后，用小铲子去除 5cm 表土，取离地面 5?15cm 处的土 样 10－25 克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查 考。 2．根据微生物生理特点采样 微生物的营养需求和代谢类型与其生长的环境有很大相关性。微生物在特定的环境下 生息繁衍， 它必然具有与之相适应的代谢类型并产生相应的代谢产物适应这种环境。 研究表 明，如淀粉酶、糖化酶生产菌容易在面粉厂、食品厂、酒厂这类场所分离到；蛋白酶、脂肪 酶生产菌容易在肉类加工厂、 饭店的污水和污泥中分离到； 纤维素酶生产菌容易在森林中腐 烂的草木下的土壤或直接从腐烂的草木中分离； 油田附近的土壤容易分离出利用碳氢化合物 的微生物。 筛选一些具有特殊性质的微生物时，需要根据该微生物独特的生理特性到特殊的环境 条将下采样。在极端环境如高温、低温、高酸、高碱、高辐射等环境中存在少数极端微生物， 这也是目前微生物研究的热点之一。如耐高温菌通常在温度较高的南方，或温泉、火山爆发 区以及北方的堆肥中采样；嗜低温菌种可到南北极、冰窖、深海等寒冷的地方采样。 海洋对于微生物是个特殊的局部环境，其独特的高盐度、高压力、低温及光照条件， 使海洋微生物具备特殊的生理活性， 产生了不同于陆地来源的特殊代谢物。 海洋采样可参照 其中不同微生物的分布：表层为好气异养菌，底层有机质丰富，硫化氢含量高，厌气性腐败菌和硫酸还原菌较多，两层中则为紫硫菌。海洋微生物还可从海洋生物体如海绵、海鞘、海 参及深海鱼肠道体内分离。（二）富集培养一般在采集的样品中待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，我们根 据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的菌在最适环境 中生长繁殖， 使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌， 便于将它们从样品中分离。 这种方法称为增殖培养或富集培养。 与直接分离相比较， 直接分离避免了不同微生物之间的 竞争作用， 而富集培养是基于不同微生物之间在液体培养基中的自由竞争， 在人为选定的培 养条件下， 适合生长的微生物会在数量上超过其他微生物而最终占优势。 富集培养主要根据 微生物的碳源、氮源、pH、温度、需氧等生理因素来控制。 1．控制培养基的营养成分 营养成分主要指碳源、氮源、无机盐类、生长因子等。微生物的代谢类型丰富，其分布 随环境条件不同而不同， 所需的营养成分也不一样。 对于大多数微生物的富集培养可用下面 的基础培养基如表 6-1， 对于碳源、 氮源、 能量物质的需求依所要富集的微生物不同而不同。 表 6-1 基础培养基成分 成分 K2HPO4 MgSO4?7H2O FeSO4?7H2O 用量 1g 0.2g 0.05g 成分 CaCl2 微量元素溶液 蒸馏水 用量 0.02g 0.1ml 1L控制增殖培养基中营养成分，特别适合分离产水解酶类（纤维素酶、淀粉酶等）的产 生菌，可在富集培养基中以相应底物作为唯一碳源，加入含菌样品，并给目的微生物以最佳 的培养条件培养， 能分解利用该底物的菌类得以繁殖， 而其他微生物则因得不到碳源而无法 生长。 但是许多的碳源、氮源可被多种微生物利用，不适于用作控制条件。常规实验研究中， 各大类微生物已确定基本的营养成分，如细菌用蛋白胨、牛肉膏，放线菌用淀粉，酵母、霉 菌用麦芽汁或米曲汁等。 2．控制培养条件 通过微生物对 pH、温度及通气等条件的特殊要求来控制培养，达到富集目的微生物 菌种。 （1）pH 值 不同微生物生长繁殖的最适 pH 值不同，培养基配制时要考虑微生物生长代谢产物如有机酸和培养基成分利用后造成的 pH 变化,控制培养基的 pH 值一般通过添加磷酸盐缓冲液体系、碳酸钙以及必要时补加酸、碱的方式来调节。 （2）培养温度和热处理 不同种类的微生物所适宜的生长温度是不同的，利用不同培养温 度可使不同的嗜温性微生物生长速度不同。 筛选耐高温菌株， 有利于发酵工业节约冷却用水， 采用 50～60℃温度培养，就可使嗜冷、嗜温微生物大量淘汰。细菌芽孢是特别耐热的，可 以抵抗 100℃或更高的温度，要分离内生孢子生成型细菌，可将采集样品进行短时间的巴氏 杀菌消除不产孢子细菌的竞争，浓缩产芽孢菌种。 （3）通风 一般所筛选的微生物通常是好气菌，但有时也分离厌氧菌，严格的厌氧菌不仅可省略通气和搅拌，节省能耗。这时除配制特殊的培养基外，还需要厌氧培养箱、厌氧罐等 特殊设备创造有利于厌氧菌的生长环境。 3．添加抑制剂 添加专一性抑制剂也可达到抑制不需增殖的微生物的目的。如土样悬浮液中加数滴 10％酚可抑制霉菌和细菌的生长，而放线菌仍生长；又如添加青霉素、链霉素之类抗生素能 抑制细菌的生长。不同抗生素能抑制的菌类的范围不同，所用浓度等也不同，应区别分离对 象、药物性质及适当的添加量。经常用于选择培养添加药物如表 6-2。 选择培养基使用的药物及其浓度（ 表示） 表 6-2 选择培养基使用的药物及其浓度（括号内数字与药物的浓度一般以 mg/ml 表示） 被分离的微生物 添加物质及其浓度 放线菌酮（50） ，制霉菌素（50） ，环己亚氨（50） ， 匹马霉素（50） ，丙酸钠（4mg） 放线菌 环己亚氨+多黏菌素+枯草菌素（各 20 单位） ，多黏菌 素 B（5）+青霉素（1） 放线酮 （50-500） 制霉菌素 ， （100） 曲古霉菌素 ， （500） ， 细菌 优洛杀菌素（30-100） （eu-rocidin） 原虫霉素（5） 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 多黏菌素 B（5） 青霉素（1） ，月桂酸钠（2mg） 氯霉素（100） ，青霉素（20）+链霉素（40） ，玫瑰红 细菌 酵母菌 （50）+放线菌酮（10） 放线菌酮 氯霉素（100） ，青霉素（20）+链霉素（40） ，玫瑰红 霉菌菌 （35-67） 氯霉素（50）+放线菌酮（10） ，青霉素（100） 细菌、酵母菌 霉菌 细菌 原生动物 革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌 霉菌、酵母菌 被抑制的微生物 霉菌(三)分离纯化虽然增殖培养过程中设置了许多限制因素，目的微生物得到增殖占了优势，其他种类 的微生物在数量上相对减少， 但富集后的培养液中仍是一个各类微生物的混合体。 为了获得 某一特定的微生物菌种， 必须进行微生物的分离纯化， 把最需要的菌株直接从样品中分离出 来。 1、好氧微生物的分离纯化 （1）常规的分离方法 常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为二个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，其方法有划线分离法、稀释涂布法。其具体方法 已在其它相关章节作了详细说明，划线分离法简单，较快；而稀释涂布法获得单菌落均匀， 获得纯种的几率大，特别适合分离具有蔓延性的微生物如根霉、毛霉等霉菌，这类微生物在 分离时极易生长成片，很难挑单菌落，实验中可在培养基中加入去氧胆酸盐或山梨糖。 另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法，可达到“菌株纯”的水平。最简便的方 法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离； 或利用复杂的显微操作装置进行单细胞 挑取。 （2）平皿反应快速检出法 提高分离筛选工作的效率，除控制增殖培养条件外，并选用特 异的检出方法和筛选方案， 可显著提高菌株分离纯化的效率。 目前在分离筛选研究工作中常 采用平皿反应快速检出法， 根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来 设计特殊的分离培养基，通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应如透明圈、 变色圈、抑菌圈等进行分离。表 6-3 列出了微生物代谢产物的平板检测方法。 透明圈法： 透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生 物便会在菌落周围产生透明圈， 圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。 该法在分离水解 酶(如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶等产生菌时采用较多。如在分离淀粉酶产生菌时， 培养基以淀粉为唯一碳源， 待样品涂布到平板上， 经过培养形成单个菌落后， 再用碘液浸涂， 根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株（见图 6-2） 。 变色圈法： 对于一些不易产生透明圈产物的产生菌， 可在底物平板中加入指示剂或显色 变色圈法： 剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。产生有机酸或者胺的微生物，通常采用 pH 值指示剂 可检测出来， 如将溴麝香草酚蓝的中性红色溶液加入到琼脂营养培养基中， 通过菌落周围代 表产酸反应或产碱反应的指示剂颜色变化，可决定是否产生该物质。 在分离谷氨酸产生菌 时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在 pH6.2～7.6，当 pH 在 6.2 以下时为黄色，pH 7.6 以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色， 可从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。表 6-3 微生物特异性平板检测方法 有机酸 柠檬酸 pH 值指示剂的颜色变化，或掺入 琼脂平板的碳酸钙的溶解 胞外酶 1． 淀粉酶 由碘指示的可溶性淀粉的液化 2． 蛋白酶 酪蛋白的溶解 3． 脂肪酶 乳化的三丁酸甘油酯的液化， 消 除或向橄榄油琼脂中添加 0.05%-0.25% 的 OsO4 溶液或中性红溶液 4． 果胶酶 果胶凝胶的液化 （1.5%的聚果胶 酸钠） ，多糖沉淀剂 5． 弹性蛋白酶 弹性蛋白的溶解 6． 