：磷酸转酮酶用于生产有用的代谢物的用途的制作方法

本发明涉及生产有用的代谢物，特别是源自乙酰辅酶A(乙酰CoA)的那些代谢物的方法。本发明还涉及用于所述生产方法的新的细菌。

相关技术简述通常，通过一些方法来生产细菌代谢的有用代谢物例如L-氨基酸、它们的中间体和其他化学物质，在所述方法中将分离自天然来源的细菌菌株或其突变体修饰以增强它们的生产力。

在适合于发酵的微生物中糖类是主要的碳源。Embden-Meyerhof和戊糖磷酸(戊糖-P)途径是微生物中中间糖代谢的两个初始途径。第三种途径，Entner-Doudoroff途径也是已知的，作为与羧酸途径的一些联系。在糖酵解期间，葡萄糖被代谢为主要的中间体化合物，例如磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和乙酰辅酶A，它们在许多细胞化合物例如L-氨基酸、嘌呤和嘧啶、维生素等等的形成中被用作组分。并且，在糖酵解期间出现能量的产生(ATP和NADH)。糖酵解后形成的丙酮酸常常通过由pps基因编码的磷酸烯醇丙酮酸合酶转变回磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，或通过由pdh基因等编码的丙酮酸脱氢酶转变回乙酰CoA。上述化合物之一，乙酰辅酶A，通过丙酮酸脱氢酶从丙酮酸形成，并伴有CO2的释放。一个碳原子的损失导致来源于乙酰CoA的有用化合物的生产得率(production

已经报道了双歧途径的两个酶，D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶(也称为“磷酸转酮酶”和果糖-6-磷酸磷酸转酮酶。D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶(EC 4.1.2.9)催化木酮糖-5-磷酸的消耗磷酸性转化变成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸，带有一个水分子的相伴性释放。果糖-6-磷酸磷酸转酮酶(EC

已经克隆了来自两个物种的磷酸转酮酶基因并测定了它们的序列。它们是编码来自乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶/果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的xfp基因(Meile，L.等，J.Bacteriol.，183(9)，1))，和编码来自戊糖乳杆菌(Lactobacillus

通过导入木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和另外的磷酸转酮酶的基因，来改善酵母从木糖生产乙醇的能力的方法是已知的(WO)。然而，从来没有报道过使用磷酸转酮酶基因用于消除二氧化碳的效果。

发明内容 本发明的目的是通过具有生产代谢物的能力的细菌菌株来增强有用代谢物的产生，以及提供使用这些菌株生产代谢物的方法。

本发明的目的是提供具有生产有用代谢物的能力的细菌，其中所述细菌被修饰以具有增加的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述有用代谢物源自乙酰辅酶A。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述有用代谢物选自由L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、琥珀酸酯(succinate)和聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate)构成的组。

本发明的目的是提供具有生产有用代谢物的能力的细菌，其中所述细菌天然不具有D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性，其中所述细菌已经用编码D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的DNA片段转化。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述有用代谢物源自乙酰辅酶A。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述有用代谢物选自由L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、琥珀酸酯(succinate)和聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate)构成的组。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述细菌选自由肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒状杆菌型细菌(Coryneform bacterium)和芽孢杆菌属(Bacillus)细菌构成的组。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)或泛菌属(Pantoea)。

本发明的进一步的目的是提供生产有用代谢物的方法，包括在培养基中培养所述细菌，并从所述培养基中收集所述有用代谢物。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述有用代谢物源自乙酰辅酶A。

本发明的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述有用代谢物选自由L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、琥珀酸酯和聚羟基丁酸酯构成的组。

通过在具有生产有用代谢物，特别是源自乙酰CoA的有用代谢物的能力的细菌中增强D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的能力，实现了这些目的，这使得更有效地利用碳和增加细菌的有用代谢物产量成为可能。由此，完成了本发明。

