X射线荧光光谱仪测试时对样品是否有要求_百度知道
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如何鉴定为陨石
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厦门大学生物化学实验讲义
生物化学实验厦门大学环境与生态学院 2016.2目录实验室守则 ................................................................................................................................ 1 实验记录及实验报告 ................................................................................................................ 2 实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 实验十一 实验十二 实验十三 实验十四 实验十五 实验十六 实验十七 实验十八 实验十九 实验二十 实验二十一 实验二十二 实验二十三 实验二十四 淀粉的提取和水解.................................................................................................... 4 总糖与还原糖的测定................................................................................................ 6 粗纤维的测定 ............................................................................................................ 9 酪蛋白的制备 .......................................................................................................... 12 粗脂肪的定量测定─索氏提取法 ........................................................................... 14 蛋白质等电点测定.................................................................................................. 16 氨基酸的分离鉴定－纸层析法.............................................................................. 18 蛋白质含量的测定.................................................................................................. 21 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳.................................................................................. 34 影响酶活性的因素.................................................................................................. 41 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定 ......................................................... 45 凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶.......................................................................... 51 DEAE-纤维素柱层析纯化碱性磷酸酶 ............................................................. 51 底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定） ............................................. 56 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白 ..................................................... 61 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 ..................................... 69 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量 ......................................... 74 维生素 C 的定量测定 ......................................................................................... 79 猪脾 DNA 的制备 ............................................................................................... 84 DNA 的定量测定 ................................................................................................ 87 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 ................................................................................ 89 RNA 的定量测定 ............................................................................................ 92 肌糖原的酵解作用.......................................................................................... 94 茶叶多糖的提纯与鉴定.................................................................................. 97仪器的使用 .............................................................................................................................. 99 附录 ........................................................................................................................................ 101i实 验 室 守 则1、遵守课堂纪律，认真进行实验 每个学员应该自觉地遵守课堂纪律，维护课堂秩序，保持室内安静，不大声谈笑。实验过程中 要听从教师指导，严格认真地按操作规程进行实验。并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验 记录本上，完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室、实验后要认真写好实验报告，由课代表 按期收交给教师，不无故拖延。 2、保持整洁 保持环境和仪器的整齐清洁是做好实验的重要条件，也是每个实验者必须养成的良好的工作习 惯。实验台面和试剂药品架上都必须保持整洁，仪器药品放置要有次序，不要把试剂、药品洒在实 验台面和地上，废液应倒进水槽内（强酸强碱必须都应倒入废品缸内，不可倒入水槽或随地乱扔。 实验完毕需将仪器洗净收好，药品试剂排列整齐。注意保持实验台面干净及实验室整齐清洁。 3、药品使用 使用药品试剂必须注意节约杜绝浪费，要特别注意保持药品和试剂的纯净，药品用后须立即将 瓶盖塞紧放回原处，从瓶中取出的试剂，标准溶液等，如未用尽切勿倒回瓶内，避免混杂。 4、仪器使用 各种仪器用具均应注意爱护，细心使用，防止损坏，使用电子天平，分光光度计和离心机等贵 重精密仪器，要严格遵守操作规程，发现故障立即报告教师，不要自己动手检修，要爱护国家财产， 厉行节约。 5、注意安全 为了有效地维护实验室安全，保证实验正常进行，要求： 1）要严格做到：火着人在，人走火灭； 2）勿使乙醚、丙酮、醇类等易燃液体接近火焰，蒸发或加热此类液体时，必须在水浴上进行， 切勿用直火加热； 3）凡比水轻且不与水相混溶之物（如醚、苯、汽油等）着火时，应迅速用湿毛巾覆盖火焰，以 隔绝空气使其熄灭，绝不能倒水于其上，以免火焰蔓延，对于易与水混溶之物（如乙醇、丙酮等） 着火时，可用火扑灭之； 4）有不少药品是有毒或有腐蚀性的不可用手直接拿药品，不可将试剂瓶直接对准鼻子闻，更不 可尝药品味道。用移液管吸取有毒试剂，强酸和强碱时，均应用洗耳球，严禁用口吸取； 5）离开实验室时，要关好水龙头，拉下电闸，认真负责地进行检查，严防不安全事故； 6）每次实验课由班长安排同学轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性 工作。1实验记录及实验报告一、实验记录 实验课前应认真预习，将实验名称、目的和要求、原理、实验内容、操作方法和步骤等简单扼 要地写在预习报告中。 实验中观察到的现象、结果和数据，应该及时地直接记在预习报告中，绝对不可以用单片纸做 记录或草稿。实验记录不要抹擦及涂改，写错时可以准确地划去重写，记录时必须使用钢笔或圆珠 笔。原始记录必须准确、简炼、详尽、清楚，从实验课开始就应养成这种良好的习惯。 记录时，应做到正确记录实验结果，切忌夹杂主观因素，这是十分重要的。在实验条件下观察 到的现象，应如实仔细地记录下来；在定量实验中观测的数据，如称量物的重量，滴定管的读数， 分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有 效数字。例如，光密度值为 0.050，不应写成 0.05。实验记录上的每一个数字，都是反映每一次的测 量结果，所以，重复观测时即使数据完全相同也应如实记录下来。总之，实验的每个结果都应正确 无遗漏地做好记录。 实验中使用仪器的类型、 编号以及试剂的规格、 化学式、 分子量准确的浓度等， 都应记录清楚， 以便总结实验进行校对和作为查找成败原因的参考依据。 如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，在获得老师允许后，应当重做实验。因为，将不 可靠的结果当做正确的记录，在实际工作中可能造成难以估计的损失，所以，在学习期间就应一丝 不苟，努力培养严谨的科学作风。二、实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告．按照实验内容可分为定性和定量实 验两大类，下面分别列举这两类实验报告的格式，仅供参考。 l、关于定性实验报告 实验（编号） （实验名称） （一）目的和要求 （二）原理 （三）试剂和仪器 （四）操作方法 （五）结果与讨论 一般每次实验课做数个定性实验，实验报告中的实验名称和目的要求应该是针对这次实验课 的全部内容而必须达到的目的和要求。在写实验报告时，可以按照实验内容分别写原理、操作方法、 结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法（或步骤）可以采用工艺流程图的方式或自行 设计的表格来表示 （某些实验的操作方法可以和结果与讨论部分合并， 自行设计各种表格综合书写） 。2结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题（和思考题）进行探讨以及对实 验的改进意见等。 2、关于定量实验报告 实验（编号） （实验名称） （一）目的和要求 （二）原理 （三）试剂和仪器 （四）操作方法 （五）结果处理 （六）讨论 通常每次实验课只做一个定量实验，在实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简 单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂及仪器）和操作的关键环节必须写清楚，对于实验结果部 分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比， 并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图（以及比较实验组与对照组实验 结果的图表）等。 （另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析） 。讨论部分可以包括：关于实 验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象（以及思考题）进行 探讨，对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。3实验一 淀粉的提取和水解一、目的要求掌握淀粉提取和水解的原理及操作方法。二、 原理 多糖是自然界分布最广的糖类，由多个单糖分子缩合而成，具有多种生物学功能，如植物纤维 素可构成植物的骨架，而淀粉、糖原则作为营养的存储形式。本实验以地瓜为原料，利用多糖能和 水形成胶体溶液的原理，采用过滤、离心等方法提取淀粉。 糖苷键对酸和酶敏感，所以淀粉在酸和体内淀粉酶的作用下被降解成单糖，这种降解过程是逐 步进行的，降解的中间产物遇碘曾现不同的颜色： 淀粉 → 红色糊精→ 无色糊精 → 麦芽糖 → 葡萄糖 （紫蓝色） （红色） （无色） 所以根据水解液和碘反应的颜色，可以判断水解是否已完全。本实验中采用酸水解的方法，用 过量的酸保证水解完全。三、试剂与器材 试剂： 6 mol/L 盐酸、6 mol/L 氢氧化钠 器材：高速组织捣碎机、恒温水浴锅、电磁炉四、操作方法 （1）淀粉的提取 甘薯去皮切成小块（约 0.3×0.3×0.3cm3） ，准确称取 15g，加入 60mL 蒸馏水，放入组织捣碎 机中捣碎 1min（以上步骤可以 4 组合作） 。匀浆液用三层纱布过滤，滤渣用少量水洗，滤液合并后 置 50oC 恒温水浴中保温 30min。 轻轻地尽量倾去上层有色溶液， 用 25 mL 蒸馏水重新悬浮白色沉淀， 待重新沉淀后再倾去上层溶液，滤纸过滤或用离心机离心（3000 r/m，10 min） ，再用少量水洗沉淀， 3000 r/m 离心 10 min，连滤纸移至培养皿中置烘箱内烘干（105℃烘干 4h）后称重。 （2）淀粉的水解 称取淀粉 1.0 g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入 15 mL 水和 6 mol/L 盐酸 10 mL，搅 拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用 6 mol/L 氢氧化钠中和至溶液呈中性，然后定容至 100 mL，再取 10 mL 定容到 100 mL 成为稀释 1000 倍的总糖水解液。五、注意事项 （1） 淀粉提取时水浴温度不能超过 50℃，否则会因淀粉溶解度增大而减少产量；4（2） 倾出上清时要尽可能小心，避免沉降的淀粉被震动起来。 （3） 离心机使用时要注意先进行离心管的平衡。六、思考题 （1）如何选择生化物质实验中的实验材料？有何标准？ （2）材料的破碎方法有哪些？5实验二一、目的要求总糖与还原糖的测定掌握碱性铜试剂法测定还原糖的原理和操作方法。二、原理 单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原 性糖。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。 还原糖的测定方法多种，本实验采用间接滴定法。其原理是：在碱性溶液中，二价铜离子被还 原糖还原成一价的氧化亚铜，氧化亚铜在酸性环境中与一定量的过量碘起反应， 再用标准硫代硫酸 钠滴定剩余的碘，即可算出还原糖的含量。反应方程式是：三、试剂与器材 1. 试剂 （1） 铜试剂：6（A）13 g 硫酸铜加水至 1000 mL (B) ①24 g 酒石酸钾钠（用以保持铜离子碱性液中不生成 Cu(OH)2 沉淀） ； ②40 g 无水碳酸钠 ③50 g 碳酸氢钠 ④36 g 草酸钾（用以抑制铜离子的还原） ⑤1.6 g 碘酸钾（用以从碘化钾溶液中释放出一定量的自由碘） 制备溶液 B 时，先用 500 mL 热水溶化①、②、③，再加④、⑤，然后加水至 1000 mL，最后将 （A） 、 （B）等量混合。 （2） 0.005 mol/L 硫代硫酸钠：1.24 g 硫代硫酸钠和 0.1 g 碳酸钠加水配成 1000 mL。 （3） 1%淀粉：1 g 可溶性淀粉溶于 100 mL 饱和的 NaCl 溶液中煮沸。 （4） 2%碘化钾：20 g KI 用水溶至 1000 mL。 （5） 2 mol/L 硫酸：166.6 mL 母液溶于水至 1500 mL。 （6） 0.5 mg/mL 标准葡萄糖：0.5 g 葡萄糖加水至 1000 mL。 用以保持一定的碱性环境环境2. 器材 碱式滴定管、电磁炉四、操作步骤 （1）样品中总糖的水解： 称取淀粉 1.0 g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入 15 mL 水和 6 mol/L 盐酸 10 mL，搅拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用 6 mol/L 氢氧化钠中和至溶液呈 中性，然后定容至 100 mL，再取 10 mL 定容到 100 mL 成为稀释 1000 倍的总糖水解液。 （2）取 6 只试管，按照下表的次序加入试剂。另取 6 个小三角烧瓶，按相应的试管顺序编号。 试剂 管号 空 白 试 验 标 准 试 验 总 糖 试验 1 2 1 2 1 2 H2O (mL) 2 2 1 1 1 1 2 2 标准葡萄糖 （mL） 总糖水解液 （mL） 铜试剂 （mL） 4 4 4 4 4 4沸 水 浴 中 煮 沸 15 分 钟（3）各试管冷却后，摇动试管，使试管底部的红色沉淀分散后倾入相应的三角瓶中；7（4）分别在每个试管中加入 2 mL 2％碘化钾溶液和 2 mL 2 mol/L H2SO4，以洗涤管中的残留物，并 转入相应的三角瓶中，最后再用蒸馏水洗涤试管 2 次，每次 1mL，洗涤液均转入相同的三角瓶中； （5）用 0.005 mol/L NaS2O3 滴定至碘颜色接近消失时加入淀粉指示剂 5 滴，继续滴定至蓝色消失为 止。五、计算 按照如下公式计算还原糖的含量： （V 空－V 标）/0.5 mg＝（V 空－V 未知）/ X（X 为样品中还原糖的含量）X?0.5 ? （V空 - V未知） V空 - V标六、注意事项 （1）各试管的处理应一致，测定溶液应同时放入沸水中，再同时从沸水浴中取出。 （2）在用碘化钾和硫酸洗涤试管时要洗净，否则会影响滴定结果的准确性。 （3）滴定终点时碘与淀粉反应形成的紫蓝色褪尽，溶液呈现二价铜离子的浅天蓝色，不要误以为终 点未到。七、思考题 (1) 碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优点？8实验三粗纤维的测定一、目的要求 学习和掌握粗纤维的定量测定方法。二、原理 粗纤维是指不能被稀酸、稀碱所溶解，不能被人体或家畜所消化利用的天然有机物质。其主要 成分为纤维素、残存的半纤维素和木质素。本法是在热的稀酸处理下，样品中的淀粉，果胶质和部 分纤维素被水解出去后，再用热的氢氧化钠处理，溶解除去蛋白质、部分半纤维素和部分木质素， 并使脂肪皂化而去除。然后用乙醇或乙醚处理除去单宁、色素、残余脂肪、蜡、部分蛋白质和戊糖， 所得的残渣，扣除灰分（金属氧化物） ，即为粗纤维。三、试剂与器材 1. 试剂：1.25% 硫酸、1.25％氢氧化钠、正辛醇、95％乙醇 2. 器材：干燥箱、粗纤维测定仪四、操作方法 1. 操作前的准备 (1) 将仪器放置于工作台上， 工作台就近应有水池和水嘴。 将三个烧瓶放置于仪器顶部的电加热板上， 并将顶部小孔中伸出的写明酸、碱、蒸馏水的橡胶管套在相应的烧瓶底部的水嘴上。三个烧瓶的位 置从左至右相应为酸、碱、蒸馏水。然后将进出水嘴（位于机箱左下侧）分别套上橡胶管，5 个水 嘴分别为：靠前的两个为进水嘴，靠后的上面两个为出水嘴，靠后的下面一个为抽滤出水嘴，应用 橡胶管引入水池。 (2) 将样品用粉碎机粉碎，全部通过 18 目筛后，放入密闭容器。 (3) 样品中若脂肪含量大于 10％，则必须脱脂，脂肪含量若小于 10％可不脱脂。 (4) 将坩锅用蒸馏水洗尽，使其不带任何杂质，并将其置于恒温箱内（温度在 100oC 左右）烘 30 分 钟左右然后移入干燥器内冷却至室温，并将其编号，再置于干燥器内备用。 (5) 将电源线一头插入仪器右下侧的电源插座中，另一头插入交流 220V 的电源插座中，实验室的电 源插座必须用三脚插座，且必须有可靠接地。 (6) 在仪器顶部的酸、碱、蒸馏水烧瓶中分别加入已配制好的酸、碱、蒸馏水，应基本加满。将瓶盖 盖上。 (7) 在坩锅内放入 l-2 g 试样，并将装好试样的坩锅分别放入 6 个抽滤座中，注意应放置于抽滤座中 央的硅橡胶圈上，并使其与上面的消煮管下套中的硅橡胶口对齐，不要将坩锅放偏或放斜，否则将9会漏液，当六个坩锅均放置准确后稍压下操纵杆柄并锁紧。 (8) 打开进水开关。将面板上预热调压旋钮和消煮调压旋钮逆时针旋到底，打开电源开关，调整定时 器的设定时间为 30 min，以后使用时可不必调节。 (9) 开启酸、碱、蒸馏水预热开关，调节预热调压旋钮，将其调到顺时针最大，这时左边电压表显示 电压为 220V 左右。 (10) 等酸、碱、蒸馏水沸腾时，将预热电压调小至酸、碱、蒸馏水微沸。 (11) 打开加酸开关，分别按 l-6 号加液按钮在消煮管中加入已沸的酸液 200 mL 约到消煮管中间刻度 线，再在每个消煮管内加 2 mL 正辛醇。关闭酸预热开关，开启消煮加热开关将消煮调压旋钮调至最 大，此时右边电压表显示约 220 V 左右，待消煮管内酸液再次沸腾后再将电压调至 150-170 V 左右， 使酸液保持微沸，向上打开消煮定时开关，保持酸微沸 30 min。 (12) 将消煮加热开关关闭，将消煮定时开关向下关闭，将消煮调压旋钮逆时针旋到底，打开 l-6 号 抽滤开关，打开抽滤泵开关，将酸液抽掉。抽完酸液后，先关闭抽滤泵开关，再关闭抽滤开关。打 开蒸馏水开关，再按下 l-6 号加液按钮，在消煮管中加入蒸馏水后再抽干，连续 2-3 次，直至用试纸 测试显中性后关闭加蒸馏水开关。在抽滤过程中若发现坩锅堵塞时，可关闭抽滤泵，开启反冲泵用 气流反冲，直至出现气泡后关闭反冲泵，打开抽滤泵继续抽滤。洗涤完毕后关闭所有抽滤开关及泵 开关。 (13) 打开加碱开关，分别在消煮管中加入微沸的碱溶液 200 mL 后关闭加碱开关，再在每个消煮管 中加入 2 滴正辛醇后重复第 11 后半部分和第 12 步的操作，进行碱消煮、抽滤和洗涤。 (14) 以上工作完成以后， 用吸管分别在消煮管上口加入 25 mL 左右 95％乙醇， 浸泡十几秒钟后抽干。 (15) 将操纵杆手柄稍用力下压后拉出定位装置，使升降架缓慢上升复位，戴上手套后将坩锅取出， 移入恒温箱，在 130oC 下烘干 2 小时，取出后在干燥器中冷却至室温，称重后得到试样质量 m。 (16) 将称重后的坩锅再放入 500oC 的高温炉内灼烧 1 小时，取出后置于于燥器中冷却至室温后称重 后得到 m。 测定结果按下式计算：粗纤维 % ?m1 - m 2 % m式中：m1――100oC 烘于后坩锅及试样残渣重； m2――500oC 灼烧后坩锅及试样残渣重； m――试样（未脱脂）质量。10蒸馏水烧瓶图1粗纤维测定仪五、注意事项 (1) 样品粒度的大小将影响分析结果，通常将样品研磨成粒度为 1mm3 左右为宜。 (2) 样品脂肪含量大于 10%，应先脱脂，脱脂不足，则分析结果偏高。六、思考题 (1) 在本测定中哪些因素是影响测定结果的主要因素？ (2) 在测定中为什么必须严格控制实验条件? (3) 用本方法测定的结果为什么称为D粗纤维‖？11实验四 酪蛋白的制备一、目的要求 1、掌握从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 2、了解等电点沉淀在蛋白质制备中的应用。二、原理 牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成份。蛋白质中的酪蛋白通过等电点沉淀，再通过离心而获得， 糖类小分子由于处于清液中而分离，沉淀物中所含的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白 色、晶状酪蛋白。三、试剂与器材 材料：牛奶（奶粉配制，3％） 试剂：0.2 mol/L HAc-NaAc 缓冲液、95%乙醇、乙醚 器材：离心机、水浴锅、pH 计四、操作方法 1. 取 10 mL40°C 牛奶预热，加入 40°C 预热的醋酸缓冲液 10 mL 左右，边加边搅拌，调 pH 至 4.7，室温冷却，5000 r/min 离心 5min，得到沉淀。 2. 沉淀于离心管内加入 4 mL H2O 悬浮，5000 r/min 离心 5min，得到沉淀。 3. 沉淀于离心管内加入 20 mL 乙醇，放置 5min，微搅动，去脂肪。 4. 漏斗过滤(或 5000 r/min 离心 5min)上述悬浮液，在漏斗中加入 20 mL 乙醇悬浮沉淀，滤干(或 5000r/min 离心 5min)。 5. 加入 20 mL 乙醇乙醚混合液（1:1）洗涤，漏斗过滤(或 5000 r/min 离心 5min)，后再加入 20mL 乙醚洗涤脂肪完毕，漏斗过滤。 6. 于 60°C，带滤纸烘干 4h，称重并计算得率。五、计算 实际获得百分率＝ 酪蛋白质量（g） 10 mL 牛奶 六、注意事项 1、牛奶与缓冲液要预热。 