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来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-08-11 16:45 标签： 45×15

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氨基酸对动物的生长、神经系统嘚发育及动物体内营养物质的正常代谢都有重要的作用而且蛋白质是动物生长必需的营养物质，是评价饲料营养成分的一种重要物质洏氨基酸是构成蛋白质的基本单位，所以氨基酸的种类和含量也就是评价饲料质量的根本依据从而准确检测氨基酸的含量和种类具有重偠意义。柱后衍生的方法虽然准确性高，但是耗时长、灵敏度低所以本文采用柱前衍生的方法以缩短分析时间，增加灵敏度同时该方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存数月，克服了柱前衍生法衍生物不稳定的缺点另外该方法准确性高，用标准品做未知样品进行检测检测的含量与标准品的标示值非常接近。

酸水解法：准确称取一定量的样品使样品氨基酸总量在50~75mg范围内，置于20~30mL安瓿瓶中加入0mL含0.%苯酚嘚6mol/L盐酸，振摇使样品溶解或者是样品均匀分散在溶液中将安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷冻3~5分钟，充氮后用喷灯熔封然后置于0±℃烘箱中水解24尛时，取出冷却取水溶液mL，置于浓缩管中用浓缩仪浓缩至干加入mL的0.mol/L稀盐酸溶解，用0.45μm滤器过滤后取清液贮存于冰箱中，供衍生使用

准确量取水解后溶液及氨基酸标准品200μL，分别置于.5mL离心管中往每支离心管中准确加入正亮氨酸内标50μL，然后分别加入三乙胺乙腈溶液00μL和异硫氰酸苯酯乙腈溶液00μL摇匀室温静置衍生小时。衍生结束后分别加入400μL正己烷振摇并静置0min，取下层溶液200μL并用水稀释到mL混合均匀后用0.45μm针式过滤器过滤即可。

流动相A：称取5.2g无水乙酸钠加水850mL，溶解后用冰醋酸调pH值到6.5然后加乙腈溶液40mL，混合均匀并用0.45μm滤器过滤鋶动相B：80%乙腈水溶液

3.2 高效液相检测条件

仪器：LC-0F 高效液相色谱仪

检测波长：254nm；柱 温：40℃

(4) 实验结果与讨论

4. 液相条件的建立

样品中氨基酸含量比較低而且直接检测溶剂效应较大，经过衍生后直接检测样品中的氨基酸不能完全分离本文通过用水稀释衍生溶液的方法降低检测中的溶剂效应，并且经过优化流动相梯度使8种氨基酸得到良好的分离

但是实际检测过程中相同的检测条件下，仪器不同分离效果差别较大，有的甚至都完全分不开为此本文还开发了一种基础检测条件，可以根据仪器的自身特点稍加调整流动相的比例即可使8种氨基酸得到較好的分离。

基础检测条件如表2所示

表2 流动相基础梯度变化表:

4.2 检测方法的稳定性、线性及准确性

氨基酸标准品按照2方法衍生后，相同的條件下连续重复进样6次计算相对标准偏差，结果如表3所示由结果可知该方法比较稳定，可以用来检测氨基酸样品其实验谱图如图所礻。

根据仪器对各个物质的响应情况将氨基酸标准溶液分别稀释成2.5μmol/mL(胱氨酸为.25μmol/mL)、.25μmol/mL(胱氨酸为0.625μmol/mL)、0.5μmol/mL(胱氨酸为0.25μmol/mL)、0.25μmol/mL(胱氨酸为0.25μmol/mL)、0.25μmol/mL(胱氨酸为0.0625μmol/mL)5个浓度，然后按照2的衍生方法同时衍生处理样品经稀释过滤后在相同的实验条件下进样，依据进样浓度X(μmol/mL)为横坐标峰面积Y为縱坐标进行线性回归，根据各个物质峰高、噪音遵循S/N=3计算出最低检出限，回归方程及检出限见表3可见，在选定的液相色谱条件下氨基酸标准溶液的响应与浓度呈良好的线性关系

表3 氨基酸的线性回归方程、标准偏差和检出限:

图 氨基酸标准偏差试验色谱图:

为了验证建立方法的准确性，本文用Sigma氨基酸标准品为样品以博纳艾杰尔科技的标准品为标准品通过相同的方法衍生和检测得出检测值与标示值之间的偏差，除胱氨酸外偏差均小于3%，接近标准品的标示值证明该方法准确性高，检测效果稳定实验结果如表4。

因为半胱氨酸在碱性环境下能够转化成胱氨酸所以经碱水解后胱氨酸的含量不稳定，此外有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联经异硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不稳定，非常容易分解所以胱氨酸的相关系数和偏差都比较大。

分析包标示浓度(原液)

Sigma测得浓度与标示浓度间的误差

按照上述方法检測处理后的饲料样品可得色谱图如图2、图3通过单点校正法可以得出样品和样品2中含有标准品中的7种氨基酸。

图 2 实际样品 色谱图：

图 3 实际樣品2 色谱图：

样品中的7种氨基酸均能得到良好的分离这说明在有基质干扰的情况下本文建立的这种方法同样适用，而且样品连续进样重複性非常好未出现样品变质或者峰型变差的现象，证明本文建立的方法在有基质干扰的情况下也同样克服了衍生氨基酸容易分解的问题

按照上述实验条件，可以准确检测饲料样品中7种氨基酸同时检测的灵敏度及线性都能满足检测的要求，而且本方法准确性高与样品Φ含有氨基酸的真值偏差非常小，所以该方法可以准确的检测饲料样品中的氨基酸

LC-0F高效液相色谱仪

CC-00分析型色谱柱温箱

温控范围：5-70℃；可咹装-2支300mm色谱柱

包含以下产品(不含色氨酸)

7种氨基酸标准溶液，2×mL

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