以下将详细描述本发明。

图2显示质粒pBS3的构建方法。

图3显示质粒pBS4S的构建方法。

图4显示质粒pBS5T的构建方法。

图5显示扩增了磷酸转酮酶基因的菌株和对照菌株在含有醋酸盐的基本培养基上的生长曲线。

图6显示扩增了磷酸转酮酶基因的菌株和对照菌株在基本培养基中的生长曲线。

图7(照片)显示含有磷酸转酮酶蛋白的细胞提取物的电泳。

图8显示使用扩增了磷酸转酮酶基因的菌株在生物素充足的条件下生产L-谷氨酸。

图9显示使用扩增了磷酸转酮酶基因的菌株在添加青霉素的情况下生产L-谷氨酸。

图10显示使用其中导入了磷酸转酮酶基因并降低了6-磷酸果糖激酶活性的菌株生产L-谷氨酸。

图11显示使用其中导入了磷酸转酮酶基因并降低了6-磷酸果糖激酶活性的菌株在存在青霉素的情况下生产L-谷氨酸。

图12显示使用扩增了磷酸转酮酶基因的菌株生产L-谷氨酰胺(Gln)。

优选实施方式的说明本发明的细菌包括具有生产有用代谢物的能力的细菌，其中所述细菌已经被修饰以增加D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性。

本发明的细菌包括天然不具有D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性的细菌和天然具有D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性的细菌。通过将编码D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的基因导入这种细菌，细菌中乙酰CoA的产生力得到增强，引起有用代谢物产量的提高。

在本发明的细菌中，D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性之一或两者可以被增强。

在本发明中，术语“磷酸转酮酶”包括D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和果糖-6-磷酸磷酸转酮酶。

在本发明中，用语“D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶的活性”是指一种活性，其催化木酮糖-5-磷酸变为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的磷酸消耗性转化反应并带有一个水分子的相伴性释放。这种活性可以通过Goldberg，M.等(MethodsEnzymol.，9，515-520(1966)或L.Meile(J.Bacteriol.(；)描述的方法来测量。

在本发明中，用语“果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性”是指一种活性，其催化果糖-6-磷酸变为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的磷酸消耗性转化反应并带有一个水分子的相伴性释放。果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性可以通过Racker，E.(Methods Enzymol.，5，276-280(1962)或L.Meile(J.Bacteriol.(；)描述的方法来测量。

在天然具有磷酸转酮酶活性的细菌中磷酸转酮酶的活性可以被增强超过野生型或未修饰的菌株，优选不少于野生型或未修饰的菌株的1.5倍，更优选不少于2倍，和最优选的不少于3倍。此外，在本发明中，天然不具有D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性的细菌可以被用作亲本菌株。在天然不具有磷酸转酮酶活性的细菌中磷酸转酮酶的活性可以通过用编码D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的DNA片段转化所述细菌来增强。无论亲本细菌是否天然具有磷酸转酮酶活性，都可以用如上所述相同的方法来测量。

是否已经导入了磷酸转酮酶活性可以使用丙酮酸脱氢酶(PDH)缺陷菌株来证实。PDH缺陷菌株是醋酸盐(acetate)营养缺陷的。另一方面，如果导入了磷酸转酮酶，PDH缺陷菌株对于醋酸盐将不再是营养缺陷的。因此，根据宿主菌株对于醋酸盐营养缺陷型的补偿可以证实编码磷酸转酮酶的基因的导入。作为PDH缺陷菌株，可以使用实施例中描述的ΔaceE菌株。

“D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶”可以是一种酶，其源自具有D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶活性的那些细菌，包括乳酸细菌、甲醇同化细菌、甲烷同化细菌、链球菌属(Streptococcus)细菌，特别是属于醋杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、硫杆菌属、链球菌属、甲基球菌属(Methylococus)、丁酸杆菌属(Butyrivibrio)、丝状杆菌属(Fibrobacter)的那些细菌和/或属于假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、毕赤酵母属、西洋蓍霉、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、丝孢酵母属、温酵母属(Wingea)等的那些酵母。

“果糖-6-磷酸磷酸转酮酶”可以是一种酶，其源自具有果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性、属于醋杆菌属、双歧杆菌属、绿菌属(Chlorobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、甲基球菌属(Methylococus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)的那些细菌，和/或属于红酵母属、假丝酵母属、酵母属等的酵母。

也可能的是通过一个酶，D-木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸转酮酶来呈现两种活性，。

NO3所示。xpk和xpk同源基因的核苷酸序列在表1和序列表中示出。SEQ ID NO2和4的氨基酸序列的比对在图1中示出。

编码乳酸双歧杆菌的D-木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的xfp基因的核苷酸序列已经在EMBL/GenBank数据库中以登记号AJ293946登记(Meile，L.等，J.Bacteriol.，183(9)，1))，在SEQ ID NO5中示出，由xfp基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示。xfp和xfp同源基因的核苷酸序列在表2和序列表中示出。

xpkA、xpk1和xfp基因都可以使用根据已知基因的核苷酸序列设计的引物通过PCR(聚合酶链式反应，参考White，T.J.等，Trends NO11和No12所示的引物可以获得来自双歧杆菌属的xfp基因。通过使用SEQ ID NO19和No24所示的引物可以获得来自乳杆菌属的xpkA基因。