核酸酶（DNA，RNA） 未水解的核酸的沉 淀，酸过量时可见浑浊，或者氮蒽橙荧 光和紫外荧光 生长圈法： 生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。其中工具菌 是一些相对应的营养缺陷型菌株。 将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平 板上进行培养， 若某菌株能合成平板所需的营养物， 在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊 的生长圈。 如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板， 在其上涂布含菌样品 保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。 7． 磷酸酯酶 C 卵磷脂平板的浑浊圈 8． 磷酸酯酶 A 卵磷脂平板的透明圈 9． 纤维素酶 纤维素平板的透明圈 10．酯酶 氯化钙和 Tween20 释放出的月桂 酸反应生成月桂酸钙沉淀， 或者 7-羟-4 甲基香豆素荧光反应 11．DNA 酶 亚甲胺蓝的 DNA 荧光反应 12．过氧化物酶 喷洒对茴香碱-过氧化氢 酶抑制剂 （用含酶的琼脂平板上的抑 制圈筛选） 胰蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂图 6-2 淀粉透明圈图 6-3 抑菌圈抑菌圈法： 抑菌圈法是常用的抗生素产生菌的初筛方珐， 其检测菌采用抗生素的敏感菌。 抑菌圈法： 若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质， 如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生 长的抑菌圈， 测量抑菌圈大小， 根据有效指标(抑菌圈直径与菌落直径之比)选出高产菌株 （见 图 6-3） 。采用该方法已得到许多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。该种方法中检测 菌的选择十分重要，它直接关系到检出的灵敏度和筛选到的抗生素活性及抗菌谱。 2、厌氧微生物的分离纯化 要分离厌氧性微生物， 如生产丙酮丁醇的梭状芽孢杆菌， 白酒生产上增香用的丁酸菌、 已酸菌及用于环境污水处理和水产养殖用的光合菌、反硝化菌、脱氮排硫杆菌等。它们生长 于水底层及沉积物中，要从样品中分离这类菌，需采取厌气培养法。因为专性厌氧菌与分子 氧接触很快会被杀死， 所以要求微生物与空气的接触降至最少或完全隔绝。 许多专性厌氧菌 最初仅能生长在低氧化还原电位(约 150 毫伏或更低)的培养基中， 因此可以将培养基 “预还 原” ，即在培养基中加入半胱氨酸、巯基化物、硫化钠或抗坏血酸等还原剂，然后将此类培 若分离时菌株可短暂接触空气， 就可用划线法。 养基隔绝空气贮藏(如贮器内充入 CO2 或 N2)。 划线后放到一密封的贮器中抽真空或充 N2 加以培养。也可用化学法吸收 O2，例如利用焦性 没食子酸与 NaOH 反应将氧除去。 每吸收 100 毫升空气中的氧， 需用焦性没食子酸 l 克及 10％ NaOH 溶液 10 毫升。目前较先进的厌氧培养的方法采用在厌氧培养箱或厌氧袋进行培养，已 有较完善的商品化系列。（四）菌种筛选、性能评价及菌种的初步鉴定 菌种筛选、1．菌种筛选、菌种性能评价 菌种筛选、 菌种筛选 在目的菌株分离的基础上，初筛就是进一步筛选目的产物生产能力高的菌株。菌株的 分离和初筛往往是结合在一起进行的， 分离时所采用的选择培养基和特异性平板检测方法等 本身就包含了筛选的内容。虽然平板法是常用的初筛方法，但由于是固体培养，与液体培养 条件差距较大， 需进一步采用摇瓶培养法来筛选。 由于摇瓶培养法更接近于发酵罐培养的条 件，效果一致。初筛由于菌株量相对还较大，故一般一个菌株接一个瓶，在摇床上及合适的 温度条件下振荡培养，并对产物进行活性测定。 初筛的淘汰率在 85%～90%，剩下的较好菌株要进行摇瓶复筛，复筛是进一步挑出那些 确实有工业应用价值的微生物， 排除那些不具潜力的微生物。 菌种性能测定包括菌株的毒性 试验和生产性能测定。 此时一个菌株通常要重复 3～5 个瓶， 筛选时的培养条件确定是关键， 如培养基、温度、pH、供氧等，应该根据菌株性能、产物代谢途径、类似产品的培养条件以 及前人的经验等进行综合考察，防止漏筛。培养后的发酵液采用精确的分析方法测定，选出 较优良的菌株 2～3 株。一般筛选过程，即初筛，复筛、再次复筛，重复至获得可靠的少数几株后进行较全面的考察。 这种直接从自然界样品中分离出来具有一定生产性能的菌株称为野生型菌株。 这种野生 型菌种往往低产甚至不产所需的产物， 只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生 产。所以，我们常将这野生型菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。 2．微生物的初步鉴定 确定菌种的类别．尽可能的将其分类到种或属是很有价值的．因为这样我们就可以将 新分离得到的菌种与那些文献上已记载的能产生发酵产品的菌种作一比较， 对菌种的分类也 可使我们对该菌种对植物、 动物或人是否有致病性做一预测， 这一点在微生物的操作中是必 须考虑的。 另外． 还可以在某种程度上推测一下在研究这些微生物时要考虑的生长特性和其 他要求。 微生物的分类通常是一个耗时、 费力的过程， 所以， 除非其具有确切的的工业前景， 否则我们并不希望进行详细分类， 只分至大类就可以了。 但是如果要注册专利时就应将其鉴 定至种， 对于一个新的微生物的应用获得专利是大有益处的， 这可以在微生物工艺前加上一 个“新颖”或“新”的字样。第二节 微生物遗传学一、遗传变异的物质基础遗传的物质基础是蛋白质还是核酸，曾是生物学中激烈争论的重大问题之一。利用微生 物作为生物对象设计的 3 个著名实验，以确凿的事实证明了 DNA 和 RNA 为遗传变异物质 基础。（一）经典转化实验――DNA 作为遗传物质 经典转化实验――DNA ――格里菲斯（1928 年）以肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）作研究对象，是一种 球形细菌，常成双或成链排列，菌体外有多糖的荚膜包围，其菌落表面光滑（smoth） ，故称 S 型，可使人患肺炎；另一为不形成荚膜、菌落外观粗糙（rough） ，称为 R 型，它在动物 体内易被吞噬细胞吞噬，对动物不具毒力，是非致病菌株。格里菲斯发现将 R 型肺炎双球 菌菌株与经加热杀死的 S 型菌株混合后，注射小鼠，能毒死小鼠，并从死鼠血中可以分离 到 S 型菌株。这现象被认为是 S 型菌株和 R 型菌株发生了转化(Transformation) 转化(Transformation) 转化(Transformation)。见图 6 －4。 O.T.Avery 等(1944 年)为了弄清楚 Griffith 实验中的转化因子的实质， 从加热杀死的肺炎 链球菌中提纯了几种有可能作为转化因子的成分， 并深入到离体条件下进行转化实验。 从活 的 S 菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等）,并对各种生化组分进行转化试 验。如图 6－5。图 6－4 肺炎链球菌转化实验图 6－5 肺炎链球菌体外转化实验 上述结果表明，只有 S 型菌株的 DNA 能将 R 型菌株转化为 S 型。分别用蛋白酶和核 酸酶处理转化因子，进一步证实转化现象与蛋白质、荚膜多糖和 RNA 无关，只与 DNA 有 关，而且 DNA 纯度越高，转化效率也越高。这就说明，S 型转移给 R 型的决不是遗传性 状（在这里是荚膜多糖）的本身，而是以 DNA 为物质基础的遗传信息，UDP－葡萄糖脱 氧酶基因使 UDP－葡萄糖转变为多糖荚膜前体 UDP－葡萄糖醛酸。（二）噬菌体感染实验――DNA 是遗传物质 噬菌体感染实验――DNA ――A.D.Hershey 和 M .Chase（1952 年）用同位素对大肠杆菌噬菌体 T2 的感染过程进行了 示踪研究。因为蛋白质含有硫元素（S） ，不含磷元素（P） ，而 DNA 含有磷元素（P） ，不含硫元素（S） 。故用同位素 32P 和 35S 分别标记 T2 噬菌体的 DNA 与蛋白质。然后用标记的 T2 噬菌体(32P 或 35S)分别感染大肠杆菌，经 10 分钟后，用搅拌器甩掉附着于细胞外面的噬 菌体外壳。 发现在第一种情况下， 基本上全部放射活性见于细菌内而不被甩掉并可传递给子 代。在第二种情况下，放射性活性大部分见于被甩掉的外壳中，细菌内只有较低的放射性活 性，且不能传递给子代(图 6－6)。图 6－6 T2 噬菌体感染实验（引自 Russell, 2000） 这说明在噬菌体感染过程中，蛋白质外壳未进入宿主细胞，进入宿主细胞是 DNA，并 增殖、装配成完整的子代噬菌体粒。这就有力地证明，在其 DNA 中，存在着包括合成蛋白 质外壳在内的整套遗传信息。（三）植物病毒的重建实验――RNA 是遗传物质 植物病毒的重建实验――RNA ――H .Fraenkel-Conrat（1956 年）用含 RNA 的烟草花叶病毒（TMV）作的著名的植物病 毒重建实验证明烟草花叶病毒（TMV）的主要感染成分是其核酸（RNA） 。烟草花叶病毒经 弱碱、尿素、去垢剂等处理，能将它的蛋白质外壳与 RNA 核心相分离，二者重新混合后， 病毒粒子又会重建。 在实验中， 还选用了另一株与 TMV 近缘的霍氏车前花叶病毒 （HRV） 。 实验过程和结果可见图 6－7。 当用由 TMV - RNA 与 HRV - 衣壳重建后的杂合病毒去感染 烟草时，烟叶上出现的是典型的 TMV 病斑。分离出来的新病毒也是典型 TMV 病毒。这 就证明核酸 RNA 也是遗传物质。而 HR RNA 与 TMV 蛋白重建的杂种病毒，经 TMV 抗体 处理，杂种病毒颗粒被钝化失活，进一步证明主要感染成分是 RNA，病毒外壳蛋白起保护 作用。 这 3 个具有历史意义的经典实验，得到了一个确信无疑的共同结论：只有核酸才是负 载遗传信息的真正物质基础。图 6－7 病毒重建实验示意图(引自 Klug and Cummings，2000)二、微生物的染色体分子结构 （一）原核微生物拟核体与真核生物相比，原核微生物的染色体要简单得多，其染色体通常只有一个核酸分子 (DNA 或 RNA)，其遗传信息的含量也比真核生物少得多。