2、缓冲液要缓加缓搅。 × 100％123、在滤纸上样品的脱脂过程要搅动，不得破损滤纸。 4、实验环境要保持空气流通，门窗要开。 七、思考题 (1)在酪蛋白制备时为什么要用醋酸缓冲液调 pH 到 4.8？ (2)乙醚、乙醇作用是什么？13实验五一、目的要求粗脂肪的定量测定─索氏提取法学习和掌握粗脂肪的定量测定法─索氏提取法二、原理 脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物，能溶于脂溶性有机溶剂。 本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸 发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为 30? C -60 ? C 的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷酸、固醇、芳香 油及某些色素等，故称为D粗脂肪‖。三、材料、试剂与器材 材料：全脂奶粉 试剂：乙醚 器材：粗脂肪测定仪、干燥箱四、操作方法 1. 操作前准备：抽提筒用蒸馏水洗净，置干燥箱在 105 ℃温度下烘 1 小时，取出移入干燥缸内，冷 却后称重编号备用。 2. 样品准备：样品磨碎，称取约 1.0g 在 105 ℃温度下烘 30 分钟，趁热倒入研钵中，加入约 2g 脱 脂细砂一同研磨。 将试样和细砂研到出油状后， 全部置入滤纸筒内 （筒底塞一层脱脂棉， 并在 105 ℃ 温度下烘 30 分钟） ，用脱脂棉蘸少量乙醚揩净研体上的试样和脂肪，并入滤纸筒内，最后再用脱脂 棉塞入上部，压住试样。 3. 移动滑动球，把滤纸筒置入抽提筒内，使磁钢把过滤筒吸住，并观察滤纸筒是否在抽提筒上口对 准下压紧圈的园柱孔，两者平面保持良好接触。 4．在抽提筒内注入无水乙醚约 50ml，然后将抽提筒移置加热板上，调节位置使抽提筒上口对准下 压紧圈的圆柱孔，两者平面保持良好接触。 5. 开启电源，根据所需加热温度调节电加热旋钮到 60 ℃，显示屏上直接显示加热温度值。移动滑 动球（上滑）使试样置入抽提筒内（此时）滤纸筒底与抽提筒底接触，做到不使滤纸筒脱落，使试 样完全浸入溶剂内浸泡） 。 6. 从溶剂挥发开始浸泡约 0.5 h， 然后将纸筒升高 5 cm 进行抽提， 约 1 h 后再将滤纸筒提升 1cm （最 高位置） ，同时将冷凝管调旋塞完全关闭（即旋塞于柄位置与水平面平行） ，进行溶剂回收。 7. 将抽提筒从加热板上取出，置入恒温箱内，烘去水份，然后移入干燥缸内冷却后称重，计算含油14量。 8. 使用完毕关闭电源，并保持机内干净。五、结果处理 根据下表将实验结果分别填入并计算样品的粗脂肪百分含量： 样品重量（g） 抽提桶重（g） 抽提桶及脂肪重（g） 脂肪重（g） 粗脂肪含量（％）六、注意事项 乙醚为易燃有机溶剂，实验室应保持通风并禁止任何明火。 七、思考题 （1）本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？ （2）本实验样品制备时烘干为什么要避免过热?15实验六 蛋白质等电点测定一、目的 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。二、原理 蛋白质的分子量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符号的电 荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的 pH 值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳 离子，在碱性溶液中成阴离子。蛋白质分子所带净电荷为零时的 pH 值称为蛋白质的等电点（pI） 。 在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向 增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的 溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明 显。各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是 4.7~4.8，血红 蛋白等电点为 6.7~6.8， 胰岛素是 5.3~5.4， 鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白， 其等电点在 pH 12.0~12.4。 近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。本实验采用蛋 白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的 pH 值即为该种蛋白质的等电点值， 这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。三、器材及试剂 1．器材： 试管、吸管、移液管、量筒、500mL 容量瓶、试管架 2．试剂： （1）0.01 mol/L 醋酸溶液 （2）0.1 mol/L 醋酸溶液 （3）1 mol/L 醋酸溶液 （4）1 mol/L 氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定） （5）酪蛋白四、操作步骤 1．制备蛋白质胶液 （1）称取酪蛋白 3 克，放在烧杯中，加入 50 mL 40℃的蒸馏水。 （2）加入 50 毫升 1 mol/L 氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。 （3）在烧杯中再加入 1 mol/L 醋酸溶液 50 mL，摇匀，使蛋白质完全溶解为止。16（4）将溶解好的蛋白溶液转移到 500 mL 容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。 加入蒸馏水定容至 500 mL，得到略现浑浊的、在 0.1 mol/L NaAC 溶液中的酪蛋白胶体。 2．等电点测定 2．等电点测定 按下表顺序准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，混匀后，在各管中加入蛋白质胶液并立 即摇匀。 0.01 mol/L HAC (mL) 0.62 1.25 － － － － － － － 0.1 mol/L HAC （mL） － － 0.25 0.50 1.00 2.00 4.00 － － 1 mol/L HAC （mL） － － － － － － － 0.80 1.60 5.8 5.5 5.2 4.9 4.6 4.3 4.0 3.7 3.4 pH 蛋白质 胶液 (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 分钟 观 10 分钟 察 20 分钟管 号H2O (mL)1 2 3 4 5 6 7 8 94.38 3.75 4.75 4.50 4.00 3.00 1.00 4.20 3.40观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。五、思考题 （1）在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。 （2）在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？17实验七一、目的氨基酸的分离鉴定－纸层析法通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理 层析法又称色谱法。1903 年，科学家发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜 色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法 （Chromatography） 。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。 层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一 种，但也并存着吸附和离子交换作用。 分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用 α 表示分配系数。 α=?CS ? 溶质在固定相的浓度 ?CL ? 溶质在流动相的浓度一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的 OH 基具有亲水性，因此能吸附一 层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而 上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配 而得到分离。 纸层析的实际操作是在滤纸的一端 （通常距纸边缘 2 厘米） ， 点上样品， 干后， 在密闭的容器内， 待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中 的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层 析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶剂系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转 90° ，再用另一个 溶剂系统展层。 物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用 Rf 表示。 Rf=原点到层析点中心的距 离 原点到溶剂前沿的距离若 X 表示原点到层析点中心的距离。X+Y 表示原点到溶剂前沿的距离，则 R f=X X ?YfR f 值的主要决定因素是分配系数（α） 。对于某一物质在一定条件下的 α 值是固定的。因此 R18值为其特征常数。 现将影响 R f 值的因素概括如下： 1、物质结构的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶剂（有机 溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基 酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此 R f 低于后者。 ―CH2―基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则―CH2―基增加，整个分子的极性就 降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf 值亦随之增加，例如氨基酸的 R f 值：甘氨酸＜丙氨酸 ＜亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸＜谷氨酸。 极性基团的位置不同也会引起 Rf 变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，α-丙氨酸的 R f 值 大于 β-丙氨酸。 2、溶剂的影响：同一物质在不同溶剂中 R f 值不同，选择溶剂系统时应使被分离物质在适当 Rf 值范围内（0.005 到 0.85 之间） ，并且不同物质的 R f 至少差别为 0.05 才能彼此分开。 溶剂的极性大小也影响物质的 Rf 值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的 Rf 值随着溶 剂碳原子数目增加而降低。 3、pH 的影响：溶剂系统的 pH 会影响物质极性基团的解离形式，如对于酸性氨基酸，在酸性 时所带净电荷比碱性时少，带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中 Rf 值较碱大。而碱性氨基酸 则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。 溶剂的 pH 还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于极性物质 如氨基酸来说 Rf 值增加，非极性物质则减少。若 pH 不适合，使同种物质有不同解离形式，其 Rf 也 略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸（或箱） 中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。 4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中含有 Ca 、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸（0.01 mol/L-1 或 0.4 mol/L-1HCl）洗涤滤纸将之除去。 5、温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水 合作用。温度变化对 Rf 值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过± 0.5℃。 