可通过用编码磷酸转酮酶的DNA转化亲本菌株来增强磷酸转酮酶的活性。通过使用编码如上所述的磷酸转酮酶的DNA的常规方法可以进行用编码磷酸转酮酶的DNA转化细菌。

编码D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶的DNA可以是编码D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶的变体的DNA，根据天然的多样性，其可存在于不同的细菌菌株。编码这种变体的DNA可以通过分离DNA来获得，所述DNA在严格条件下与xpkA基因(例如，SEQ ID NO1或3)或该基因的部分杂交、并且编码具有D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶活性的蛋白。本文使用的术语“严格条件”包括这样的条件，在所述条件下形成所谓的特异性杂合体，而不形成非特异性杂合体。例如，严格条件可以包括这样的条件，在这些条件下具有高同源性的DNA，例如相互具有不低于70％的同源性、优选80％或更高、更优选90％或更高、最优选95％或更高同源性的DNA杂交。做为选择，通过一些条件例示了严格条件，其包括Southern杂交中的普通洗涤条件，例如，60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选60℃，0.1×SSC，0.1％SDS。洗涤的持续时间取决于用于印迹的膜类型，通常，是由制造商推荐的。例如，HybondTMN+尼龙膜(Amersham)在严格条件下建议的洗涤持续时间是15分钟。对于筛选变体xpkA基因的探针，可以使用表1中公开的核苷酸序列的部分序列。使用基于表1中公开的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，和含有表1中公开的核苷酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR可以制备这样的探针。当具有约300 bp长度的DNA片段被用作探针时，杂交后的洗涤可以在以下条件下进行50℃，2×SSC和0.1％SDS至少两次。

使用表2中公开的核苷酸序列作为探针，通过与以上描述的类似的方法，可以获得编码果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的DNA。

已知的是，在mRNA分子群体内发现的61种氨基酸密码子之中存在着同义密码子的某些分布偏爱，同族tRNA的水平似乎与密码子利用的频率成正比(参见，例如Kane，J.F.，Curr.Opin.Biotechnol.，6(5)，494-500(1995))。根据这个观点，很容易预测含有过多稀有tRNA密码子的大量mRNA种类的翻译问题。在例如大肠杆菌(E.coli)宿主中克隆的异源基因的转录开始之后，这种情况可能出现。新近的研究表明，AGG/AGA、CUA、AUA、CGA或CCC密码子的群集(cluster)可能降低合成的蛋白质的数量和质量。此外，可能的是任何这些密码子的过量，即使没有群集，可能产生翻译困难。所以，当编码目标蛋白质的异源DNA被转移到细菌时，需要用更频繁使用的密码子替换稀有密码子以避免这些翻译困难。在超过11,000种生物体中密码子利用的频率在“密码子利用率数据库”中呈现(http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura，Y.等，Nucl.Acids

此外，编码本发明的磷酸转酮酶的基因不限于野生型基因，而可以是在表1和2所示核苷酸序列中具有修饰的突变体或人工修饰的基因。编码的蛋白质可以在表1和2所示氨基酸序列中的一个或多个位置包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或插入，只要维持了编码的磷酸转酮酶蛋白的功能。尽管本文所指的“几个”氨基酸残基的数目取决于三维结构中的位置或氨基酸残基的类型而不同，但其可以是2到20个，优选2到10个，更优选2到5个。这种氨基酸取代包括功能上中性的(neutral)有义突变，优选为保守性取代。对于芳香族氨基酸来说，保守性取代包括相互可交换的phe、trp和tyr。对于疏水性氨基酸来说，保守性取代包括相互可交换的leu、ile和val。对于极性氨基酸来说，保守性取代包括相互可交换的gln和asn。对于碱性氨基酸来说，保守性取代包括相互可交换的arg、lys和his。对于酸性氨基酸来说，保守性取代包括相互可交换的asp和glu。对于含羟基氨基酸来说，保守性取代包括相互可交换的ser和thr。保守性取代还包括ser或thr对ala的取代，gln、his或lys对arg的取代，glu、gln、lys、his或asp对asn的取代，asn、glu或gln对asp的取代，ser或ala对cys的取代，asn、glu、lys、his、asp或arg对gln的取代，gly、asn、gln、lys或asp对glu的取代，pro对gly的取代，asn、lys、gln、arg或tyr对his的取代，leu、met、val或phe对ile的取代，ile、met、val或phe对leu的取代，asn、glu、gln、his或arg对lys的取代，ile、leu、val或phe对met的取代，trp、tyr、met、ile或leu对phe的取代，thr或ala对ser的取代，ser或ala对于thr的取代，phe或tyr对trp的取代，his、phe或trp对tyr的取代，met、ile或leu对val的取代。如上所述引起取代、缺失或插入一个或几个氨基酸的突变还包括起因于携带磷酸转酮酶基因(突变体或变体)的微生物的个体差异和物种差异的天然存在的突变。通过用MOTIF和Pfam在PKT中搜索保守区域(基序)可以选择要取代的区域。