病毒染色体只含一个 DNA 或者 RNA 分子，可以是单链也可以是双链；大多呈环状，少数呈线性分子。细菌染色体均为环 状双链 DNA 分子。 虽然病毒和细菌的染色体比真核生物小得多，但其伸展长度比其本身仍要大得多，如大 肠杆菌(Escherichia coli) 的 DNA 分子伸展有 1200μm 长，而菌体直径只有 1－2μm，那么 这样长的 DNA 是如何装配到病毒或者细菌里去的呢？ 如图 6－8 所示大肠杆菌染色体为双链环状的 DNA 分子，在细胞中以紧密缠绕成的较 致密的不规则小体形式（拟核）存在于细胞中，其上结合有类组蛋白蛋白质和少量 RNA 分 子， 使其压缩成一种手脚架形的(scaffold)致密结构(大肠杆菌 DNA 分子长度是其菌体长度的 1000 倍，所以必须以一定的形式压缩进细胞中) 。大肠杆菌及其它原核细胞就是以这种拟 核形式在细胞中执行着诸如复制、重组、转录、 翻译以及复杂的调节过程。 研究发现，原核生物的染色体并不是象过去人们认为的那样是“露裸”的 DNA 分子， 其 DNA 分子同样与蛋白质和 RNA 等其它分子结合。例如：大肠杆菌 DNA 与几种 DNA 结 合蛋白(DNA-binding protein)相结合。这些 DNA 结合蛋白很小，但在细胞内数量很多，它们 含有较高比例的带正电荷氨基酸，可以与 DNA 带负电荷的磷酸基团相结合，其特性与真核生物染色体中的组蛋白(histone)相类似。大肠杆菌的染色体 DNA 除与蛋白质结合外，还结 合有 RNA。它的染色体是由 50～100 个独立的负超螺旋环组成的环状结构(图 6－9)。RNA 和蛋白质结合在上面，以保持其结构的稳定性。图 6－8 大肠杆菌染色体图 6－9 原核微生物染色体模型（二）真核微生物染色体1．染色质的基本结构 ． 染色质(chromatin) 染色质(chromatin)是染色体在细胞分裂的间期所表现的形态，呈纤细的丝状结构，故 (chromatin) 亦称为染色质线(chromatin fiber) 染色质线(chromatin fiber)。在真核生物中，它是脱氧核糖核酸(DNA)和蛋白质及 染色质线 少量核糖核酸(RNA)组成的复合物，其中 DNA 的含量约占染色质重量的 30％。蛋白质包括 组蛋白和非组蛋白二类，组蛋白是与 DNA 结合的碱性蛋白，有 H1、H2a、H2b、H3 和 H4 等五种，其在细胞中的比列大致为 1s2s2s2s2。它们几乎为所有生物和细胞所共有，与 DNA 的含量比率大致相等，是很稳定的，在染色质结构上具有决定的作用。而非组蛋白在 不同细胞间变化很大， 在决定染色体结构中作用可能不是很大， 它们可能与基因的调控有关。 近来研究发现，染色质的基本结构单位是核小体(nucleosome)、连接丝(linker)和一个 核小体(nucleosome) 核小体(nucleosome) 分子的组蛋白 H1。每个核小体的核心是由 H2A、H2B、H3 和 H4 四种组蛋白各以两个分子 组成的八聚体，其形状近似于扁球状 (图 6－10)。 DNA 双螺旋就盘绕在这八个组蛋白分子的表面。连接丝把两个核小体串联起来，它是 两个核小体之间的 DNA 双链。组蛋白 H1 结合于连接丝与核小体的接合部位，影响连接丝 与核小体结合的长度。如果 H1 被除去，其核小体的基本结构并不会因此而改变。据测定， 大部分细胞一个核小体及其连接丝约含有 180－200 个碱基对 碱基对(base pair，bp)的 DNA，其中 碱基对 ，约 146 个碱基对盘绕在核小体表面 1.75 圈，其余碱基对则为连接丝，其长度变化较大，从 短的 8 个碱基对到长的 114 个碱基对。图 6－10 核小体结构模型（引自 Russell，2000） 根据染色反应，间期细胞核中的染色质可以分为两种：异染色质(heterochromatin)和 异染色质(heterochromatin) 异染色质(heterochromatin) 常染色质(euchromatin) 常染色质(euchromatin)。异染色质是染色质线中染色很深的区段，这称为异染色质区 (euchromatin) (heterochromatin region)；常染色质是染色很浅的区段，这称为常染色质区(euchromatin region)。据分析，异染色质和常染色质在化学性质上并没有什么差别，只是在细胞分裂间期 异染色质高度螺旋化而紧密卷缩， 而常染色质区的染色质表现为脱螺旋而呈松散状态。 染色 体的这种结构与功能密切相关， 常染色质可经转录表现为活跃的遗传功能， 而异染色质一般 不编码蛋白质，只对维持染色体结构的完整性起作用。 2．染色体的结构模型 ． 染色体的结构是由两条染色单体(chromatid)组成的。每条染色单体包括一条染色线 染色单体(chromatid) 染色单体(chromatid) 染色线 (chromonema)，以及位于线上许多染色很深、颗粒状的染色粒(chromomere)。染色粒的大 染色粒(chromomere) (chromonema) 染色粒(chromomere) 小不同，在染色线上有一定的排列顺序。每个染色体所含的染色质线是单线的，即一个染色 体所包含的两条染色单体都分别是单线的，换言之，每条染色单体是一个 DNA 分子与蛋白 质结合形成的染色质线。 在细胞分裂过程中染色质线到底是怎样卷缩成为一定形态结构的染 色体的呢？现在认为至少存在三个层次的卷缩(图 6－11)： 第一个层次是 DNA 分子超螺旋化形成核小体，产生直径约为 10nm 的间期染色质线，在此 过程中组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4 参与作用。第二个层次是核小体的长链进一步螺旋化 形成直径约为 30nm 的超微螺旋，称为螺线管(solenoid) 螺线管(solenoid) 螺线管(solenoid)，此过程中组蛋白 H1 参与作用。 最后是染色体螺旋管进一步卷缩, 并附着于由非组蛋白形成的骨架(scaffold)或者称中心 骨架(scaffold) 骨架(scaffold) (central core)(图 6－11)上面成为一定形态的染色体。但有关三个层次卷缩的机理至今尚不清 楚。因为染色体本身就是细胞分裂期间染色质的卷曲压缩，所以染色体也会象染色质一样， 出现异染色质区和常染色质区。图 6－11 染色体结构模型 3．着丝粒和端体 染色体另外二个重要的结构就是着丝粒(centromoere)和端体(telomere) 着丝粒(centromoere) 端体(telomere)。着丝粒是染 着丝粒(centromoere) 端体(telomere) 色体的缩缢部位，是细胞分裂过程中纺锤丝(spindle fiber)结合的区域，染色体在有丝分裂和 减数分裂过程中在纺锤丝的牵引下分向二极。因此，着丝粒在细胞分裂过程中，对染色体向 子细胞的正确分配起着关键的作用。缺少着丝粒的染色体片段，由于没有纺锤丝的牵引，在 细胞分裂过程中经常容易丢失。 端体(telomere)也就是染色体的末端，存在着特珠的结构。主要有三方面的功能：一是 防止染色体末端为 DNA 酶酶切；二是防止染色体末端与其它 DNA 分子的结合；三是使染 色体末端在 DNA 复制过程中保持完整。对不同物种染色体末端的结构分析发现，所有染色 体的末端都存在着串连的重复序列。 尽管不同生物的重复序列有所不同， 但均可用下列通式 表示：5’-T1-4 - A0-1 CG1-8 C3’ 。如人类为 TTAGGG，原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila) 为 TTGGG，而植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为 TTTAGGG。但这种保守序 列重复的次数在不同生物、 同一生物的不同染色体， 甚至同一染色体在不同的细胞生长时期也可能不同。有关端体的具体结构有待进一步研究。三、微生物基因组 （一）基因与基因组的概念1．基因概念及其发展 ． ①经典遗传学中关于基因的概念 按照经典遗传学对基因的概念，基因具有下列共性： 基因具有染色体的主要特性，能自我复制，有相对的稳定性，在有丝分裂和减数分裂中 有规律的进行分配；基因在染色体上占有一定位置(位点)，并且是交换的最小单位，即在重 组时不能再分隔的单位；基因是以一个整体进行突变的，故它又是一个突变单位；基因是一 个功能单位，它控制着正在发育有机体的某一个或某些性状，如红花、白花等。 可以把重组单位和突变单位统称为结构单位。这样，基因既是一个结构单位，又是一个 功能单位。 ②分子遗传学关于基因的概念 分子遗传学的发展揭示了遗传密码的秘密，使基因的概 念落实到具体的物质上，获得了具体的内容。广泛的试验证明，DNA 是主要的遗传物质， 基因在 DNA 分子上，基因（gene）是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段，在生物体内具 基因（ 基因 gene） 有自主复制能力的遗传功能单位， 包括编码蛋白质多肽链的核酸序列， 也包括保证转录所必 需的核酸调控序列以及 5’和 3’端的非翻译序列。 另一方面，在精细的微生物遗传分析中查明，基因并不是不可分割的最小遗传单位，而 是远为复杂得多的遗传和变异的单位。例如，在一个基因的区域内，仍然可划分出若干个起 作用的小单位。按照现代遗传学的概念，重组、突变、功能这三个单位应该分别是： 突变子(muton)， 突变子(muton)， 它是性状突变时，产生突变的最小单位。一个突变子可以小到只是 (muton) 一个核苷酸；重组子 (recon)， 在发生性状的重组时，可交换的最小的单位称为重组子。 重组子 (recon)， 据微生物重组的精细研究证明，一个交换子可只包含一对核苷酸；顺反子(作用子)(cistron)， 这一术语表示一个起作用的单位， 基本上符合通常指的基因。 一个作用子所包括的一段 DNA 与一个多肽链的合成相对应。 由此可知，基因是一个功能单位的概念仍然是正确的，但不是最小的结构单位。因为作 为结构单位的基因实际上包含大量的突变子或重组子。 然而关于基因的概念是：(1)可转录一条完整的 RNA 分子，或编码一条多肽链；(2)功能 上被顺反测验(cis-trans test)或互补测验(complementary test)所规定。可以说，分子遗传学保 留了功能单位的解释，而抛弃了最小结构单位的说法。 