除上述因素影响 Rf 值外，样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。 无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚三酮或 吲哚醌作显色剂。 茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上 述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外 空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。 铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的2+19显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。三、器材及试剂 1．器材 层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、电吹风、层析滤纸（新华一号） 2．试剂 (1) 展开剂：溶剂系统（24 mL） ： 正丁醇－乙酸－水（4：1：3，V/V) (2) 氨基酸溶液：0.5%的脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸溶液及它们的混合液（各组份 浓度均为 0.5%） 。 (3) 显色剂：0.1%水合茚三酮乙醇溶液。0.5%四、操作步骤 1．将配好的层析液倒入培养皿中，把培养皿放入层析缸中，盖紧缸盖，放置 30 分钟。 2．取层析滤纸（长 18－20 厘米，宽 14 厘米）一张。在垂直于纸的纹路一端距边缘 1.5 厘米处用铅 笔划一条直线，在此直线上每间隔 2 厘米作一记号，作为点样位置（共 6 点） ，并用铅笔在点样点下 端写出所点氨基酸的名称。 3．点样：用毛细管吸取样品约 2cm 高，将各氨基酸样品分别点在这六个位置上，用电吹风吹干后 再点一次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大不超过 5 毫米。 4．扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩 展剂的液面需低于点样线 1 厘米。当前沿线到达层析纸 2/3-3/4 处时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前 沿界线，用电吹风热风吹干。 5．显色：用喷雾器均匀喷上 0. 1%茚三酮溶液，然后用热风吹干即可显出各层析斑点。 6．用铅笔画出层析斑点并算出 Rf 值。 五、注意事项 1. 为了防止滤纸被手上的汗液污染，在操作时带手套。 2. 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸。六、思考题 （1）如何用纸层析法对氨基酸进行定性和定量的测定？ （2）纸层析和柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？ （3）请对试验中所用的几种氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。20实验八目的要求 1. 学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2. 掌握测定蛋白质浓度的操作技术蛋白质含量的测定（一）微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量一、原理 天然有机物 (如蛋白质和氨基酸等化合物 ) 的总氮量通常用微量凯氏定氮法 ( Micro - Kjeldahl Method )来测定。 当被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为消 化。由于消化过程进行缓慢，实验中常添加硫酸钾和硫酸铜的混合物来促进，硫酸铜是催化剂，硫 酸钾可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱 消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴 定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含 氮量。 上述过程的化学反应如下： (1) 消化 有机氮化物(C、H、O、N、P、S)+浓 H2SO4→CO2+H2O+NH3↑+SO2+H3PO4 NH3+H2SO4→(NH4)2SO4 (2) 蒸馏 (NH4)2SO4+NaOH→Na2SO4+H2O+NH3↑ (3) 吸收 NH3+H3BO3→NH4HB4O7+H2O (4) 滴定 NH4HB4O7+HCl→NH4Cl+H3BO3 在微量凯氏定氮法中，常用硼酸-指示剂混合液收集氨，氨与溶液中氢离子结合生成铵离子，使 溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离 子浓度，即指示剂变回原来颜色为止。所用无机酸的摩尔数即相当于样品中氨的摩尔数。本法适用 范围约为 0.2-1 mg 氨。 因为蛋白质含氮量通常在 16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数 6.25，便得到该 样品的蛋白质含量。21二、试剂和器材 1. 试剂 (1) 浓硫酸（AR） ， (2) 粉末硫酸钾-硫酸铜混合物：K2SO4∶CuSO4? 5H2O=3∶1、6∶1 或 10∶1， (3) 40%（W/V)氢氧化钠溶液， (4) 4%（W/V)硼酸溶液， (5) 0.01 mol/L 标准盐酸（用硼砂标定)： 吸取分析纯盐酸（比重 1.19，约 12 mol/L)8.5 mL，用蒸馏 水稀释至 1 L， 贮于试剂瓶中待标定。 准确称取 3 份干燥的硼砂， 每份 0.381-0.383 g 分别放在 150 mL 三角瓶中，加入 20 mL 蒸馏水使其溶解，加入三滴甲基红指示剂（0.1 g 甲基红溶于 250 mL 水中） ， 用待测的盐酸滴定至橙红色为止，记下盐酸的滴定体积，通过计算即可知道盐酸的准确浓度： CHCl=W ? 1000 M r ?V式中，W 为硼砂称量（g)；V 为 HCl 的滴定体积（mL)；Mr 为硼砂分子量。 (6) 混合指示剂贮备液：取 50 mL 0.1%甲烯蓝乙醇溶液与 200 mL 0.1%甲基红乙醇溶液混合而成， 贮于棕色瓶中备用。此指示剂在 pH 5.2 为紫红色；pH 5.4 为暗蓝色（或灰色） ；pH 5.6 为绿色。变色 范围很窄，变色点 pH 为 5.4，故混合指示剂很灵敏。 (7) 标准硫酸铵溶液（0.3 mg 氮/ mL)：取 141.6 mg 分析纯硫酸铵，加水溶解，定容至 100 mL。 2. 待测样品：豆浆(市售) 3. 器材 (1) 微量凯氏定氮仪， (2) 50 mL 凯氏烧瓶，100 mL 锥型瓶，50 mL 酸式滴定管，100 mL 量筒，100 mL 容量瓶，100 mL 烧杯，酒精灯三、操作方法 3.1 样品的消化 在凯氏烧瓶中加入催化剂约 50 mg，用移液管依次加入 3 mL 均一的豆浆和 3 mL 浓硫酸（移液 管要接近凯氏烧瓶底部，不使样品粘附在瓶口或瓶颈） 。另取一支凯氏烧瓶加入 3 mL 水代替豆浆， 其余试剂同上，此为空白。 将凯氏烧瓶放在通风柜内的电炉上加热，火力不要太猛，应以使液体保持微沸状态为宜。瓶内 液体逐渐由黄色变为黑色，继而转为淡黄色，最后成清澈淡蓝色溶液，消化即告完全，取出烧瓶， 冷却，将瓶内液体转移至 50 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。 3.2 仪器的装置和蒸洗 按图 2 装好凯氏定氮仪，再用蒸气进行蒸洗，以除去 NH3 和其它干扰物质。蒸洗方法如下： 接通冷凝水，打开夹子（J） ，往蒸馏瓶（B）内加入占球部 1/3 体积的清水，而后取 5 mL 蒸馏22水从小漏斗（A）缓慢地注入反应瓶（F） ，关上夹子（I） ，同时加热蒸馏瓶（B） ，蒸馏反应瓶内的 蒸馏水， 使其沸腾产生蒸气。 产生的气体沿导管上升到冷凝管 （C） ， 气体经过冷却从冷凝管末端 （G） 流入收集瓶。排出反应瓶（F）中的液体，重复蒸洗 2?3 次，以便较熟练掌握蒸洗的方法。 （反应瓶 （F）中的液体排出的方法：样品蒸馏完毕后，继续加热使其沸腾，移开酒精灯，关上夹子（I） ，稍 等片刻，由于蒸馏瓶（B）中的蒸气较反应瓶（F）中的多，所以冷却后蒸馏瓶（B）中的压力比反 应瓶（F）的低，反应瓶（F）内的废液迅速地从出样口（H）抽出到反应瓶外，随即自加样小漏斗 （A）往反应瓶（F）中较快地倒入一些冷蒸馏水，关上夹子（I） ，稍等片刻，反应瓶（F）内的液体 又迅速地从出样口（H）抽出，然后打开夹子（K）排出蒸馏瓶中的热水，关上夹子（K） ，打开夹子 （J） ，往蒸馏瓶（B）中加入 1/3 球部体积的清水，即可进行下一次蒸馏） 。仪器的安装和蒸洗过程 中，应很好地掌握几个夹子的开关关系，避免漏气是实验成败的关键步骤。图 2 微量凯氏定氮仪装置图 A．小漏斗 B．蒸馏瓶 C．冷凝管 D．入水口 E．出水口 F．反应瓶 G．冷凝管末端 H．出样口 I、J、K. 夹子3.3 标准硫酸铵的测定 (1) 吸取 10 mL 4%硼酸溶液注入三角烧瓶，加入 2 滴指示剂，将其倾斜地放在冷凝管末端（G）下， 使管末端插入溶液内。 (2) 用移液管准确吸取 5 mL 标准硫酸铵溶液置于小漏斗（A） ，小心打开夹子（I） ，使其缓慢流入反 应瓶（H） ，用 1?2 mL 蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶（H） 。 (3) 量取 5 mL 40% NaOH 溶液，置小漏斗（A） ，小心打开夹子，使其缓慢流入反应瓶（H） ，同样用231?2 mL 蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶（H） ，关上夹子（I） ，避免蒸馏过程中氨散失。 (4) 加热蒸馏瓶（B）使反应瓶内液体开始沸腾，立即收集氨，当三角瓶中溶液由紫红色变成鲜绿色 开始记时，蒸馏 5 min 后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约 1 cm，继续收集 2-3 min，最后用蒸馏水 把末端剩余的氨全部洗到三角瓶中，即算蒸馏完毕。排出废液，量取 5 mL 蒸馏水蒸洗反应瓶一次， 就可以进行第二份标准硫酸铵溶液的蒸馏工作。 (5) 将收集的各瓶蒸馏液分别用 0.0100 mol/L 标准盐酸溶液滴定至蓝色消失，使溶液呈淡桔红色为 止。 用标准硫酸铵溶液连续测定三次，三次测定的终点颜色应一致，滴定数据差值不超过?0.05 mL。 3.4 样品及空白的测定 将 3.1 操作所得的消化液在定氮仪上进行含氮量测定，方法与标准硫酸铵溶液测定相同，并进 行空白测定。 3.5 结果处理 样品含氮量(mg/mL)=(A ? B) ? C ? 14 ? N V(A ? B) ? C ? 14 ? 6.25 ? N V若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则 样品中的蛋白质含量(mg/mL)=式中：A 为滴定样品用去的盐酸平均毫升数，B 为滴定空白用去的盐酸平均毫升数，V 为样品 的毫升数，C 为盐酸的准确摩尔浓度，14 为氮的原子量，6.25 为系数，N 为样品的稀释倍数。 按上面公式计算每毫升标准硫酸铵溶液的含氮量 （ mg/mL ）和每毫升豆浆中蛋白质含量 （mg/mL） 。四、 注意事项 (1) 如果测定的样品不是纯蛋白，测定的总氮量中很可能包含非蛋白氮，若要进行比较准确的测定， 就必须分别测定样品中的蛋白氮和非蛋白氮。后者的测定是将样品制成匀浆或抽提液，用三氯醋酸 或氢氧化铜等蛋白质沉淀剂将蛋白质沉淀，然后按测总氮的方法分析上清液，便得到非蛋白氮。把 总氮量减去非蛋白氮量即得蛋白氮量。将蛋白氮量乘以 6.25 便是蛋白质的含量。 (2) 为保证所有硫酸铵都能转化为氨，需要使溶液呈强碱性，所以要加足量的 40%NaOH 溶液。加入 时应缓慢进行，以免产生剧烈反应导致接受瓶内硼酸溶液的倒吸和氨的损失。碱液加入后，有铜氨 离子、氢氧化铜或氧化铜等化合物生成，溶液呈蓝色或褐色，并有胶状沉淀产生，这是正常现象。 反之，如果颜色不变，说明碱液可能不够。 (3) 蒸馏时要避免火力不稳，否则会发生样品被倒吸到蒸馏瓶的现象。 (4) 在进行下一次蒸馏时，要先将蒸馏瓶中的热水放掉，加入冷水，否则也会发生样品被倒吸到蒸馏 瓶的现象。24五、思考题 (1) 写出以下各步的化学反应式 a. 蛋白质的消化；b. 氨的蒸馏；c. 氨的吸收；d. 氨的滴定。 (2) 测定标准硫酸铵和空白的目的是什么？ (3) 消化时加硫酸钾C硫酸铜混合物的作用是什么？（二）双缩脲法测定蛋白质浓度一、实验原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与 Cu2+形 成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用来测定蛋白质的浓度。在一定条件下，未 知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于 540 nm 下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求 出未知样品的蛋白质浓度。