荧光素酶构建报告载体基因组文库与cDNA文库均需要什么酶

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cDNA文库和基因组文库比较
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cDNA是指以mRNA为模板,在逆转录酶的作用下形成的互补DNA。以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体成为cDNA。
基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段,并与合适的载体重组后导入宿主细胞,进行克隆得到的所有重组体内的基因组DNA片段的集合,它包含了该生物的所有基因。
基因组文库与cDNA文库的差别:
基因组文库中包含了所有的基因,而cDNA文库只包含表达的基因,缺乏内元和调节序列,因此在研究基因结构时没有多大用处。
cDNA文库代表了mRNA的来源,其中一些特定的转录本丰富而另一些很少,所以存在丰度的差别;而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列。
从不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列,可用于分离差别表达的基因;基因组文库中不能。
基因组文库由于含有不表达序列,因此比cDNA文库大。
mRNA在不同的组织之间存在丰度的差异,因此cDNA文库的在构建时对于mRNA含量较少的就比较困难;而基因组文库不存在这样的问题。
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&【求助】构建DNA文库及cDNA文库中的一些问题
【求助】构建DNA文库及cDNA文库中的一些问题
作者 lct515
请教各位大虾:我在看基因工程原理时,对构建DNA文库及cDNA文库中的几个概念很不理解,请各位大侠帮我解答一下:
1. DNA文库和cDNA文库存在形式是重组菌或噬菌体吗?那分离目的基因时是不是需要将全部重组菌进行裂解,提取其中DNA片段再分离啊?
2. 什么叫随机片段化法或DNA的局部消化法,为什么通过此方法能得到长度适中的、含有染色体基因组DNA全部序列的DNA片段?
3. 构建cDNA文库时,合成cDNA后,不用像构建DNA文库时一样酶切消化成合适大小片段就直接连接载体吗?
一般构建cDNA文库指的是真核生物的,方法是先提取RNA,再反转录成为cDNA;
&&而细菌等这些原核生物只需要构建DNA文库,先提取你研究的菌的总DNA,再用酶切(一般用sau 3a1酶),连在酶切并去磷酸化质粒载体上,然后回收目的片段,再提取质粒并转化大肠杆菌.
还是疑惑啊!
从DNA和cDNA文库中筛选目的基因不用将所有菌裂解.你在构建好文库后,要把含有你目的片段的质粒送去测序.测序完成后你可以分析这些序列,与已经发表的序列比对,就知道你建的这个生物的文库中是否含有某个基因.
在将cDNA的目的片段与载体连接之前,要去处400bp以下的片段,一般不需要将片段酶切.但为了提到连接效率,可以把不同长度的cDNA分别与载体连接,分别转化宿主菌,在鉴定出阳性克隆后,将所有的阳性克隆宿主菌混合,即为你最终的cDNA文库.
1. DNA文库和cDNA文库存在形式是重组菌或噬菌体吗?那分离目的基因时是不是需要将全部重组菌进行裂解,提取其中DNA片段再分离啊?
2. 什么叫随机片段化法或DNA的局部消化法,为什么通过此方法能得到长度适中的、含有染色体基因组DNA全部序列的DNA片段?
3. 构建cDNA文库时,合成cDNA后,不用像构建DNA文库时一样酶切消化成合适大小片段就直接连接载体吗?
第一个问题:答案是肯定的,一般就是重组菌或噬菌体,分离目的基因时,毕竟我们不知道目的基因在哪个菌体里,最好的方法就是将所有的菌目的基因测序,然后选择你所需要的。
第二个问题随机当然就是随机性的片断化,之所以为什么会得到片断适中的,我认为这里存在数学概率问题
第三个问题
我们得到cDNA——是针对每个mRNA 反转录得的,当然要整体的,不要片断化拉
我是这么认为的,有错指出拉,
经过这两天的学习,基本解除了我对上面这些问题的疑惑。也非常感谢楼上几位大侠的回答!
& & 我想,分离含目的基因的重组菌或噬菌体颗粒,可以通过核酸探针杂交技术、差别杂交技术、扣除杂交技术、表达文库等技术进行目的基因的分离。如楼上所说将所有的菌目的基因测序,应该是不太现实的。
第一个问题:同意楼上的说法,筛选探针应用菌落原位杂交等方法分离含目的基因的克隆。
第二个问题:构建DNA文库,先提取总DNA,再用酶切(一般用sau 3a1酶),然后对酶切片段根据载体中装载量电泳进行分级分离,连在酶切并去磷酸化载体上。转化大肠杆菌,筛选阳性克隆。
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基因文库的构建
大学研究生|
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