随着基因结构和功能的深入研究， 使基因的概念有了新的内容和认识， 进一步可将基因分为不同类型。 gene)，可编码 RNA 或蛋白质的一段 DNA 序列； 结构基因 (structural gene) gene)，其产物参与调控其它结构基因表达的基因； 调控基因 (regulator gene) 重叠基因(overlapping gene)， 由于阅读框架(open reading 重叠基因(overlapping gene) 指同一段 DNA 的编码顺序， (overlappi frame，ORF)的不同或终止早晚的不同，同时编码两个或两个以上多肽链的现象; 隔裂基因(split gene)，指一个结构基因内部为一个或更多的不翻译的编码顺序，如 隔裂基因(split gene) 内含子(intron)所隔裂的现象； 跳跃基因(jumping gene)，可作为插入因子和转座因子移动的 DNA 序列，有人将它作 跳跃基因(jumping gene) 为转座因子的同义词； (pseudogene)，同已知的基因相似，但位于不同位点，因缺失或突变而不能转 假基因 (pseudogene) 录或翻译，是没有功能的基因。还有根据基因来源将基因分为核基因，线粒体基因，叶 绿体基因等。 2．基因组概念 ． 自然界绝大多数生物体的遗传信息贮存在 DNA 的核苷酸排列顺序中。 DNA 是巨大的生 物高分子，一般将细胞内遗传信息的携带者在染色体所包含的 DNA 总体称为基因组 (genome)。细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体(hoploid)；真核微生物通常是有二套 单倍体(hoploid) 单倍体(hoploid) 基因又称二倍体(diploid)。基因组通常是指全部一套基因。由于现在发现许多非编码序列 二倍体(diploid) 二倍体(diploid) 具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的 DNA 序列组 成的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的 DNA 序列。 同一物种的基因组 DNA 含量总是恒定的，不同物种间基因组大小和复杂程度则差异极 大，一般讲，进化程度越高的生物体其基因组构成越大、越复杂，见(表 6－4)。? 表 6－4 有代表性的生物体内 DNA 大小 分子量 最简单的微生物 SV40 病毒 λ 噬菌体 细菌 哺乳动物 大肠杆菌 小鼠 人 3×106碱基对（bp) 5×107 33.4×10 2.2×10 1.5×10 1.8×105×10494.6×10 2.3×10 2.8×106129129（二）原核微生物基因组特点（1） 基因组较小， 没有核膜包裹， 且形式多样， 如病毒基因组可能是 DNA， 也可能是 RNA，可能是单链的，也可能是双链的，可能是闭环分子，也可能是线性分子；细菌染色体基因组 则常为环状双链 DNA 分子，并与其中央的 RNA 和支架蛋白构成一致密的区域，称为类核 类核 (nucleoid)。 (nucleoid) （2）具有操纵子结构。功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同一个 mRNA 分子 中，称为多顺反子 mRNA(polycistronic mRNA) 多顺反子 mRNA)，然后再加工成各种蛋白质的模板 mRNA。 （3）DNA 分子绝大部分用于编码蛋白质，不编码部分(又称间隔区)通常包含控制基因表达 的顺序。例如，噬菌体 ψx 174 中只有 5%是非编码区。 （4）基因重叠是病毒基因组的结构特点，即同一段 DNA 片段能够编码两种甚至三种蛋白 质分子。 （5）除真核细胞病毒外，基因是连续的，即不含内含子序列。? 大肠杆菌是目前研究得最深入的一种代表性的细菌原核微生物。其基因组是双链环状的DNA 分子，在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式（拟核）存在。基因组全序 列测定于 1997 年由 Wisconsin 大学的 Blattner 等人完成，其基因组结构特点如下： 1．遗传信息的连续性 ??大肠杆菌和其它原核生物中基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数(通常以 1000bp～1500bp 为一个基因计)，说明这些微生物基因 组 DNA 绝大部分用来编码蛋白质、 RNA；用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别 和结合的位点等信号序列。 除在个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌)和古生菌的 rRNA 和 tR NA 中发现有内含子或间插序列外， 其它绝大部分原核生物不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 2．功能相关的结构基因组成操纵子结构 大肠杆菌总共有 2584 个操纵子，基因组测序推测出 2192 个操纵子。其中 73%只含一 个基因，16.6%含有 2 个基因，4.6%含有 3 个基因，6%含有 4 个或 4 个以上的基因。大肠杆 菌有如此多的操纵子结构， 可能与原核基因表达多采用转录调控有关， 因为组成操纵子有其 方便的一面。 此外有些功能相关的 RNA 基因也串联在一起，如构成核糖核蛋白体的三种 RNA 基因 转录在同一个转录产物中，它们依次是 16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA。这三种 RNA 除了 组建核糖体外，别无他用，而在核糖体中的比例又是 1∶1∶1，倘若它们不在同一个转录产 物中，则或者造成 这三种 RNA 比例失调，影响细胞功能；或者造成浪费；或者需要一个 极其复杂、耗费巨大的调节机构来保持正常的 1∶1∶1。? 3．结构基因的单拷贝及 rRNA 基因的多拷贝?? 在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码 rRNA 的基因 rrn 往往是 多拷贝的，大肠杆菌有 7 个 rRNA 操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方 向表达。 4．基因组的重复序列少而短 ?? 原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复的序列比 较短，一般为 4～40 个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次。（三）真核生物基因组特点 真核生物基因组特点（1）真核生物基因组 DNA 与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外， 体细胞内的基因组是双份的(即双倍体，diploid)，即有两份同源的基因组。 （2）真核细胞基因转录产物为单顺反子(monocistron)，即一个结构基因转录、翻译成一个 mRNA 分子，一条多肽链。 （3）存在大量重复序列，即在整个 DNA 中有许多重复出现的核苷酸顺序，重复序列长度 可长可短，短的仅含两个核苷酸，长的多达数百、乃至上千。重复频率也不尽相同；高度重 复序列重复频率可达 106 次，包括卫星 DNA、反向重复序列和较复杂的重复单位组成的重 复序列；中度重复序列可达 103～104 次，如为数众多的 Alu 家族序列，KpnI 家族，Hinf 家 族序列，以及一些编码区序列如 rRNA 基因、tRNA 基因、组蛋白基因等；单拷贝或低度重 复序列， 指在整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列， 主要是编码蛋白质的结构 基因，在人基因组中占约 60～65%，因此所含信息量最大。 （4）基因组中不编码的区域多于编码区域。 （5）基因是不连续的，在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序列 间隔序列 (intervening sequences)，称为内含子(intron) 内含子(intron) 外显子(exon) (intervening sequences) 内含子(intron)，编码区则称为外显子(exon) 外显子(exon)。内含子与 外显子相间排列，转录时一起被转录下来，然后 RNA 中的内含子被切掉，外显子连接在一 起成为成熟的 mRNA，作为指导蛋白质合成的模板。 （6）基因组远大于原核生物的基因组，具有许多复制起点，而每个复制子的长度较小。? 啤酒酵母是单细胞真核生物，1996 年，由欧洲、美国、加拿大和日本共 96 个实验室的633 位科学家的艰苦努力完成了全基因组的测序工作， 这是第一个完成测序的真核生物基因 组。该基因大小为 13.5×106bp，分布在 16 个不连续的染色体中。像所有其它的真核细胞一 样， 酵母菌的 DNA 也是与四种主要的组蛋白(H2A、 H2B、 和 H4)结合构成染色质(chromatin) H3 的核小体核心 DNA；染色体 DNA 上有着丝粒(centromere)和端粒(telomere)，没有明显的操 纵子结构，有间隔区或内含子序列。酵母菌基因组最显著的特点是高度重复， tRNA 基因在每个染色体上至少是 4 个，多则 30 多个，总共约有 250 个拷贝(大肠杆菌约 60 个拷贝)。 rRNA 基因位于ⅩⅡ号染色体的近端粒处，每个长 9137bp，有 100～200 个拷贝。酵母基因 组全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的 DNA 重复序 列，并称之 为遗传丰余(genetic redundancy) 遗传丰余(genetic redundancy)。酵母基因组的高度重复或遗传丰余是一种浪费和多余 遗传丰余 呢?还是一种进化的策略呢?显然应该是后者，所有现存的生物在自然的不断选择下 ，总是 以合适的结构特征来完成其生命过程。四、染色体外遗传成份基因不仅存在在染色体上， 还存在于细胞中的染色体外的遗传因子上， 这些染色体外的 遗传因子见图 6－12。（一）原核微生物核外遗传物质1．