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亚慢性砷暴露对小鼠脑组织RXR表达的影响【毕业论文】
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亚慢性砷暴露对小鼠脑组织RXR表达的影响【毕业论文】
关注微信公众号...drops小海马等dr产品,免代购费王晓雯++邓海燕++王健++徐颖摘要：目的觀察调心方对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病（AD）小鼠空间学习记忆能力和海马突触传递长时程增强（LTP）的影响，探讨其作用机制。方法将54
...dro&#112;s 小海马等dr产品,免代购费王晓雯++邓海燕++王健++徐颖摘要：目的 觀察调心方对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病（AD）小鼠空间学习记忆能力和海马突触传递长时程增强（LTP）的影响，探讨其作用机制。方法 将54只3月龄APP/PS1双转基因AD小鼠随机分为模型组、调心方组和阳性药组，以同月龄同性别18只C57BL/6J野生小鼠作为正常组，各给药组给予相应药物灌胃。给药12周后，进行Morris水迷宫行为学检测和离体电生理记录。结果 Morris水迷宫测试结果显示，定位航行实验与模型组比较，调心方组逃避潜伏期时间明显缩短（P<0.01）；空间探索实验与模型组比较，调心方组小鼠穿越原平台所在象限次数和在原平台所在象限停留时间明显增加（P<0.05，P<0.01）。在离体海马电生理诱导中，与模型组比较，调心方组海马兴奋性突触后电位斜率明显增强（P0.05）。结论 调心方可有效改善APP/PS1双转基因AD小鼠空间学习记忆能力和神经突触可塑性，具有认知保护作用。关键词：调心方；Morris水迷宫；海马突触传递长时程增强；阿尔茨海默病；学习记忆能力；小鼠DOI：10.3969/j.issn.17.10.010中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：（0-04Effects of Tiaoxin Formula on Spatial Learning and Memory Ability and LTP in Hippocampus of APP/PS1 Double Transgenic Mice with Alzheimer Disease WANG Xiao-wen， DENG Hai-yan， WANG Jian， XU Ying （Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）Abstract： Objective To investigate the effects of Tiaoxin Formula on spatial learning and memory ability and long-term potentation （LTP） in the hippocampus of APP/PS1 transgenic mice with Alzheimer disease； To discuss its mechanism of action. Methods Totally 54 three-month-old APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into model control group， Tiaoxin Formula group and positive control group， with 18 mice in each group. Another 18 three-month-old C57BL/6J wild mice were chosen as normal control group. All administration groups receive relevant medicine. 12 weeks later， Morris water maze test was used to test behavior and in vitro electrophysiology record. Results The Morris water maze test showed that in place navigation test， compared with the model control group， escape latency time in Tiaoxin Formula group was significantly reduced （P<0.01）. In the space experiments， compared with the model