本法测定蛋白质范围 1-10 mg。 H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3 双缩脲 关于分光光度法测定物质含量的原理介绍如下： 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。因为分光光度法极 为灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分的系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物 质，因此分光光度法目前已成为生物化学研究中广泛使用的方法之一。 当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射或分 散，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液。 入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光 如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射，分散等因素造成的入射 光的损失，则 入射光=吸收光+透过光 I0 为经过空白校正后入射光的强度；I 为透过光的强度。 根据实验得知 I=I0?10-εcL 式中，c 表示吸收物质的摩尔浓度；L 表示吸收物质的光径，用 cm 表示；ε 表示吸收物质的摩尔消 光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物质的ε 数值不同。 所以I =10-εcL I025令 ∴T（透射比）=I I ，则 T%= ×100 I0 I0T=10― εcL由上式可得 lg lg1 = εcL T1 为物质的消光值（E）或吸光度（A） 。 T∴ A= εcL 若以 A 对物质的浓度作图，则得一直线。 上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比，这就是 Beer―Lambert 定律。二、试剂与器材 试剂：双缩脲试剂：溶解 1.50 g CuSO4?5H2O 和 6.0 g NaKC4H4O6?4H2O 于 500ml 水中，在搅 拌下加入 300 ml 10% NaOH 溶解，用水稀释到 1 升，贮存在冰箱中，备用。 2 mg/mL 牛血清白蛋白 器材：722 型分光光度计、水浴锅三、操作步骤 1.取 15 支试管，按下表编号、加试剂试管编号 牛血清白蛋白(mg) 2mg/mL 牛血清白蛋白体积(mL) 待测液体积(mL) 蒸馏水(mL) OD5400 0 0 － 3.01 0.6 0.3 － 2.72 1.2 0.6 － 2.43 2.4 1.2 － 1.84 3.6 1.8 － 1.25 4.8 2.4 － 0.66 6.0 3.0 － 0样品－3.0*02.各管混匀后，加入双缩脲试剂 3.0 mL，37 oC 反应 30 min。 3.以 0 号管调零，测定各管 540nm 光吸收值。四、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540 为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的 OD540 从标准曲线上查得样品的蛋白质含量 （mg） ， 再根据样品的体积计算出样品的浓度。26五、注意事项 1.须于显色后 30 min 内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。（三）Folin―酚试剂法（Lowry 法）测定蛋白质浓度一、原理 蛋白质含有两个以上的肽键(－CO－NH－)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与 Cu2+形成 络合物。Folin 酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进 Folin 试剂（磷钼酸－磷钨酸试剂） ，蛋白质－ 铜络合物能还原磷钼酸－磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正 比例。 本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏 10－20 倍，较双缩脲法灵敏 100 倍，反 应约在 15 min 内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。对双缩 脲反应发生干扰的基团，如－CO－NH2、－CH2－NH2、－CS－NH2，在性质上是氨基酸或肽的缓冲 剂，如 Tris 缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化合物等均可干扰 Folin-酚反应。此外，所测的蛋白质 样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。在测试时应排除干扰因素或做空白实验消 除。 浓度较低的尿素 （约 0.5%左右） 、 胍 （0.5%左右） 、 硫酸钠 （1%） 、 硝酸钠 （1%） 、 三氯乙酸 （0.5%） 、 乙醇（5%） 、乙醚（5%） 、丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需 做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠－氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显 色后色浅，则必须将碳酸钠－氢氧化钠溶液的浓度提高 1-2 倍。 Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。Folin-乙试剂仅在酸性 pH 下稳定，但上述还原反应只在 pH10 的情况下发生，故当 Folin-乙试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼 酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应能发生。 本法可测定范围是 25-250 μg 蛋白质。二、试剂和器材 2.1 试剂 (1) 试剂甲： (A) 4%碳酸钠（Na2CO3）溶液 (B) 0.2 mol/L 氢氧化钠（NaOH）溶液 (C) 2%酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠） (D) 1%硫酸铜（CuSO4? 5H2O）溶液 临用前将(A):(B):(C):(D)=50:50:1:1(V/V)混合，此混合液即为试剂甲。混合后的溶液一天内有效。27(2) Folin-酚试剂（试剂乙） 在 1.5 L 容积的磨口回流瓶中加入 100 g 钨酸钠 （Na2WO4? 2H2O） ， 25 g 钼酸钠 （Na2MoO4? 2H20） ， 及 700 mL 重蒸水，50 mL 85%磷酸，100 mL 浓盐酸充分混合，烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液 溢出，接上回流冷凝管以文火回流 10 h。回流结束后，加入 150 g 硫酸锂（LiSO4） ，50 mL 重蒸水及 数滴液溴，开口继续沸腾 15 min，以除去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色（如果仍呈绿色，须再重 复滴加溴水的步骤） ，定容至 1 L，过滤，滤液置棕色瓶中保存，可在冰箱长期保存。若此贮存液使 用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用标准 NaOH 滴定酸度， 以酚酞为指示剂。 该试剂的酸度应为 2 mol/L 左右， 将之稀释至相当于 1 mol/L 酸度使用， 即为 Folin-酚试剂。 (3) 标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，再根据其纯 度配制成 500 ?g 蛋白/mL 溶液。 2.2 测试样品 血清使用前稀释 100 倍或约含 20-250 ?g/mL 蛋白质的样品溶液。 2.3 器材 (1) 722 型分光光度计 (2) 恒温水浴锅 (3) 试管及试管架 (4) 0.5mL，1mL 及 5mL 移液管三、操作方法 3.1 蛋白浓度标准曲线的制作 取 14 支试管，分两组按下表平行操作试管编号 试剂处理 蛋白含量(?g) 标准蛋白溶液(mL) 重蒸水(mL) Folin-酚甲试剂(mL) 0 0 0 0.5 1 25 0.05 0.45 2 50 0.10 0.40 3 100 0.20 0.30 各管加入 4mL 混匀，于 20-25℃放置 10 min Folin-酚乙试剂(mL) 各管加入 0.5mL 4 150 0.30 0.20 5 200 0.40 0.10 6 250 0.50 0迅速混匀，30℃(或室温 20-25℃)水浴保温 30 min，以 0 号管为空白对照，在 650nm 处比色 OD650 绘制标准曲线：以 OD650 值为纵坐标，标准蛋白量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。283.2 样品溶液蛋白质浓度测定 取 6 支试管，分两组，按下表平行操作试管编组 试剂处理 样品溶液(mL) 重蒸水(mL) Folin-酚甲试剂(mL) 空白管(?3) 0 0.5 各管加入 4mL 混匀，于室温 20-25℃放置 10 min Folin-酚乙试剂(mL) 各管加入 0.5mL 迅速混匀，于 30℃(或室温 20-25℃)保温 30 min OD650 样品管(?3) 0.5 03.3 计算 蛋白质浓度(mg/mL)= OD650 值对应标准曲线蛋白含量?10-3 测定时所用样品溶液 mL 数 × 样品溶液稀释倍数3.4 注意事项 (1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定， 而 Folin-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质反应生成碱性的 铜-蛋白质溶液。因此当 Folin-酚乙试剂加入后，应立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂 破坏之前。 (2) 血清应适当稀释使其蛋白质的含量在标准范围内。四、思考题 (1) Folin-酚法测定蛋白含量的原理是什么? (2) 有哪些因素会干扰 Folin-酚法测定蛋白含量?（四）考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度一、原理 考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）测定蛋白浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理。考马 斯亮蓝 G-250 存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变 成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符 合比尔定律（Beer’s law） ，因此可以通过测定染料在 595nm 处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白 质量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 129h 左右，因此测定过程快速，且不需要严格的时间控制。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数， 使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质 5 ?g/mL 时就有 0.275 光吸收值的变 化，比 Lowry 法灵敏 4 倍，测定范围为 10-100 ?g 蛋白质，微量测定法测定范围是 1-10 ?g 蛋白质。 此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料 本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程 度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl、KCl、MgCl2、乙醇、(NH4)2SO4 不干扰测定。强碱性缓冲 剂在测定中有一些颜色干扰，可以通过适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris、乙酸、?-巯基乙醇、蔗 糖、甘油、EDTA、微量的去污剂（如 Triton X-100，SDS）和玻璃去污剂均有少量颜色干扰，用适 当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。 由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。