质粒的复制 ． 质粒（图 6－13、6－14）是一个复制子(replicon)，它的复制若与核染色体复制同步， 称严紧型复制控制(Stringent replication control) 严紧型复制控制(Stringent control)，一般细胞内只含 1?2 个这种质粒； 严紧型复制控制 另一类质粒复制与核染色体复制不同步，称松驰型复制控制(Relaxed replication 松驰型复制控制(Relaxed 松驰型复制控制 control)，一般细胞内含 10?15 个甚至更多的这类质粒。少数质粒可以在不同的菌株之间 control) 转移，如 F 因子和 R 因子等。 原核生物的染色体 核染色体 真核生物的染色体遗传物质类型 细胞质基因（线粒体 叶绿体等） 真核生物的 核外遗传因子 原核生物的 共生生物：卡巴颗粒 酵母菌：2?m质粒 F因子（ F质粒） R因子（R质粒） Col质粒 Ti质粒 巨大质粒图 6－12 染色体内和染色体外的遗传因子 革兰氏阴性细菌中多数质粒的复制方式与染色体复制类似，包括在复制起始位点的开 始,围绕环形分子的双向复制，出现θ型中间体等。也有些质粒是单向的复制。参与质粒复 制的酶均为细胞中正常的酶， 质粒本身的遗传因子控制着复制的起始时间， 以及将复制后的质粒分配到两个子细胞中。 而在革兰氏阳性菌中多数质粒的复制是通过滚环机制， 这种复制 会形成单链的中间体，因此这些质粒有时就是单链 DNA 质粒。已知多数线型质粒的复制机 制是以一种蛋白结合在双链的 5’末端，从而引导 DNA 的合成。图 6－13 质粒的电镜图片（箭头所示）图 6－14 质粒 DNA 的三种形式某些质粒具有与核染色体 DNA 发生整合的功能，如 F 因子，这类质粒称为附加体 附加体 。质粒还具有重组的功能，可在质粒之间、质粒与核染色体之间发生重组。 （Episome） Episome） 有许多种方法处理宿主细胞可去除质粒， 这一过程称为消除。 丫啶类染料、 丝裂霉素 C、 紫外线、 利福平、 重金属离子或高温等因素处理含质粒的细胞时， 由于质粒的复制受到抑制， 而核染色体的复制仍继续进行，可以使子代细胞中的质粒消除。 2．质粒的类型 大多数质粒控制着宿主的一种或几种特殊的性状，具有一定表现型，按其表 现型不同分为以下几类型。 ①F 因子（fertility factor） 或称为致育因子或性因子，又称 F 质粒，这是最早发现的 F 因子（ factor） 一种与大肠杆菌的有性生殖现象(接合作用)有关的质粒。它决定细菌的性别，与细菌接合作 用有关。其大小约 100kb，分子量 63MDa，可分为复制控制区、插入与缺失区和转移操纵 子等 3 个部分（如图 6－15） 。 图 6－15 所示内圈的数字单位为 kb，表示质粒的大小。F 质粒上各个基因的含义：tra 表示转移功能；oriT 为转移起始；oriS 为复制起始；inc 表示不相容；rep 是复制功能。黑色 区域表示转座子，通过这些部位可以整合进细菌染色体上相同的区域形成各种 Hfr 菌株。图 6－15 大肠杆菌 F(致育)质粒的基因图。 。 携带 F 质粒的菌株称为 F+菌株(相当于雄性)， F 质粒的菌株称为 F-菌株(相当于雌性)。 无 F 质粒整合到宿主细胞染色体上的菌株称之为高频重组菌株(high frequence 高频重组菌株(high 高频重组菌株 Hfr)。由于 F 因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr) recombination, 简称 Hfr) 存在于细胞中。 F 质粒在大肠杆菌的接合作用(conjugation)中起主要作用。当 Hfr 菌株上的 F 因子通过重组回复成自主状态时，有时可将其相邻的染色体基因一起切割下来，而成为携 带某一染色体基因的 F 因子，例如 F-lac、F-gal、F-pro 等。因此将这些携带不同基因的 F 因子统称为 F′，带有这些 F′因子的菌株也常用 F′表示。 ②R 因子（resistance factor）又称抗药性质粒，是分布最广、研究得最充分的质粒之一。 R 因子（ factor） 主要包括抗药性和抗重金属二大类，简称 R 质粒。带有抗药性因子的细菌有时对于几种抗 生素或其他药物呈现抗性。例如 R1 质粒(94kb)可使宿主对下列五种药物具有抗性：氯霉素 (Chlorampenicol, Cm)、链霉素(Streptomycin, Sm)、磺胺(Sulfonamide, Su)、氨苄青霉素 (Ampicillin, Ap)和卡那霉素(Kanamycin, Km)，并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于 R1 抗性质粒上。它能赋予宿主抵抗各种抗生素或生长抑制剂的功能。研究表明，细菌的耐抗生 素的性状主要是由于 R 因子在菌株之间迅速转移所致。抗重金属 R 质粒能使宿主细胞对许 多金属离子呈现抗性，包括碲(Te6+)、砷(As3+) 、汞(Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉 (Cd2+)等。 在肠道细菌中发现的 R 质粒，约有 25%是抗汞离子的，而铜绿假单胞菌中约占 75%。 R 因子一般由相连的二个 DNA 片段组成， 其一称 RTF 质粒 resistance transfer factor, （ 抗性转移因子） ，它含调节 DNA 复制和转移的基因；其二是抗性决定质粒（r-determinant） ， 抗性转移因子）含有抗性基因，如：青霉素抗性（penr） ，氨苄青霉素抗性（Ampr） ，氯霉素抗性（Camr） ， 四环素抗性（Strr） ，卡那霉素抗性（Kanr）及磺胺药物抗性（Sulr）等。由 RTF 质粒和抗性 决定质粒结合而形成 R 因子的过程见图 6－16。图 6－16 R 因子的结构组成 此外，R 因子能自行重组，即来自两种不同耐药菌株的 R 因子基因整合在一起，构成 多重耐药菌株。R 因子也是借助性纤毛进行接合而传递的，在 R 因子和 F 因子之间也能发 生重组，但 R 因子不能整合到核染色体上，所以它不是附加体而是一种稳定的质粒。 R 因子在细胞内的数量可从 1 至 2 个到几十个不等，分属严紧型和松弛型复制控制。 后者经氯霉素处理后，拷贝数甚至可达
个。因为 R 因子对多种抗生素有抗性，因 此，可作为菌株筛选时的遗传标记，也可用作基因转移的载体。 ③Col 因子（Colicinogenic factor）又称为产大肠杆菌素因子。因这类质粒首先发现于大 Col 因子（ factor） 肠杆菌中而得名，该质粒含有编码大肠菌素的基因，大肠菌素是一种细菌蛋白，通过抑制复 制、转录、翻译或能量代谢等而专一性地杀死近缘且不含 Col 质粒的菌株，而宿主不受其产 生的细菌素的影响，质粒本身编码一种免疫蛋白，从而使宿主对大肠杆菌素有免疫作用，不 受其伤害。Col 质粒分子量约 4×104?8×104Da，分两类，分别以 ColE1 和 ColIb 为代表。前 者分子量小，约为 5×106Da，是多拷贝和非转移性的；后者的分子量约为 80×106Da，只有 1?2 个拷贝，可通过性纤毛转移。但由于 Col 因子有较弱的阻遏系统，它不能象 F 因子或 R 因子那样在群体中快速传播。 由 G+细菌产生的细菌素通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳 酸细菌产生的细菌素 NisinA 能强烈抑制某些 G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。 ④毒性质粒 许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的， 毒性质粒 这些质粒具有编码毒素 的基因，如苏云金杆菌含有编码 δ 内毒素(伴孢晶体中)的质粒、大肠杆菌编码肠毒素的质粒 以及根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti 质粒（Tumor inducing plasmid） 。 其中主要代表 Ti 质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子，其宿主是一种根癌土壤杆菌。 其机制是 Ti 质粒上的一段特殊 DNA 片段转移至植物细胞内并整合其染色体上， 导致细 胞无控制的瘤状增生，合成正常植物所没有的冠瘿碱(opines)化合物，该 DNA 片段称为 T-DNA 其上含有三个致癌基因。Ti 质粒长 200kb，是大型质粒，当前 Ti 质粒已成为植物遗 传工程研究的重要载体，一些具重要性状的外源基因可借 DNA 重组技术插入到 Ti 质粒中， 并进一步使之整合到植物染色体上，以改变植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。 ⑤共生质粒 为近年来在根瘤菌属（Rhizobium）中发现的一种质粒，分子量为 200?300X106Da，比一般的质粒大几十倍至几百倍，故称巨大质粒。质粒上有一系列固氮基 因。 含有这类质粒的细菌， ⑥降解性质粒 这类质粒上携带有能降解某些基质的酶的基因， 特别是假单胞菌， 能将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式， 从 而能利用一般细菌所难以分解的物质为碳源。 这些质粒以其所分解的底物命名， 例如有 CAM （分解樟脑）质粒，OCT（辛烷）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL （扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和 TOL（甲苯）质粒等。 ⑦隐秘质粒(cryptic plasmid) 以上的质粒类型均具有某种可检测的遗传表型，但隐 隐秘质粒(cryptic 隐秘质粒 秘质粒不显示任何表型效应， 它们的存在只有通过物理的方法， 例如用凝胶电泳检测细胞抽 提液等方法才能发现。目前他们存在的生物学意义几乎不了解。 3．质粒的特性 ． ①质粒的不亲和性 细菌通常含有一种或多种稳定遗传的质粒，这些质粒可认为是彼此 亲和的(compatible)。如不同质粒不能共存于同一细胞中这种特性称为质粒不亲和性 质粒不亲和性 (incompatibility)。