control group， the number of crossing the platform quadrant and the time staying at the platform quadrant in Tiaoxin Formula group were significantly increased （P<0.05， P<0.01）. In vitro hippocampal electrophysiological induction， compared with the model control group， fEPSP slope in the hippocampus in Tiaoxin Formula group were significantly increased （P0.05）. Conclusion Tiaoxin Formula can improve the spatial learning and memory ability and LTP of APP/PS1 transgenic mice with Alzheimer disease， thus can realize cognitive protection effects.Key words： Tiaoxin Formula； Morris water maze； LTP in hippocampus； Alzheimer disease； learning and memory ability； miceendprint阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是常见基金项目：上海市自然科学基金（13ZR1439700）通訊作者：王健，E-mail：；徐颖，E-mail：于老年人群的一种不可逆转的中枢神经退行性疾病，是老年痴呆最常见的类型。AD早期症状主要有渐进性记忆的减退、认知功能下降等，后期常出现抑郁、焦虑、幻觉等异常精神症状，导致患者生活能力下降及社会参与度降低。AD属中医学“呆证”“癫证”“郁证”等范畴，临床上，调心方对轻度AD患者疗效较好，能有效改善轻中度AD患者的认知功能[1]。本实验通过Morris水迷宫和海马突触传递长时程增强（long-term potentation，LTP）指标的变化，观察调心方对APP/PS1双转基因AD小鼠学习记忆能力的影响。1 实验材料1.1 动物APP/PS1双转基因AD雄性小鼠54只，3月龄，体质量（25.22±1.71）g；C57BL/6J野生雄性小鼠18只，3月龄，体质量（30.49±1.59）g，南京大学模式动物研究所，品系编号D000268。饲养于上海中医药大学SPF级实验动物中心。1.2 药物调心方（党参2.25 g，桂枝0.42 g，石菖蒲0.83 g，远志0.38 g，龙骨0.5 g，甘草0.83 g，白芍0.5 g），配方颗粒为江阴天江药业有限公司生产，使用前用蒸馏水充分溶解、混匀；盐酸多奈哌齐片，5 mg/片，江苏豪森药业股份有限公司，批号，使用前粉碎，用蒸馏水溶解。1.3 主要试剂和仪器2.5%戊二醛、4%多聚甲醛、20%水合氯醛、人工脑脊液（ACSF），上海青阳生物科技有限公司；Morris视频分析和跟踪系统（Netherlands），冰冻切片机（Thermo scientific）。2 实验方法2.1 分组和给药54只实验小鼠随机分为模型组、调心方组和阳性药组，每组18只，同时以同月龄同性别18只C57BL/6J野生小鼠为正常组。调心方组给予1.485 g/kg调心方灌胃，阳性药组给予0.083 mg/kg盐酸多奈哌齐灌胃，正常组和模型组予等量生理盐水灌胃。给药体积为10 mL/kg，每日1次，连续12周。12周后各组小鼠进行Morris水迷宫行为学检测和离体海马电生理诱导。灌胃过程中死亡13只，其中模型组6只、调心方组3只、阳性药组2只、正常组2只，余全部进行水迷宫行为学测试，每日均保持饮食正常。2.2 Morris水迷宫行为学检测Morris水迷宫包括定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验：持续5 d，记录每只小鼠60 s内找到平台时间。第2象限中放入一个低于水面1 cm的平台，小鼠面向池壁从2个落水点（第3、4象限）以半随机的方式放入水池中，小鼠找到平台并在平台上保持5 s后终止，记录为逃避潜伏期，未在60 s内找到平台的，记录为60 s。对未在60 s内找到平台的小鼠，用小木棒引导小鼠找到平台，并让小鼠在平台上待30 s。小鼠从水中取出后，用毛巾将其擦干，以防小鼠受凉，影响实验结果。休息10 min后，进行另一个象限的训练。每日1次，每次2个象限。空间探索实验：定位实验结束后开始，为期1 d。记录每只小鼠60 s内第1次到达原平台所在象限的时间和穿越原平台所在象限的次数。空间探索实验开始时，将原平台撤掉，其余保持不变。