二、试剂和器材 2.1 试剂 (1) 标准蛋白质溶液 结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白 OD1% 1cm =6.6 测定蛋白质含量，再 用 0.15 mol/L NaCl 或蒸馏水配制成 1 mg/mL，0.1 mg/mL 蛋白溶液。 (2) 考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95%乙醇中， 加入 100 mL 85%磷酸， 用蒸馏水稀释至 1000 mL，滤纸过滤。最终试剂中含 0.01%(W/V)考马斯亮蓝 G-250，4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸。 2.2 待测样品 未知蛋白质溶液，要求蛋白浓度范围为 0.1-5 mg/mL，若浓度过高时，需用 0.15 mol/L NaCl 溶 液或蒸馏水适当稀释。 2.3 器材 (1) 722 型分光光度计 (2) 微量进样器 (3) 移液管（0.1 mL 及 5 mL） (4) 试管及试管架三、操作方法 3.1 标准法制作标准曲线 取 14 支试管，分两组按下表平行操作。30试管编号 标准蛋白含量(?g) 1 mg/mL 标准蛋白溶液(mL) 蒸馏水(mL) 考马斯亮蓝试剂(mL)0 0 0 0.101 10 0.01 0.092 20 0.02 0.083 30 0.03 0.07 5 mL4 40 0.04 0.065 50 0.05 0.056 60 0.06 0.04摇匀，1 h 内以 0 号试管为空白对照，在 595nm 处比色 OD595nm 以 OD595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。3.2 微量法制作标准曲线 取 12 支试管，分两组按下表平行操作。试管篇号 标准蛋白含量(?g) 0.1 mg/mL 标准蛋白溶液(mL) 蒸馏水(mL) 考马斯亮蓝试剂(mL) 0 0 0 0.10 1 1 0.01 0.09 2 3 0.03 0.07 1 mL 3 5 0.05 0.05 4 7 0.07 0.03 5 9 0.09 0.01摇匀，1 h 内以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 处比色 OD595nm 以 OD595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。3.3 未知样品蛋白质浓度的测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的 OD595nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。 3.4 注意事项 (1) 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的 5-20 min 内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最 稳定。 (2) 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定 完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。四、思考题 (1) 与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马斯亮蓝染色法测定有何优点？（五）紫外分光光度法测定蛋白质浓度一、原理 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性 质，吸收高峰在 280 nm 波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含量呈正 比关系，可用作定量测定。31利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）得到广泛应用。此法的缺点是：(1)对 于测定那些与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；(2)若样品中含有 嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。根据蛋白质和核酸的吸收高峰不同，并利用 这一性质，通过计算可以适当校正核酸的干扰作用。二、试剂和器材 2.1 试剂 (1) 标准蛋白溶液； 准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质， 用重蒸水配制成浓度为 1 mg/mL 的溶液。 (2) 待测蛋白质样品溶液；用重蒸水适当稀释。 2.2 器材 (1) 752 型紫外分光光度计 (2) 移液管 (3) 试管和试管架三、操作方法 3.1 标准曲线法 3.1.1 标准曲线的绘制 取 8 支试管，按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。试管编号 标准蛋白质溶液(mL) 蒸馏水(mL) 蛋白质浓度(mg/mL) OD280 选用光程为 1cm 的石英比色杯，在 280nm 处分别测定各管溶液的 OD280 值。以蛋白质浓度为横坐标，OD280 值 为纵坐标，绘制标准曲线。 1 0 4.0 0 2 0.5 3.5 0.125 3 1.0 3.0 0.250 4 1.5 2.5 0.500 5 2.0 2.0 0.500 6 2.5 1.5 0.625 7 3.0 1.0 0.750 8 4.0 0 1.003.1.2 样品测定 取适当浓度的待测蛋白质溶液， 同样选用光程为 1cm 的石英比色杯， 测定 280nm 处的光吸收值， 并从标准曲线上查出待测定蛋白质的浓度。 3.2 其它方法 (1) 将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长 260nm 和 280nm 处分别测定出 OD 值，然后利用 280nm 及 260nm 下的吸收差求出蛋白质的浓度。 蛋白质浓度(mg/mL)=1.45 OD280 C0.74 OD26032式中 OD280 和 OD260 分别是蛋白质溶液在 280nm 和 260nm 波长下测得的光吸收值。 此外，也可先计算出的 OD280/OD260 比值后，从表 3.1 中查出校正因子DF‖值，同时可查出样品 中混杂的核酸的百分含量，将DF‖值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。 蛋白质浓度(mg/mL)=F× × OD280× N 式中 OD280 为该溶液在 280nm 下测得的吸光值；d 为石英比色杯的厚度(cm)；N 为溶液的稀释倍数。表 1 紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子 280/260 1.75 1.63 1.52 1.40 1.36 1.30 1.25 1.16 1.09 1.03 0.979 0.939 0.874 核酸(%) 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 5.00 因子(F) 1.116 1.081 1.054 1.023 0.994 0.970 0.944 0.899 0.852 0.814 0.776 0.743 0.682 280/260 0.846 0.822 0.804 0.784 0.767 0.753 0.730 0.705 0.671 0.644 0.615 0.595 核酸(%) 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 9.00 10.00 12.00 14.00 17.00 20.00 因子(F) 0.656 0.632 0.607 0.585 0.565 0.545 0.508 0.478 0.422 0.377 0.322 0.2781 d注:一般纯蛋白质的光吸收比值(OD280/OD260)约为 1.8，而纯核酸的比值约为 0.5(2) 对于稀蛋白质溶液， 还可用 215 nm 和 225 nm 的吸收差来测定浓度。 从吸收差△OD 与蛋白质含 量的标准曲线即可求出浓度。 吸收差△OD= OD215 C OD225 式中的 OD215 和 OD225 分别是蛋白质溶液在 215 nm 和 225 nm 波长下测得的光吸收值。 此法当蛋白质含量在 20-100 ?g/mL 的范围内， 是服从 Beer 定律的。 氯化钠、 硫酸铵以及 0.1 mol/L 磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是 0.1 mol/L 乙酸、琥珀酸、邻苯二 甲酸以及巴比妥等缓冲液在 215 nm 波长下的吸收较大，不能应用，必须降至 5 mmol/L 才无显著影 响。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因 pH 的改变而出现高低变化，故采用紫外吸收法时要注意溶液 的 pH，最好与标准曲线制订时的 pH 一致。 (3) 如果已知某一蛋白质在 280 nm 波长处的吸收值 OD1% 1cm ，则取该蛋白质溶液于 280 nm 处测定光 吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。 四、 思考题 (1) 简述紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理及优点。33实验九一、目的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。二、原理 带电质子在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现 象称为电泳。电泳现象早在 19 世纪初期就被人们发现了，并用于胶体化学中，但是电泳技术的广泛 应用则在 20 世纪 40 年代左右。近年来各种类型的电泳技术发展十分迅速。例如，纸电泳、醋酸纤 维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 在电泳形式上更是丰富多样，有在溶液中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，也有做成平板的 或柱状的。由于与光学系统和自动分部收集器相结合，又组成了等电聚焦仪，等速电泳仪等等，大 大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。 各种类型的电泳技术概括如表 2：表 2 电泳技术的种类 类 别 名 称 形 式1．Tiselleus 式微量电泳 2．显微电泳 不用支持物的电泳技术 3．等电聚焦电泳 4．等速电泳 5．密度梯度电泳 1．纸上电泳 2．醋酸纤维薄膜电泳 3．薄层电泳 4．非凝胶支持物区带电泳 水平式事垂直式 包括常压、高压电泳 （水平式或垂直式） 属自由电泳支持物有：淀粉、纤维素粉、玻璃粉、 （平板法、柱状法） 硅胶、合成树脂粉末 用支持物的电泳技术 5．凝胶支持物区带电泳 （1）淀粉凝胶 （2）聚丙烯酰胺凝胶 1）圆盘电泳 2）平板电泳 3）SDS-圆盘电泳 （3）琼脂糖凝胶电泳 （4）琼脂凝胶电泳 用 法 1．双向电泳 垂直式（柱状法） 垂直式或水平式 垂直式（测相对分子质量） 平板法或柱状法（如免疫电泳）342．电泳-层析相结合技术 3．交叉电泳法 4．连续纸电泳任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在 电场中向一定的电极移动。例如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多 可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的 pH 值大于等电点 pI） ，分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场 中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。 不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度的定义是带 电质点在单位电场强度下的泳动速度。即： u=v d / t dl = = （cm2? V-1? s-1）(厘米 2? 伏特-1? 秒-1) E V / l Vt式中：u 为泳动度（cm2? V-1? min-1） （厘米 2? 伏特-1 分-1） ； v 为质点的泳动速度（cm? s-1 或 cm? min-1） （厘米? 秒-1 或分-1） ； E 为电场强度（V? cm-1） （伏特? 厘米-1） ； d 为质点泳动距离（cm） （厘米） ； l 为支持物的有效长度（cm） （厘米） ； V 为加在支持物两端的实际电压（V） （伏特） ； t 为通电时间（s 或 min） （秒或分） 。 通过测量 d、l、V、t 便可计算出质点的泳动度。 泳动度首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般 来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之， 则越慢。泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响，如溶液的粘度等。影响泳 动速度的主要外界因素还有下列几种： （一）电场强度（电势梯度） 电场强度是指每 cm 的电压降，它对泳动速度起着十分重要的作用。例如，纸上电泳的支持物 滤纸两端相距 20cm，如电压降为 200V，则电场强度为 200V/20cm=10V? cm-1。电场强度越高，带电 质点移动速度越快。 根据电场强度的大小， 可将电泳分为常压 （100~500V） 电泳和高压 （500~10 000V） 电泳。常压电泳的电场强度一般为 2~10V? cm-1，电泳分离时间较长，需要几小时至几天；高压电泳 的电场强度为 20~200V? cm-1，电泳分离时间较短，有时仅需几分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等 大分子物质，而高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质。在生产中有时需要进行 快速的中间分析，如果没有高压电泳设备，可以把常压电泳小型化，缩短滤纸两端距离，也可达到 高压快速的目的。如将原来两端相距 20cm 的滤纸改为 5cm，外加电压仍为 200V，电场强度则变为 40V? cm-1，这样就加快了电泳速度。35（二）溶液的 pH 值 溶液的 pH 值决定带电质点解离的程度，也决定物质质点所带净电荷的多少。对蛋白质、氨基 酸等两性电解质而言，pH 值距等电点越远，质点所带净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。 因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适的 pH 值，使各种蛋白质所带净电荷的量差异 较大，以利于分离。为了使电泳过程中溶液的 pH 值恒定，必须采用缓冲溶液。 （三）溶液的离子强度 离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的 总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越 低，质点泳动的速度越快。一般最适合的离子强度在 0.02~0.2 之间。 在稀溶液中，离子强度的计算方法，是将每一离子浓度乘以其价数的平方，再将所有乘积相加， 以 2 除其和。计算公式如下： 离子强度（I）=1 ∑CZ2 2式中：C 为离子的摩尔浓度（mol? L-1） ； Z 为离子的价数。 例如：求 0.015mol? L-1Na2SO4 溶液的离子强度，则： 离子强度（I）= （四）电渗现象 液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由于纸上 带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并 带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移 动而产生的电渗速度的加和。若质点原来向负极移动，则其表面速度比电泳速度快。若质点原来向 正极移动，则其表面速度比电泳速度慢。 因此，在电泳时应尽量避免使用具有高电渗作用的支持物。 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。 本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素 的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜。醋酸纤维薄膜 对蛋白质样品吸附极少而无D拖尾‖现象。快速省时、灵敏度高、样品用量少、操作简单，目前已广 泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核 酸及其他生物大分子，为心血管疾病，肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为 医学和临床检验的常规技术。1 （0.015× 2× 12＋0.015× 22）=0.045 236图3不同 pH 条件下蛋白质分子在电场中运动状态示意图三、试剂和器材 3.1 试剂 (1) 巴比妥－巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07 mol/L)：称取巴比妥 1.66 g 和巴比妥钠 12.76 g，溶于少量 蒸馏水后定容至 1000 mL。置 4℃保存备用。 (2) 染色液：称取 0.5 g 氨基黑 10B，加入蒸馏水 40 mL，甲醇 50 mL 和冰醋酸 10 mL 混匀，在具塞 试剂瓶内贮存。 (3) 透明液：冰醋酸 25 mL 加 95%乙醇 75 mL。 (4) 漂洗液：乙醇 45 mL，冰醋酸 5 mL，蒸馏水 50 mL。 (5) 定量洗脱液（0.4 mol/L NaOH 溶液） 3.2 测试样品：新鲜血清（无溶血现象） 3.3 器材 (1) 电泳仪和卧式电泳槽 (2) 722 型分光光度计 (3) 醋酸纤维薄膜（2 cm ? 8 cm）和镊子或竹夹子 (4) 培养皿（直径 9-10 cm）和点样的玻璃片； (5) 直尺和铅笔；普通滤纸；单面刀片；电吹风 (6) 试管和试管架。四、操作方法 1.仪器和薄膜的准备 (1) 醋酸纤维薄膜的剪裁和准备 醋酸纤维薄膜分成有光泽面和无光泽面两面， 选择无光泽一面， 距离边沿 1.5 cm 处划一条直线， 然后把薄膜剪成 2 cm ? 8 cm，将裁好的薄膜无光泽面朝下，漂浮于巴比妥缓冲液上，若漂浮的薄膜 在 15-30 sec 内迅速润湿， 整条薄膜色泽深浅一致， 可以用于电泳。 让膜自然下沉， 待膜完全浸透 （约 0.5 h）后取出，夹在清洁的滤纸中间轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨光泽面和无光泽面。 (2) 制作滤纸桥37剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层附着在电泳槽的支架上。使它的一端与支架的前沿对齐，另一 端浸入电极槽的缓冲液内， 然后用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡， 使滤纸紧贴在支架上， 即为D滤 纸桥‖。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架制作相同的D滤纸桥‖。它们的作用是联系醋酸纤维 薄膜和两极缓冲液之间的D桥梁‖。 (3) 平衡 用平衡装置（或自制的平衡管） ，使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平状态，一般需要平 衡 15-20 min。注意，平衡后须将平衡装置的活塞关好(或除去平衡管)。 2. 点样 在薄膜无光泽的一面点样。点样在距负极端 1.5 cm 处（如图 4） 。点样时，用玻璃片沾上血清， 先在滤纸上练习点样，使血清均匀分布在点样区，形成具有一定宽度，粗细匀称的直线，试点熟练 之后，开始点在醋酸纤维薄膜上。此步是实验的关键。图4醋酸纤维薄膜规格及点样位置示意图 虚线处为点样位置3. 电泳 用镊子将点样端的薄膜平贴在电泳槽负极支架的D滤纸桥‖上（无光泽点样面朝下） ，另一端平贴 于正极，如图 5 所示。薄膜要紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 1图5 1. 滤纸桥 2. 电泳槽电泳装置剖视示意图 4. 电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板3.醋酸纤维素薄膜如果一个电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，让薄膜平衡 10 min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。打开电源开关， 调节使每厘米膜宽电流强度为 0.3 mA（8 片薄膜则为 4.8 mA） 。通电 10-15 min 后，将电流调节到每 厘米膜宽电流强度为 0.5 mA（8 片共 8 mA） ，电泳时间约 50-70 min。电泳结束后调节旋扭使电流为 零，关闭电泳仪切断电源。 4. 染色 电泳完毕立即取出薄膜， 直接浸入染色液中， 染色 5 min， 取出后用漂洗液浸洗脱色， 每隔 10 min38左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去，将膜夹于干净的滤纸中，用电吹风的冷风 将薄膜吹干。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。 5. 结果判断 一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带（图 6） 。从正极端起，依次为清蛋白，?1 球蛋白、 ?2 球蛋白、β 球蛋白和 γ 球蛋白。清蛋白 ?1- ?2- ?-?-球蛋白 原点图6血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱6. 透明 取一条漂洗清楚的电泳薄膜，待干燥后浸入透明液中约 5 min，取出平贴于玻璃板上，使完全干 燥，即成透明膜，电泳图谱仍清晰可见，可以长期保存。 7. 定量洗脱法 用洗脱法测定各蛋白质组分的相对百分含量。将电泳图谱（未经透明处理）的各区带剪下，分 别浸于盛有 0.4 mol/L 氢氧化钠溶液的试管中，清蛋白管加入 4 mL 氢氧化钠溶液，其余每管加 2 mL 氢氧化钠溶液，摇匀，放入 37℃恒温水浴中浸提 30 min，每隔 10 min 充分摇动一次，以便将色泽完 全洗脱下来。 该溶液颜色较稳定， 在室温下 24 h 内颜色强度无显著变化， 然后在 620nm 波长处比色， 测定各管的光吸收值分别为 ODA、ODα1、ODα2、ODβ、ODγ。按下列方法计算血清各部分蛋白质所 占百分率。 先计算光吸收值总和（简称为 T） T=2× ODA+ODα1+ODα2+ODβ+ODγ 再计算血清各部分蛋白质所占百分率(即相对百分含量)。 计算公式 清蛋白%= 正常值2 ? OD A ? 100 T54-73%α1 球蛋白%＝ODα 1 T ODα 2 T? 100 ? 1002.78-5.10%α2 球蛋白%= β 球蛋白%=6.3-10.6%ODβ ? 100 T ODγ ? 100 T5.2-11.0%γ 球蛋白%=12.5-20.0%五、注意事项39(1) 点样好坏是本实验的关键。 点样时应将薄膜表面多余的缓冲液吸去， 以免缓冲液太多引起样品扩 散。但也不能吸得太干，太干样品不易进入薄膜的网孔内，造成电泳起始点参差不齐，影响分离效 果。 (2) 点样量不能过大，否则各蛋白区带易拖尾，分离效果不好。点样量应在 0.1C5 ?L 范围内为宜。六、思考题 (1) 简述醋酸纤维薄膜电泳的原理及优点。 (2) 点样端为何放在负极？ (3) 实验中应注意哪些事项？40实验十一、实验目的影响酶活性的因素观察淀粉在水解过程中遇碘后溶液颜色的变化。观察温度、pH、激活剂与抑制剂对唾液淀粉酶 活性的影响。二、实验原理 人唾液中淀粉酶为 α-淀粉酶，在唾液腺细胞内合成。在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，经过 一系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下： 淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦牙糖、葡萄糖 淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色。麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。 淀粉与糊精无还原性，或还原性很弱，对本尼迪克特试剂呈阴性反应。麦芽糖、葡萄糖是还原 糖，与本尼迪克特试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。 唾液淀粉酶的最适温度为 37-40 ℃，最适 pH 为 6.8。偏离此最适环境时，酶的活性减弱。 低浓度的 Cl 离子能增加淀粉酶的活性，是它的激活剂。Cu2+等金属离子能降低该酶的活性，是 它的抑制剂。三、器材及试剂 1．器材： 试管、烧杯、量筒、恒温水浴锅、试管夹、试管架 2．试剂： (1) 唾液淀粉酶液：实验者先用蒸馏水嗽口，然后含一口蒸馏水于口中，轻嗽一、二分钟，吐入小烧 杯中，用滤纸过滤，除去稀释液中可能含有的食物残渣。并将该滤液稀释一倍。 (2) 0.5 %淀粉溶液（含 0.3%NaCl） ；将 0.5 g 可溶性淀粉与 0.3 g 氯化钠，混悬于 5 mL 的蒸馏水中， 搅动后缓慢倒入沸腾的 95 mL 蒸馏水中，煮沸 1 分钟，冷却后倒入试剂瓶中。 (3) 碘液：称取 2 g 碘化钾溶于 5 mL 蒸馏水中。再加 1 g 碘。待碘完全溶解后，加蒸馏水 295 mL， 混合均匀后贮于棕色瓶内。 (4) 本尼迪克特（Benedict）试剂：将 17.3 g 硫酸铜晶体溶入 100 mL 蒸馏水中，然后加入 100 mL 蒸 馏水。