根据某些质粒在同一细菌中能否并存的情况，可将质粒分成许多不亲 (incompatibility) 和群(incompatibility group)，能在同一细菌中并存的质粒属于不同的不亲和群，而在同一细 菌中不能并存的质粒属于同一不亲和群。 这是因为质粒的不亲和性现象主要与复制和分配有 关， 所以不能在同一细胞共存的质粒是因为它们共享一个或多个共同的复制因子或相同的分 配系统 ，因此它们便属于同一不亲和群。只有具有不同的复制因子或不同分配系统的质粒 才能共存于同一细胞中，所以它们必然属于不同的不亲和群。 ②质粒的稳定性 正常条件下质粒在细胞分裂前复制，并特殊的分配机制以保证其在子 代细胞中的均等分配，从而实现质粒遗传的稳定。细胞学研究结果表明，质粒分配方式可能 与染色体的相似， 都是依附于细胞质膜特定位点的方式， 随细胞分裂而均等分配到子细胞中。（二）真核微生物核外遗传物质1．真核微生物质粒 ．真核微生物质粒?在细菌中存在着质粒这是为大家熟知的现象，然而在真核生物的细胞中也有质粒存在， 只不过不是像细菌那样普遍而以。 由于质粒一般和核染色体没有关系， 因此表现出一种非孟 德尔式遗传模式，和细胞器 DNA 的一些传递途径较为相似。大部分真核质粒没有明显的表 型效应，只能用一些分子水平的技术才能检测到它。 多数酵母菌中也含有一种典型的质粒称为 2μ质粒（图 6－17） ，在酿酒酵母菌中，2μ 质粒的拷贝数较高约 30 个／细胞，这是目前研究得比较深入且具有广泛应用价值的酵母质 粒，可用于构建基因工程载体。虽然在不同的酵母菌株中观察到 2?m DNA 有不同的限制性 图谱，但它们的基本结构都具有以下特点： 它们是封闭环状的双链 DNA 分子，周长约 2?m(6kb 左右)，以高拷贝数存在于酵母细 胞中，每个单倍体基因组含 60-100 个拷贝，约占酵母细胞总 DNA 的 30%；各含约 600bp 长的一对反向重复顺序；由于反向重复顺序之间的相互重组，使 2?m 质粒 在细胞内以两种 异构体(A 和 B)形式存在； 该质粒只携带与复制和重组有关的 4 个蛋白质基因(REP1、 REP2、 REP3 和 FLP)，不赋予宿主任何遗传表型，属隐秘性质粒。? 图 6－172? 质粒的基本结构另一个很好的真核质粒的例子是在脉胞菌中一种衰老品系,在一般的培养基上不能生 长，不久死亡。在夏威夷发现了这种群体，人们称这个品系为“Kalilo”，夏威夷语的意思就 是“死亡之门” 。Kalilo 品系仅在穿入培养基一定的深度时才能生长，然后就会死去，在未 死前将这个品系进行杂交， 其致死能力将以母体遗传的方式传递给后代。 现已发现这种衰老的特征是由一长 9Kb 的线粒体质粒决定的，这种质粒叫做 Kal DNA，它可以独立存在于细 胞质中，而且是无害的。但一插入到 mtDNA 中就可引起逐步死亡。在死掉的细胞中，大部 分 mtDNA 分子都有 Kal DNA 的插入。推测这个品系的衰老和死亡可能由于插入 KalDNA 的干扰或破坏了线粒体的正常功能。因此看来 Kal DNA 就像是个“分子寄生虫” 。 2．真核微生物线粒体的遗传 ．真核微生物线粒体的遗传 线粒体(mitochondrion) 线粒体(mitochondrion)是细胞中代谢中心之一，它是产生呼吸酶和其它酶系的地方。 (mitochondrion) 线粒体呼吸酶的缺少，会影响细胞的生长，所以某些“生长迟缓”的突变，例如酿酒酵母菌 （Saccharomyces cerevisiae）的“小菌落”（petite colony）就跟线粒体有着密切的关系。线粒 体遗传特征的遗传发生在核外和有丝分裂和减数分裂过程以外，因此它是一种细胞质遗传 细胞质遗传 inheritance)， 非孟德尔遗传(non inheritance)。 (cytoplasmic inheritance) 有时也称之为非孟德尔遗传(non ? Mendelian inheritance) 非孟德尔遗传 mtDNA 是双链环状的分子，由于缺乏组蛋白，故不组成核小体。在线粒体中有和细菌 细胞中相似的类核区（nuclecid regions） ，每个类核中含有几个拷贝的线粒体染色体。例如 酵母每个线粒体含有 10～30 个类核，每个类核含有 4～5mtDNA 分子。由于每个酵母细胞 中有 1~45 个线粒体，这样每个细胞就有很多 mtDNA 分子。 线粒体 DNA 含有的大量线粒体成份的信息，如 tRNAs，tRNAs 和蛋白。线粒体含有的 核糖体是负责线粒体中所有蛋白质合成的。mRNA 也是在线粒体中合成的，它保留在细胞 器中， 由线粒体的核糖体进行翻译。 在线粒体的核糖体中有两类 rRNA 分子， 它们由 mtDNA 编码。线粒体的核糖体蛋白大部分由核基因编码。mtDNA 结构的共同特点是： ①基因数目和排列顺序相同。共有 2 个 rRNA 基因（12S 和 16SRNA） ，22 个 tRNAs， 13 个线粒体膜蛋白基因和 1 个氧化时所需的基因； ②其中 2 个 rRNAS，14 个 tRNAs 和 12 个蛋白质基因在重链上（H） ，另 8 个 tRNAs 和 1 个蛋白质基因在轻链（L）上； ③有一个 D 环，与 mtDNA 的复制有关； ④有 2 个复制起始点，分别复制 H 和 L 链； ⑤基因间没有间隔， 因此每个基因不可能都有自己的启动子。 此明显具有原核生物性质； ⑥某些蛋白质的密码子与核基因通用密码子不同； ⑦mtDNA 主要编码 rRNA 和 tRNA 分子，氧化呼吸所需要的酶类大部分亚基由核基因 编码，mtDNA 仅编其中少部分亚基。 酿酒酵母的线粒体基因组是双链环状分子，长约 25?m(约 75Kb)，其大小约为人的线粒体基因组的 5 倍(人的线粒体大小约为 16Kb)。像大多数线粒体 DNA(简称 mtDNA)一样，酵 母 mtDNA 也只编码少数几种最基本的线粒体成分： 细胞色素 b、 细胞色素 c 氧化酶、 ATPase 以及一种核糖体蛋白。此外，许多 tRNA 分子也由酵母 mtRNA 编码。酵母的 mtRNA 上存 在大量的非编码 A+T 丰富区，其功能目前不清楚，但是已知这些区域含有酵母线粒体基因 组的多个复制原点。 此外， 酵母的 mtDNA 上还存在大量的间插顺序或内含子。 酵母 mtDNA 基因组上所含的基因数与高等动物基本相同， 但是因为它有很多非编码 DNA 和含有内含子， 所以酵母的线粒体基因组相当大。 在蛋白质合成时， 20 种氨基酸有 61 种对应的密码子，按照摆动学说，最少需要 32 种 tRNA 才能完全识别 mRNA 中的 61 个密码子。 但在线粒体中， tRNA 的种类显然小于此数(如 人的 mtRNA 只有 22 种)，而且已有实验证明，无细胞质 tRNA 进入线粒体参入其蛋白质的 合成过程。这些事实表明，在线粒体基因表达过程中的密码系统与通用密码系统不一样。密 码的非通用性首先是在线粒体中发现的， 但是现在已知在一些细胞基因组中已被应用。 例如 有些原核生物用 GUG 为起始密码而不是通用的 AUG。 线粒体的核糖体在大小上类似于原核生物的核糖体， 但是前者核糖体的一个重要特征是 对影响细菌中蛋白质合成的抗生素敏感， 所以线粒体中蛋白质的合成受氯霉素的抑制， 这一 现象表明，线粒体与细菌之间的近缘关系，也是支持真核的细胞器(线粒体、叶绿体)是由内 共生细菌演化出来的假设的重要证据之一。?五、转座遗传因子转座遗传因子又叫可移动因子，是指可以在染色体组内可自主复制和移动的一段特定 DNA 序列。它从一个位点切除，插入到一个新的位点。这种切除和移动，能够引起基因的 突变或染色体重组。它广泛存在于原核和真核细胞中（表 6－5） ，是 McClintock(1956 年)在 玉米上首先发现的。这是遗传学发展史上重要的里程碑之一。 表 6－5 原核和真核生物中的转座因子 原核生物 插入顺序：IS 转座子：Tn 病毒：Mu 酵母：sigma 酵母：TY 果蝇：copia,P ?玉米：Ac ?逆转录 病毒：劳氏 肉瘤、人免疫缺陷病毒 (HIV) 真核生物（一）转座子的分类和结构特征根据分子结构与遗传特性可以分为三类：插入顺序（insertion sequence, IS 、转座 插入顺序（ IS） 转座 插入顺序 Tn） 。 子（transposon, Tn）和某些特殊病毒（如 Mu、D108）1．插入序列 ． 插入序列(insertion sequence， 表示) 插入序列(insertion sequence，以 IS 表示)是已知具有转座能力最简单的遗传因子， 长度大都小于 2kb，最少的插入序列如 IS1 只用 768bp。IS 因子只含有与转座有关的基因与 序列。它们的一个共同特征是，在它们的末端都具有一段倒置重复序列 倒置重复序列(IR)。但其长度并不 倒置重复序列 一定相等。 (见图 6－18)。图 6－18 转座因子的形体图 2．转座子 ． 转座子(transposons) 转座子(transposons)是由几个基因组成的特定的 DNA 片段，而且往往带有抗菌素 (transposons) 抗性基因，所以易于鉴定。根据结构特性的不同，转座子可以分为复合转座子和 TnA 家族 子 系两种系统。复合转座子是由 2 个同样的 IS 序列连接抗菌素抗性片段的两侧构成的（如图 6－19） 。在这些复合单位中，IS 因子可以是反向重复的构型，也可以是同向重复的构型。 TnA 家族转座子结构比较复杂，长度约为 5000bp。末端有一对 38bp 的倒置重复序列（IR） ， 但不含有 IS 序列。每个转位子都带有 3 个基因:一个是编码对氨苄青霉素抗性的βC内酰胺 酶(βClactamase)基因，其它二个是编码与转座作用有关的基因 (见图 6－20)。图 6－19 复合转座子结构图 6－20 转座子 TnA 的结构3．Mu 噬菌体 ． 噬菌体(Mu) 它是大肠杆菌的温和噬菌体，溶源化后，能起到转座子的作用。和转座子一样，它也含 有与转座有关的基因和反向重复序列。Mu 能够整合进寄主染色体，催化一系列染色体重复 排列。（二）转座机制转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的(3―12bp)、 被称为靶序列的 DNA 会被复制，插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。研究最清楚的 是细菌的转座子。转座子的转座一方面依赖于必要的结构―两端的 IR 序列，另一方面依赖 于基因的作用。 和转座有关的蛋白质一般都由转座子本身的基因所编码。 