每组小鼠从同一个入水点放入池中。休息10 min，再做另一个象限。2.3 离体海马突触传递长时程增强电生理记录2.3.1 脑片制备 行为学测试结束后，各组随机选取5只小鼠进行实验，20%水合氯醛麻醉后快速断头，切开头皮去除颅骨和硬脑膜，迅速取出全脑置于用95%O2和5%CO2混合气饱和冰浴的ACSF中。切取一正方形的琼脂块固定于托盘上。分离左右脑半球后，置于另一预备好的氧饱和冰温ACSF烧杯中。用脑膜剥离器分离出海马组织。用胶水将海马脑组织块固定于琼脂块。用振动切片机横向切取400 μm脑片，将脑片放在孵育槽中温室（34 ℃）30 min，然后放在室温（25±1）℃中2～8 h，其中不断充以混合气，保证ACSF混处于氧饱和状态。2.3.2 离体海马突触传递长时程增强诱导 用巴斯德吸管将脑片移入记录槽中心，置于显微镜下，以3 mL/min的速度持续灌流氧饱和ACSF，镜下确定海马CA1区。刺激电极是一个双极电极，用突触700 B作为刺激器，ACSF充满玻璃吸管，电阻1～5 MΩ。将刺激电极放在shaffer纤维，记录电极放在CA1区的辐射层。测试刺激包括单相100-μs恒电流脉冲，刺激电极每隔30 s给1个刺激（频率0.033 Hz，波宽100-μs。通过测量兴奋性突触后电位（fEPSP）斜率来决定突触传递强度。每给1个刺激记录1个fEPSP，刺激强度由小到大，观察记录fEPSP幅值。此时选用fEPSP最大值的25%剌激强度为实验用刺激强度，记录30 min fEPSP作为基线。然后予高频串刺激（HFS，各50个脉冲刺激，100 Hz，间隔10 s，2串100 Hz）诱导LTP，高频时刺激强度与基线记录时相同，在强直刺激后0～60 min的平均值决定了LTP的水平。3 统计学方法采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，Morris水迷宫逃避潜伏期采用多组重复测量设计资料的方差分析。空间探索实验和海马fEPSP斜率和双脉冲（PPF）比值变化数据采用方差分析，组间比较采用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。4 结果endprint4.1 调心方对APP/PS1双转基因小鼠空间学习记忆能力的影响Morris水迷宫测试结果：定位航行实验模型组小鼠逃避潜伏期時间较正常组明显延长（P<0.01），与模型组比较，调心方组和阳性药组小鼠逃避潜伏期时间明显缩短（P<0.01），见表1。在空间探索实验中，从第3象限入水点的模型组小鼠穿越原平台所在象限的次数和在原平台所在象限停留的时间较正常组明显减少（P<0.01），与模型组比较，调心方组和阳性药组小鼠穿越原平台所在象限的次数和在原平台所在象限停留的时间明显增加（P<0.05，P<0.01），见表2。在空间探索实验游泳轨迹图中，第2象限黑点为原平台所在位置。与正常组比较，模型组小鼠绕着池壁打转，且经过原平台所在象限的次数减少；与模型组比较，调心方组小鼠绕着池心来回游动，与原平台所在的位置更近，且经过原平台所在象限的次数明显增加，见图1。4.2 调心方对APP/PS1双转基因小鼠海马突触传递长时程增强的影响用离体海马脑片诱导分别记录各组海马CA1区锥体细胞层LTP的改变。前30 min基本刺激条件下，其基础fEPSP曲线保持稳定。各组高频强直刺激后，LTP诱发成功并持续记录60 min，在50～60 min LTP斜率趋于稳定。在后10 min内模型组fEPSP曲线增强幅度明显低于正常组，调心方组fEPSP曲线增强幅度明显高于模型组。与正常组比较，模型组小鼠fEPSP斜率明显减少（P<0.01）；与模型组比较，调心方组和阳性药组小鼠fEPSP斜率显著增强（P1为双脉冲易化。在刺激间隔50、100、200、250 ms时，各组小鼠PPR均无明显差异（P>0.05），说明各组小鼠PPF易化无明显差异。刺激间隔250 ms时，模型组小鼠PPR与正常组比较无明显差异（P>0.05），调心方组小鼠PPR与模型组比较无明显差异（P>0.05），见表4。5 讨论认知功能包括对外在刺激的接受能力、学习与记忆能力、信息反馈处理能力、表达能力及各种心理活动。AD患者认知功能障碍最明显的表现是记忆力减退，早期主要为近记忆减退，逐渐出现远记忆障碍。《素问·灵兰秘典论篇》有“心者，君主之官也，神明出焉”。中医学认为，心为五脏六腑之大主，心气不足，气不生神。AD患者神情呆滞、表情淡漠、反应迟钝、少言懒动等是心气不足、痰滞瘀阻而致神明失司、机窍不利，故用调心方调心益气、振奋心阳、化痰开窍。调心方由党参、桂枝、石菖蒲、远志等组成，党参补元气，桂枝通血脉，石菖蒲安神，远志豁痰。Morris水迷宫是评估动物模型学习记忆能力的一种重要且公认的方法[2]。有研究报道，Morris水迷宫行为学测试显示，3月龄APP/PS1双转基因AD小鼠空间搜索实验结果与同月龄正常小鼠有差异[3]。