取柠檬酸钠 173 g 及碳酸钠 100 g，加蒸馏水 600 mL，加热使之溶解。冷却后，再加蒸馏水 200 mL，最后，把硫酸酮溶液缓慢地倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤除 去或自然沉降一段时间取上清液。此试剂可长期保存。 (5) 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液 (6) 0.1 mol/L 柠檬酸溶液 (7) 1% NaCl 溶液41(8) 1% CuSO4 溶液 (9) 0.5% 淀粉溶液 (10) 2% 蔗糖溶液四、操作步骤： 1．淀粉酶活性的检测： 取一支试管，注入 0.5 %淀粉溶液 5 mL 与稀释的唾液 0.5~2 mL。混匀后插入 1 支玻棒，将试管 连同玻棒置于 37 ℃水浴中。不时地用玻棒从试管中取出 1 滴溶液，滴加在白磁板上，随即加 1 滴碘 液，观察溶液呈现的颜色。此实验延续至溶液仅表现碘被稀释后的微黄色为止。记录淀粉在水解过 程中，遇碘后溶液颜色的变化。 向上面试管的剩余溶液中加 2 mL 本尼迪克特（Benedict）试剂，放入沸水中加热 10 分钟左右， 观察有何现象？为什么？ 2. 酶的特异性 酶的特异性是指一种酶只能对一种或一类化合物（此类化合物通常具有相同的化学键）起作用， 而不能对别的化合物起作用。如淀粉酶只能催化淀粉水解，对蔗糖的水解无催化作用。 本实验以唾液淀粉酶（含淀粉酶和少量麦芽糖酶）对淀粉的作用为例，说明酶的特异性。淀粉 和蔗糖都没有还原性，但淀粉水解产物为葡萄糖，蔗糖水解产物为果糖和葡萄糖，均为还原性糖， 能与 Benedict 试剂反应，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。 (1) 检查试剂 取 2 只试管，按下表操作。管 试 剂 剂1号2含 0.3％NaCl 淀粉溶液/mL 2%蔗糖溶液/mL Benedict 试剂/mL3 ― 2― 3 2摇匀，沸水浴煮沸 2～3min 观察结果(2)淀粉酶的专一性实验 取 2 只试管，按下表操作。42管 试 剂 剂 号1 1 3 － 摇匀，置 37℃水浴保温 10min2 1 － 3稀释的唾液/mL 含 0.3％NaCl 淀粉溶液/mL 2% 蔗糖溶液/mLBenedict 试剂/mL22摇匀，沸水浴煮沸 2～3min 观察结果3. pH 对酶活性的影响： 酶的催化活性与环境 pH 有密切关系，通常各种酶只在一定 pH 范围内才具有活性，酶活性最高 时的 pH，称为酶的最适 pH，高于或低于此 pH 时酶的活性都逐渐降低。不同酶的最适 pH 不同。酶 的最适 pH 不是一个特征性的物理常数，对于一个酶，其最适 pH 因缓冲液和底物的性质不同而有差 异。 （1）取 3 支 50 mL 锥形瓶，按下表的比例，制备不同浓度的缓冲液： 锥形瓶号 1 2 3 （2）取三支试管，照如下操作：试 剂 管 剂 号0.2mol/L 磷酸氢二钠 /mL 5.15 7.72 9.720.1M 柠檬酸/mL 4.85 2.28 0.28缓冲液 pH 5.0 6.8 8.01 2 ― ― 123pH 5.0 缓冲液/mL pH 6.8 缓冲液/mL pH 8.0 缓冲液/mL 含 0.3％NaCl0.5%淀粉溶液/mL― 2 ― 1― ― 2 1以 1 分钟的间隔，依次加入稀释的唾液 1 mL，摇匀 充分摇匀，置 37 ℃水浴保温 10 min，到达保温时间后，每隔 1 min 依次取出 KI-I2 溶液/滴 观察结果 2 2 243综合以上结果，说明 pH 对酶活性的影响。 4．温度对酶活性的影响： 对温度敏感是酶的一个重要特性，酶作为生物催化剂，和一般催化剂一样呈现出温度效应，提高 温度可以提高酶促反应速度，但另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，所以在较低的温度范围内， 酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大时 的温度称为酶的最适温度。酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间的长短有关系。 取 3 支试管，各加 3 mL 含 0.3 ％NaCl 的 0.5 %淀粉溶液；另取 3 支试管，各加 1mL 淀粉酶液。 将此 6 支试管分为三组， 每组中盛淀粉溶液与淀粉酶液的试管各 1 支， 三组试管分别置入 0 ℃、 37 ℃ 与 100 ℃的水浴中。 5 分钟后， 将各组中的淀粉溶液倒入淀粉酶液中， 继续维持原温度条件 5 min 后， 立即滴加 2 滴碘液，观察溶液颜色的变化。根据观察结果说明温度对酶活性的影响。5．激活剂与抑制剂对酶活性的影响： 酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低的称为抑制剂。 很少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但激活剂和抑制剂不是绝对的， 浓度的改变可能使激活剂变成抑制剂。 取 3 支试管，按下表加入各种试剂。混匀后，置于 37 ℃水浴中的保温。从 1 号试管 中用玻棒取 ． ．．． 出 1 滴溶液，置于白磁板上用碘液检查淀粉的水解程度。待 1 号试管 内的溶液遇碘不再变色后，立 ． ．．． ． 即 取出所有的试管，各加碘液 2 滴，观察溶液颜色的变化，并解释之。 ． 1 2 管试 剂 剂 号31 %NaCl 溶液/mL 0.1 %CuSO4 溶液/mL 蒸馏水 0.5 %淀粉溶液/mL 稀释的唾液/mL1 ― ― 3 1― 1 ― 3 1― ― 1 3 1摇匀，放入 37℃恒温水浴中保温 10～15 min，取出，冷却 KI-I2 溶液/滴 观察结果 2滴 2滴 2滴五、思考题 （1）本实验中如何通过淀粉液加碘后的颜色的变化来判断酶促反应快慢的？ （2）如何通过加入班氏试剂后生成沉淀多少来反映酶促反应快慢的？ （3）通过本实验，结合理论课的学习，小结出哪些因素影响唾液淀粉酶活性？是如何影响的？44实验十一一、目的要求：碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活测定的方法二、原理 碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为 ALPase) 广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase 能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化 磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环 过程中，ALPase 起了极其重要的作用。在生物体内 ALPase 与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质 的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase 的作用最适 pH 在碱性区域，一般在 pH9.0-10.5 范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活作用。 在酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作中 特别注意以下几点： (1) 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。选择来源丰 富，酶含量高的材料，并要考虑到由于所选用材料的动植物种属及其组织的不同，提取的方法也有 差异。 (2) 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可 溶 760 克） ，并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。在用硫酸铵沉淀酶蛋白时，要注 意缓冲液的 pH 值和温度，盐的溶解度随温度不同而有较大的变化，同时酶的溶解度亦随温度的改 变而改变。 (3) 盐析生成的沉淀，要静置 20 min 以上，使其沉淀完全，再进行分离。可采用离心方法将沉 淀物分离出来。 (4) 在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢， 尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。 (5) 有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯，但是选用的有机溶剂要满足以下几个条件： 能与水完全混溶；不与蛋白质发生反应；有较好的沉淀效应；溶剂蒸气无毒，且不易燃。因此，丙 酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。 (6) 在室温下有机溶剂能使大多数酶失活，因此要注意分离提纯实验必须在低温下进行。有机 溶剂应预先冷却，操作时注意慢慢加，并充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变 性。析出的沉淀容易在离心时沉降，因此可采用短时间的离心以析出沉淀 ，而且最好立即将沉淀溶 于适量的冷水或缓冲液中，以避免酶活力的丧失。 (7) 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，45提纯步骤才有效。 酶活力的分析：通常是以对-硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在 pH 10.1 的碳酸盐缓冲液（含 2 mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化 pNPP 水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物 pNP 在 405 nm 处有最大的吸收峰， 可以根据 OD405 值的增加计算酶活力的大小。 酶活力定义为： 在 37℃ 下，以 1 mmol/L pNPP 为底物，在 pH10.1 的碳酸盐缓冲液含 2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催 化产生 1 ?mol pNP 的酶量定为 1 个酶活力单位。酶的比活力定义为每 mg 蛋白所具有的酶活力单位 数。 蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（Folin-Phenol reagent）显色或双缩脲法。三、试剂和器材 1. 试剂 (1) 含 0.1 mol/L NaCl 的 0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5 缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷 (Tris =121.4) 1.214 g, NaCl 5.8 g, 溶于蒸馏水中，加入 80 mL 0.1 mol/L HCl, 用蒸馏水定容到 1000 mL。 (2) 硫酸铵（分析纯） (3) 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3 pH10.1 缓冲液 分别取(A)液 70 mL, (B)液 30 mL 混匀， 用酸度计准确 调节 pH=10.1。 (A) 0.1 mol/L Na2CO3 溶液 取 28.6 g Na2CO3? 10H2O 溶于 1000 mL 蒸馏水中。 (B) 0.1 mol/L NaHCO3 溶液 取 8.4 g NaHCO3 溶于 1000 mL 蒸馏水中。 (4) 20 mmol/L MgCl2：称取 1.904 g MgCl2 溶于 1000mL 蒸馏水中。 (5) 0.5 ?mol/mL 对硝基苯酚 (pNP＝141.1) 溶液：精确称取 17.64 mg 对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并 定容至 250 mL。 (6) 5 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠 (pNPP)：称取 371.2 mg pNPP 溶于 100 mL 蒸馏水中。 (7) 0.2 mol/L NaOH：称取 4 g NaOH 溶于 1000 mL 蒸馏水中。 (8) 0.5% NaCl 称取 5 g NaCl 溶于 1000 mL 蒸馏水中。 (9) 0.5 ?mol/mL 对硝基苯酚 (pNP＝141.1) 溶液：精确称取 17.64 mg 对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并 定容至 250 mL。 (10) 正丁醇 (11) 双缩脲试剂参考蛋白质含量测定实验2. 器材 (1) 高速组织捣碎机 (2) 离心机 (3) 超级恒温水浴锅 (4) 酸度计46(5) 722 分光光度计 (6) 天平、台秤 (7) 透析袋 (8) 磁力搅拌器 (9) 冰箱 (10) 秒表 (11) 50 ?L 微量进样器 3．材料 新鲜牡蛎四、操作方法 1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 (1) 称