转座过程是一个非 同源重组过程。 转座可被分为复制性和非复制性两大类。在复制性转座中，整个转座子被复制了，所移 动和转位的仅仅是原转座子的拷贝。转座酶(transposnse)和解离酶(resolvase）分别作用 转座酶(transposnse) 解离酶(resolvase） 转座酶(transposnse) 解离酶(resolvase 于原始转座子和复制转座子。TnA 类转座主要是这种形式。与此相对应，在非复制性转座 中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS 序列、Mu 及 Tn5 等都以这种方式进 行转座。 通过这一重组过程转座子出现在一个新的位置上， 可是原来位置上的转座子并不消 失。（三）转座的遗传效应转座因子的转座可引发多种遗传学效应，如基因重排及质粒―染色体 DNA 整合等。这 些效应不仅在生物进化上有重要的意义， 而且已成为遗传学研究中的一种重要的工具。 这些 遗传变化主要包括： （1）转座引起插入突变 ?各种 IS、Tn 等转座因子插入可引起突变。如果插入位于某操纵 子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活。 （2）转座产生新的基因 的基因标记的插入突变。 （3）转座产生染色体畸变 由于复制性转座是转座子一个拷贝的转座，处在同一染色体上 不同位置的二个拷贝之间可能发生同源重组，这种重组过程可导致 DNA 的缺失或倒位，即 染色体畸变。 （4）转座引起的生物进化 由转座作用引起的基因的移动和重排，可能使一些原来在染色 体上相距甚远的基因组合到一起， 构建成一个操纵子或表达单元， 也可能产生一些具有新的 生物学功能的基因和新的蛋白质分子，具有生物进化上的重要意义。 如果插入的是带有抗性(或其它)基因的转座子，则可获得带有新第三节 基因突变一、基因突变概述突变( mutation)是遗传物质中不是由于遗传重组产生的任何可遗传的改变。改变可以 突变( mutation) 是基因内部遗传结构或 DNA 序列的任何改变而导致可遗传的变化。突变包括染色体畸变和 基因突变两大类。染色体畸变(chromosomal aberration) 染色体畸变(chromosomal aberration)，包括大段染色体的缺失、重复、 染色体畸变 倒位、易位；基因突变是指染色体上基因本身的变化。发生在基因水平的突变称为基因突变 基因突变 mutation ，它涉及到基因的一个或多个序列的改变，包括一对或多对碱基对的替 tion） （gene mutation） 换，增加或缺失。由于 DNA 碱基对的改变引起的基因突变称为点突变（point mutation） 点突变（ mutation） 。 点突变 广义的突变也称基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、 。 重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。突变的几率一般很低（10-6～ 10-9） 基因突变的结果取决于多种因素， 特别是导致氨基酸信息的改变， 例如错义突变可以导 致氨基酸的置换， 无义突变可以导致多肽含成的提前终止。 基因回复突变可以恢复原来的顺 序，也可以是在另一位点发生新的突变，结果使表型得到恢复。后者称为抑制，它们可以发 生原来突变的密码子上， 也可以发生在不同的密码子上。 回复突变和原来的突变不在同一基 因内时称为基因间抑制。这种抑制常涉及到 tRNA 反密码子的改变。 基因突变分为自发突变和诱发突变两类。 基因突变可由放射线所引起， 放射线通过使染 色体断裂产生遗传损伤。 也可由化学物质和 DNA 的作用而产生， 或者由于导致 DNA 之间异常 链的形成而产生。一定种类的 DNA 损伤可能由放射线而引起，但不是染色体的断裂，它可被 细胞中的修复系统所校正。 基因突变可以由某些化学物质所引起， 这些化学物质称为化学诱 变剂。现已知很多的化学诱变剂，它们诱变的机制是不同的。在 DNA 复制过程由于碱基类似 物的取代，碱基的化学修饰以及碱基的插入和缺失都会引起突变。 在原核和真核细胞中都存在很多的修复系统， 这些修复系统可恢复不同的 DNA 损伤。 各 种系统都是通过酶的作用来校正。 有的系统是直接校正 DNA 损伤， 有的是通过切除来进行修 复。 从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株（wild type strain） 野生型菌株（ strain） ，简称野生型。野生型 野生型菌株 经突变后形成的带有新性状（基因型）的菌株，称突变株（mutant，或突变体、突变型） 突变株（mutant，或突变体、突变型） 。 突变株根据不同的突变，突变型的表型可能与亲本不同，也可能相同。故在微生物遗传学中常采用 基因型和表型概念，基因型（gene type）即指某一生物个体所含有的全部基因的总和，是 基因型（ type） 基因型 一种内在可能性或潜力。 而可以观察的性状称为表型 指生物体所具有的一切外表特征和内 表型， 表型 在特性的总和， 是一种现实存在， 是具一定基因型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。 基因型一般采用某一基因英文名称前三个英文小写字母和一个大写字母（均为斜体） ；相应 的表型则是第一个字母大写，均为正体。如：组氨酸的基因型表示为 hisC，其中的大写字 母 C 同一表型中不同基因的突变； 而表型的表示为 HisC。 在具体使用时多用 hisC 和 hisC+， 分别表示缺陷型 野生型 缺陷型和野生型 缺陷型 野生型。－二、基因突变的特点基因突变适用于整个生物界，无论哪种突变；即自发突变或诱发突变，形态突变或生化 突变等，都具有以下面几个特征。 （1）不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。即抗药性突变并非由于接 触了药物所引起， 抗噬菌体的突变也不是由于接触了噬菌体所引起。 突变在接触它们之前就 已自发地随机地产生了，噬菌体或药物只是起着选择作用。 （2）自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 （3）稀有性：突变率低且稳定，通常自发突变的几率在 10-6―10-9 间。所谓突变率是指每 一个细胞在每一世代中发生某一特定突变的机率， 也用每单位群体在繁殖一代过程中所形成 突变体的数目表示。 例如 10-9 的突变率即意味着 109 个细胞在分裂成 2×109 个细胞的过程中， 平均形成一个突变体。? （4）独立性：在徽生物群体中，基因突变是独立发生的，某一个基因的突变与另一个基因 的突变之间是互不相关的独立事件，基因的突变率不受它种基因突变率的影响。 （5）可诱发性：通过理化因子等诱变剂的诱变作用可提高自发突变的频率，但不改变突变 的本质。 （6）稳定性：基因突变后的新遗传性状是稳定的；基因突变的实质是遗传物质发生改变的 结果。因此突变型基因和野生型基因一样，具有相对稳定性的结构，也是可遗传的。 （7）可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation） 正向突变（ mutation） ， 正向突变 从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation 或 回复突变或回变（ 回复突变或回变 mutation） 。 mutation） reverse三、基因突变的表型特性 基因突变的表型特性 表型 （一）形态突变型(morphological mutant) 形态突变型(morphological是指突变造成细胞和菌落形态、 颜色以及影响噬菌体的噬菌斑形态改变的突变型。 这是 一类非选择性突变， 因为形态突变和非突变型均同样生长在平板上， 只能靠看得见的形态变 化进行筛选。例如细菌的鞭毛或荚膜有无、菌落表面的光滑和粗糙等。（二）生理生化突变体指突变的菌体原有特定的生化功能发生改变或丧失，但在形态上不一定有可见的变化， 通过生化方法可以检测到。 狭义的讲， 是那些因为蛋白质或酶的合成产生而使营养物质吸收、 代谢途径和发育途径等生理过程发生变化的突变体，如营养缺陷型等。 营养缺陷型是野生菌株发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、 碱基或氨基酸的 营养缺陷型 能力，在选择培养基( 或基本培养基)上不生长。它们可以在加有相应营养物质的基本培养 基 （或完全培养基） 平板上生长。 是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段， 由于这类突变型是一种负选择标记，需采用影印平板(Replica plating)的方法进行分离。营养 缺陷型的筛选方法如下(见图 6－21)： （1）将待分离突变株的原始菌株以合适的稀释度涂布到野生型菌株和突变株均能生长 的主平板(含完全培养基)上，经培养后形成单菌落； （2）通过一消毒的“印章”(直径略小于培养皿底，表面包有丝绒布，使其尽量平整，图 8-9b)将 a 平板的菌落分别原位转移(或印迹)到 c 平板(含有与 a 平板相同的营养成份)和 d 平 板(不含缺陷型所需的营养因子，即基本培养基)； （3）经培养后对照观察 c 和 d 平板上形成的单菌落，如果在 c 平板上长而在 d 平板上 不长的，则为所需分离的突变型； （4）在 d 平板上挑取 c 平板上不长的相应位置的单菌落，并进一步在完全培养基上划 线分离纯化。?（三）抗性突变型(resistant mutant) 抗性突变型(resistant指野生型菌株发生突变后对物理、化学和生物因素表现出抗性的突变体。如紫外、氨苄 青霉素和噬菌体等的抗性突变体。 由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的一种突变，普遍 存在于各类细菌中， 也是用来筛选重组子和进行其它遗传学研究的重要正选择标记。 这类突 变类型常用所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示，如：ampr 和 amps 分别表示对 氨苄青霉素素的抗性和敏感性(sensitivity)。