本研究Morris水迷宫实验结果显示，模型组与正常组比较，其逃避潜伏期时间延长、穿越原平台次数减少及在原平台停留时间缩短，与文献结果一致。通过调心方治疗后，APP/PS1双转基因小鼠定位航行实验逃避潜伏期时间明显缩短、穿越原平台所在象限次数增加及在原平台所在象限停留时间增加。表明训练后学习记忆能力明显提高，进一步证实调心方能效改善APP/PS1双转基因AD小鼠的认知能力。神经突触是中枢神经系统学习和记忆的基础。LTP一直被认为是学习与记忆的神经基础之一，是研究学习记忆的理想电生理模型[4]。而海马是神经系统参与学习记忆的重要脑区，大量树突棘缺失现象发生在尸检后AD患者脑内和各种转基因AD小鼠脑内[5-6]。LTP受抑制的原因是由于大量树突棘的缺失，导致突触之间的信息传递受到阻碍，学习记忆能力下降。研究发现，LTP得到改善后，其认知和记忆功能均得到恢复[7-8]。在离体脑片实验中，各组小鼠在HFS前30 min内给予刺激时未影响基础fEPSP，但当给予HFS后，模型组海马fEPSP斜率明显受到抑制。调心方组APP/PS1双转基因AD小鼠海马fEPSP斜率明显增加，表明经调心方治疗能提高APP/PS1双转基因小鼠LTP水平，改善其突触可塑性，小鼠学习和记忆的功能得到改善。实验测试PPF的目的是用PPF改变来观察突触前神经递质释放的改变，释放的神经递质活性高，学习记忆能力也会提高。本研究结果显示，模型组小鼠fEPSP斜率明显降低，调心方组小鼠fEPSP斜率明显升高，进一步证实调心方能有效改善APP/PS1双转基因AD小鼠的LTP水平。模型组小鼠PPR与正常组比较无明显差异，提示APP/PS1双转基因AD小鼠海马LTP的损伤与突触前神经递质释放无关。Morris水迷宫和海马LTP记录都是研究动物学习记忆能力的经典手段，有研究发现二者的实验研究结果有很好的一致性[9]。本实验通过Morris水迷宫行为学结合离体场电位记录，发现同一动物空间学习记忆能力的改变与突触可塑性变化的结果基本一致，表明其学习记忆能力损害程度与LTP抑制程度可能是一致的。在本研究结果中，调心方治疗后，小鼠在定位航行实验中逃避潜伏期时间明显缩短；在空间探索实验中，穿越原平台位置次数及在原平台位置停留时间增加，从行为学角度表明调心方可有效改善APP/PS1双转基因AD小鼠的认知能力。通过调心方治疗后，小鼠海马fEPSP斜率升高，从电生理的角度阐明了调心方可改善APP/PS1双转基因AD小鼠的认知能力。参考文献：[1] 俞璐，林水淼，周如倩，等.中医辨证治疗轻中度阿尔茨海默病的随机对照试验[J].中西医结合学报，）：766-776.[2] CHARLES V， MICHAEL T. Morris water maze：procedures for accessing spatial and related forms of learning and memory[J]. J Neurol， ：.endprint[3] 宗园媛，王晓映，王海林，等.APP/PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析[J].中国比较医学杂志，）：8-12.[4] KORTE M， HERRMANH U， ZHANG X， et al. The role of APP and APLP for synaptic transmission， plasticity and network function：lessons from genetic mouse models[J]. Exp Brain Res，（3/4）：435-440.[5] TAKASHIMA S， IESHIMA A. Dementia and the down syndrome[J]. Brain Develop，1-133.[6] MOOLMAN D L， VITOLO O V. Dendrite and dendritic spine alterations in Alzheimer models[J]. J Neurocytol，7-387.[7] GONG B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory[J]. Cell， ：775-788.[8] DONNA L， SMIT H. Reversal of long-term dendritic spine alteration in Alzheimer disease models[J]. PNAS，877-16882.[9] SCHMID A W， LYNCH M A， HERRON C E. The effects of IL-1 receptor antagonist on beta amyloid mediated depression of LTP in the rat CA1 in vivo[J]. Hippocampus，）：670-676.（收稿日期：）（修回日期：；編辑：华强）endprint