在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。 抗性突变型的筛选：梯度平板法（gredient plate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效 方法，通过制备琼脂表面存在药物波度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经 培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤． 就可定向筛选到相应抗药性突变株、 在筛选坑代谢 药物的抗性菌株以取得相应代谢物的高产菌株方面， 此法能达到定向培育的效果。 具体方法 见图 6－22。图 6－21 印影法分离营养缺陷型图 6－22 梯度平板定向筛选抗性突变体（四）条件致死突变型(conditional lethal mutant) 条件致死突变型(conditional是指菌株经过突变后在某一条件下具有致死效应， 而在另一条件下没有致死效应的突变 型。常用的条件致死突变是温度敏感突变，用 ts(temperature ? sensitive)表示，如 E.coli 的 某些突变菌株在高温下(如 42℃)是致死的，但可以在 37℃正常生长。筛选 ts 突变型的方法 也是采用影印平板法，所不同的是图中的三个平板上培养基相同，均可生长。只是将 c 和 d 平板分别置正常生长温度(37℃)和高温(42℃)下培养，然后在 c 板上挑取相应于 d 平板上未 生长的菌落。（五）渗漏突变型是指某基因的突变未完全消除该基因的功能， 其表达水平很低， 不足以表现出野生型的 表型。四、基因突变机制 （一）基因突变的分子基础基因突变及其机制是多样性的，突变可以是自发的，但也可被某些诱变剂（mutagen） 诱变剂（mutagen） 诱变剂 诱发。 一些物理因素或化学试剂都能增加这种自发突变的频率。 而诱变剂处理所诱发的突变 称为诱发突变 induced mutation） 自然发生的突变是自发突变 spontaneous mutation） 诱发突变（ （ mutation） ， 自发突变（ mutation） 。 诱发突变 自发突变 （ 这两种突变之间并没有本质的区别。突变表型显示出 DNA 改变所产生的后果，这是由于蛋 白功能改变的结果。根据遗传物 DNA 变化情况进行分为三类，突变的类型见表 6－6： 表 6－6 突变的各种类型 转换 Py 与 Py，Pu 与 Pu 之间变换，多见 点突变 碱基置换 颠换 Py 与 Pu 之间变换，少见 突变的类型 移码突变 丢失 1-2 个碱基 缺失突变 1、碱基变化与遗传信息的改变 、 不同的碱基变化对遗传信息的改变是不同的。正常 DNA 双链中的某一碱基对转变成另 一碱基对的现象称为碱基置换(base substitution) 碱基置换(base substitution)。碱基置换又有两种情况：原来链上是 碱基置换 嘧啶（或嘌呤）碱基的位置上置换成另一嘧啶（或嘌呤）碱基（A→G 或 C→T）则称为转 转 ，若原来链上是嘧啶（或嘌呤）碱基的位置上置换成另一嘌呤（或嘧啶） 换（transition） transition） 碱基则（G→C 或 C→G）称为颠换(transversion) 颠换(transversion)。 颠换(transversion) 缺失大片段 DNA（十几到几千个碱基） 插入 1-2 个碱基 发生移码单个碱基替换的结果是改变了一个密码子， 可以引起蛋白质一级结构中某个氨基酸的替 代或造成多肽链的终止而产生不完全的肽链，如果起始密码子突变则就完全不能合成蛋白 质。根据它们对氨基酸序列的影响不同，可分为下列几种情迅。 碱基置换后会出现下列几种情况（图 6－23） ： 同义突变（沉默突变） ，碱基发生了置换，但由于遗传密码子的简并性，而并没有影响 原来的氨基酸顺序。如密码子 TAC 置换成 TAT 后，它们都是酪氨酸的密码子； 错义突变 使所表达的蛋白质中一种氨基酸的位置上， 变成另一种氨基酸； 有些错义突 变严重影响到蛋白质的活性，甚至使活性完全丧失．从而影响了基因的表型。 无义突变 正常翻译为氨基酸的碱基置换后变成 UAG（琥珀突变） 、UAA（赫石突变） 或 UGA（乳石突变）等终止密码子，造成多肽链合成的中止；图 6－23 碱基变化与遗传信息的改变 2、 移码突变 、 一对或少数几对邻接的核苷酸的插入或缺失，将造成这一位置以后一系列密码子发生 移位错误的现象称为移码突变(frame-shift mutation ) 移码突变(frame)。见图 6－24。 移码突变(frame 遗传密码的阅读是从一端开始，每三个碱基为一组连续的读下去，如缺失或增加一 个碱基对便会导致读码组的移动，这一 基因的翻译则会完全搅乱。移码突变有二种情 况：（1）如果增加或减少的核苷酸数目为 3 或 3 的倍数，那么，它只改变某一部位的一个 或几个氨基酸，其它氨基酸未变，有可能保持原有的蛋白质性质，这取决于这些氨基酸在蛋 白质中的重要性。 （2）如果增加或减少的核苷酸数目不是 3 或 3 的倍数，那么，这会改变整个蛋白质的 氨基酸顺序，其影响可能很大。 这里要指出是在编码蛋白的基因中发生―个碱基的增加或缺失称移码突变， 而上述情况 若发生在启动子区域，则不是移码突变，但能引起这一基因功能上明显的变化。图 6－24 插入 GC 对引起的移码突变 3、缺失和重复 、 大片段的缺失和重复是基因突变的主要原因之一。 基因座位中的缺失或插入与移码突变 只是程度不同， 基因突变中的缺失或插入涉及到的核苷酸数量比移码突变多， 很难用移码突 变 来 回 复 。 而 染 色 体 畸 变 中 的 染 色 体 缺 失 (deletion) 、 插 入 （ insertion ） 重 复 、 (duplication)、倒位(inversion)和易位(translocation)，也包括染色体数目的变化。大 (duplication) 倒位(inversion) 易位(translocation) 倒位(inversion) 易位(translocation) 段 DNA 的变化会造成染色体配对时，形成特定的电子显微镜下可见的结构改变。 4、回复突变 、 由突变型表型回复成野生型表型称为回复体 回复体有两种类型： 回复体。 一类为相同位点的回 回复体 复，即在原突变的位点上又发生了回复活性的突变(如果反向突变回复成野生型的序列，则 称为真正回复体)。另一类是第二位点的回复，即在 DNA 的其他位点发生了突变。 第二位点突变引起野生型表型的回复统称为抑制基因突变。 抑制基因突变是新的一类突 变补偿了原始突变的作用。已知的这类突变有：(1)在同一基因的其他某一位点上的突变回复了这个酶的功能，如移码突变；(2)另一基因的突变带来野生型的回复；(3)突变导致产生另一种酶，它可以通过其他代谢途径而取代突变的酶。最后一类，原始突变的酶并没有得 到回复。 5、突变的频率 、 各种类型突变发生的频率存在着很大的差异。有些突变的发生极其稀少几乎检测不出 来，而另外一些则经常发生，使人们要设法去维持其遗传稳定性。 每一世代中基因自发突变的频率约为 l0-6。 即在一百万个细胞中只有一个细胞在其一个 生活周期中某个基因发生了突变。转座发生的频率较高(约为 10-4)，无义突变发生的频率相 对较低(约 10-6―10-8)， 因为仅少数密码子可以突变成无义密码子。 除非这一突变可以选择出 来， 否则用一般的实验来检测如此稀有的突变是相当困难的， 因而为提高突变检出的效率则 利用了多种微生物遗传的技术。使用诱变剂处理后，突变的频率会明显的提高。 6、RNA 基因组的突变 、 一些具有 RNA 基因组的病毒也能突变。RNA 基因组的突变频率约比 DNA 基因组高 1000 倍。部分原因是 RNA 复制酶并不具备 DNA 聚合酶的校对活性。此外，细胞中存在着 多种修复系统， 使发生变化的 DNA 在成为突变型之前得到纠正， 但细胞中并无相应的 RNA 修复机制。（二）自发突变及其分子机制引起自发突变的原因很多，包括 DNA 复制过程中，由 DNA 聚合酶产生的错误，DNA 的物理损伤，重组和转座等。但是这些错误和损伤将会被细胞内大量的修复系统修复，使突 变率降到最低限度。 DNA 分子内部的运动引起自发突变有两个原因：碱基的互变效应和胞嘧啶的自然脱氨 基作用。 碱基能以称之为互变异构体(taumer)的不同形式存在（见图 6－25） ，互变异构体能够形 成不同的碱基配对，因此在 DNA 复制时，当腺嘌呤以正常的氨基形式出现时，便与胸腺嘌 呤进行正确配对(A-T)；如果以亚氨基(imino)形式(互变异构)出现时，则与胞嘧啶配对，这意 味着 C 代替 T 插入到 DNA 分子中，如果在下一轮复制之前未被修复，那么 DNA 分子中的 A-T 碱基对就变成了 G-C(见图 6－26)。 同样，胸腺嘧啶也可因为由酮式到烯醇式的异构作用而将碱基配对由原来的 A-T 变成 了 G-T，即鸟嘌呤取代了腺嘌呤，经复制后便导致 AT→GT 的转换。 在 DNA 复制时碱基偶尔会从核苷酸移出而留下一个称之为脱嘌呤(apurinic)或脱嘧啶 脱嘌呤(apurinic) 脱嘌呤(apurinic)或脱嘧啶(apyrimidinic)的缺口，该缺口在下一轮复制时不能进行正常的碱基配对，其原因被认为 (apyrimidinic) 是胞嘧啶的自然脱氨基(deamination)而形成了尿嘧啶所致，因为尿嘧啶不是 DNA 的正常碱 基而将被 DNA 修复系统识别而被除去，结果留下一个脱嘧啶位点；胞嘧啶甲基化后发生脱 氨产生胸腺嘧啶，在后继复制中，造成 G.C→A.T 的突变。 最后，自发突变还有一个很重要的原因就是由能够随机插入基因组的转座因子引起的。 而且如果在基因组上存在二个或多个拷贝， 则会发生同源重组， 进而导致缺失， 重复和倒位。图 6－25 碱基的互变异构体及其错配图 6－26 DNA 碱基的互变异构体引起的突变（三）诱发突变及其分子机制诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群， 促进其突变率大幅度 提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供 生产实践或科学研究用。 当前发酵工业和其他生产单位所使用的高产菌株， 几乎都是通过诱变育种而大大提高了 生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外，还