马云中国人很早就明白，要做成事什么东西才是第一位的。论语才11000多字，但影响并治理了中国2000多年。中国把仁、义、礼、智、信这些道理都想明白了，想彻底了，才有了后面2000年的辉煌，政治、文化、艺术、经济，
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SICHUANJOURN^JLOFANATOMYVOL 14 NQ 1 2006
小鼠睾丸支持细胞的体外分离和纯化9(-
周燕，吴绍华一 ，余鸿，胡红梅
(泸州医学院组胚教研室 泸州 646000)
【摘要】 目的 寻求简便经济的方法分离纯化小鼠睾丸支持细胞，提高其获取量。方法 用0．1 的胶原酶和
0．25％的胰蛋 白酶次第消化准备 7--8天小鼠生殖细胞悬液，置于37℃，5 ()2孵箱内培养，4小时后换液，24小时
后向培养板内加入 20mmolTris-HC1低渗处理 3分钟，去除精原细胞，即得到高纯度的支持细胞。结果 在小鼠睾
丸支持细胞的分离培养中，支持细胞占培养细胞9O 以上。结论 应用本实验方法分离小 鼠睾丸支持细胞获得成功
并简化了国内现行的分离方法。
【关键词】 小鼠；支持细胞；分离；纯化
【中图分类号1 R321．1
【文献标识码】 A
SeparationandPurificationofTestisSertoliCellsinM ouse
ZHOUYah，WU Shao-Hua，yU Hong，HUHong-Mei
(DepartmentofHistologyandEmbryology，LuzhouMedicalCollege646000)
[Abstract] 0bjective Tosearchforasimpleandeconomicalmethodtoseparateandpurifymouse
testissertolicellssoastoincreasethequantityofsertolicells．Methods 0．1 collagenaseand
0．25 typsinwassequentiallyusedtopreparegerm cellsuspensionofmouseat7—8days．CellSUS—
pensionswereincubatedat37℃ in5 C02．After4hoursreplenishedtheculturemedium andafter
24hoursadded20mmolTris—HClintoculturewellsfor3minutes。almostallthespermatogonia
wereremovedandhighpuritysertolicellswereobtained．Results Theisolationandculturecells
containedgraeterthan90
sertolicells．Conclusion Theapplicationofthismethodusedinthe
presentexperimenthasbeensuccessfulingettingmousetestissertolicellsandsimplifieddomestic
currentmethods．
[KeyWords] mouse；sertolicell；separation；purification
睾丸支持细胞 (sertolicel1)是生精上皮中唯一的
供)。主要试剂有DMEM(GIBCO)，小牛血清 (成都
非生殖细胞，在生精过程中扮演重要角色。随着对支
哈里生物公司)、IV型胶原酶(Sigma)，胰蛋 白酶(Sig—
持细胞研究的深入 ，其强大的内分泌功能引起了越来
越多的关注。研究表明支持细胞能分泌多种免疫保
1．2 单细胞悬液的制备 取 7—8天的雄性 昆明种
护因子、生长因子和营养因子 ¨，故而在干细胞的研
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3秒自动关闭窗口脑损伤课外开放性实验总结
创伤性脑损伤（traumatic brain
injury，TBI）严重危害人类健康在神经外科中占重要位置，其发病率高、病情变化快、致残率和死亡率高。分类有如下几种颅脑损伤类型，如脑组织暴露在空气中为开放伤，与外界不沟通的脑损伤为闭合伤，由火器
造成的损伤为火器伤，常在颅内残留弹片等异物；伤及头皮和颅骨为颅损伤；伤及脑组织、脑血管和颅神经为脑损伤，外物直接打击头部，产生原发性脑损伤。由低血压、低氧或高碳酸血症等造成脑缺氧、脑水肿或脑温升高，产生继发性脑损伤，根据gcs评分法，14－15分为轻度伤，9－13为中度伤，3－8为重度伤等。研究其生物力学致伤机制制备相应的脑损伤模型并进行行为评价,有利于提高对创伤性脑损伤的认识和防治水平,脑损伤模型现对应不用致病机理已有:自由落体模型、冷冻性脑损伤模型、液压性脑损伤模型以及缺血缺氧脑损伤等模型.
由于实验条件及技术有限,我们课题小组采用的是实在采用改良的Feeney氏法自由落体撞击来创伤性脑外伤模型(手机拍的相素太低，这是由我们实验楼的一个厕所同学们自己改建的，虽不大，但是我们锻炼动手能力的乐园）
&下面是简要的一些实验准备与计划：
& （1）实验药品和器材准备：
药品：1~1.5％戊巴比妥钠，生理盐水，75％乙醇
仪器设备：常规手术器械、BA-200小鼠避暗仪、DT-200跳台自动测试仪、ZZ-6小鼠自主活动测试仪（学习仪器设备的操作使用）
（2）实验步骤：
&#9312; 小鼠脑损伤模型的制作：
实验采用改良的Feeney氏法自由落体撞击来制作创伤性脑外伤模型。用1~1.5％戊巴比妥钠(50mg/kg)行小鼠腹腔注射麻醉。麻醉完全后，将大鼠俯卧位固定于动物实验台，常规消毒铺巾，头正中切开皮肤，分离骨膜，暴露左侧顶骨，于矢状缝旁2.5
mm，冠状缝后1.5 mm钻一骨孔，咬除颅骨直至骨窗扩大为5.0 mm&5.0
mm，显露硬脑膜，在硬脑膜上放置一与骨孔大小吻合的垫片，以40g重的铁质圆柱体自25
cm高自由落体撞击垫片，造成左侧大脑半球脑挫裂伤。
&#9313; 行为学检查：
A．使用Longa等的5级评分标准
0级：无体征
1级：动物不能完全伸直其右前肢
2级：动物右侧肢体瘫痪，出现追尾现象
3级：动物不能站立/打滚
4级：无自发性活动，有意识障碍
（参考文献：Longa EZ．Weinstein PR，Carlson S．et a1．Reversible middle
cerebral artery occlusion without craniectomy in
rats．Stroke，～91．）
B．自主活动测试
C．学习与记忆能力测定。
避暗、跳台测试
通过整个实验，知道了简单的手术操作方法，但在实验过程中，也发现了不少问题，主要是集中在手术阶段和行为评价阶段，手术阶段是实验仪器在操作过程中发现，首先是在进行钻骨孔的过程中，无专业钻孔器械，采用的是单纯的解剖刀钻孔，容易事先就已经对小鼠的硬脑膜造成损伤；其次是重锤实施打击时，容易出现反弹，造成二次损伤，影响结果的准确性；再次是由于实验采取的动物模型是小鼠，小鼠头部较小，不利于打击定位；最后是在行为评价时，进行小鼠跳台实验时，事先放入的小鼠容易从跳台上跑下来，又需要实验者重新抓取，费时，现在我已经想出了一个解决办法，但尚在改进之中．．．．．．．
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