可以通过例如，定点突变来修饰表1或2中所示的核苷酸序列来获得这样的基因，从而将一个或多个取代、缺失或插入导入到由该基因编码的蛋白质的特定位点上。

此外，这种基因也可以通过常规的诱变处理，例如以下所述的那些来获得。诱变处理的实例包括在体外用羟胺处理具有表1或2中所示的核苷酸序列或SEQ ID NO1中49至948位核苷酸的核苷酸序列的基因，和用紫外线照射或用于通常的突变处理的诱变试剂例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或EMS(甲磺酸乙酯(ethyl

可以通过，例如，使用遗传重组技术增加细胞中pkt基因的拷贝数来增强磷酸转酮酶基因(以下称为pkt基因，包括xpk或xfp基因)的表达。例如，可以通过将含有pkt基因的基因片段连接到能在宿主细菌中复制的载体，优选多拷贝载体，并将得到的载体导入到宿主细菌中来制备重组DNA。

当使用动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)的xfp基因时，可以，例如使用根据动物双歧杆菌的xfp基因的核苷酸序列(SEQ ID NO9或11)设计的引物，例如分别具有SEQ ID NO13或14的核苷酸序列的引物，并使用动物双歧杆菌的染色体DNA作为模板，通过PCR方法(聚合酶链式反应，参见White，T.J.等.，Trends Genet.，13，))来获得。也可以使用来自其他微生物的pkt基因，可以使用根据它们的pkt基因序列或其同源序列设计的寡核苷酸引物通过PCR，或使用根据如表1或2所示的这种序列信息制备的寡核苷酸探针通过杂交，从它们的染色体DNA或染色体DNA文库获得pkt基因。可以通过例如Saito和Miura的方法(参见H.Saito and

然后，将pkt基因连接到在宿主细菌中可操作的载体DNA来制备重组DNA。优选地，使用在宿主细菌中可自主复制的载体。

为了通过将pkt基因和任何上述载体连接来制备重组DNA，通常通过使用连接酶，例如T4 DNA连接酶来连接所述载体和含有所述pkt基因的片段。

为了将如上所述制备的重组DNA导入细菌中，可以采用迄今为止报道的任何已知的转化方法。可以采用例如，用氯化钙处理受体细胞以提高DNA的透过性的方法，针对大肠杆菌已经报道了(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，和使用从生长细胞制备的感受态细胞来导入DNA的方法，对于枯草芽孢杆菌(Bacillus

可以通过将单拷贝或多拷贝的基因整合到细菌的染色体DNA中来导入pkt基因。此外，也可以通过将多拷贝的基因整合到细菌的染色体DNA中来增加pkt基因的拷贝数。为了将pkt基因的一个或多个拷贝整合到细菌的染色体DNA上，可以通过靶向以多拷贝存在于染色体DNA上的序列来进行同源重组。转座子末端的重复DNA和反向重复序列(inverted repeats)可被用作以多拷贝存在于染色体DNA上的序列。做为选择，如在JP2-109985A中公开的，也有可能将pkt基因掺入到转座子中，并容许其被转移，从而将所述基因整合到染色体DNA中。此外，通过转座例如Mu整合可以实现基因表达的增强。例如，一轮Mu整合容许向细菌染色体中导入多达3个拷贝的基因。可以使用转座子例如Mu、Tn10和Tn5。可以通过使用具有pkt基因的部分序列的探针进行Southern杂交来确认pkt基因整合到染色体中。

也可以通过用更强的表达调节序列取代染色体DNA或质粒上的表达调节序列，包括pkt基因的启动子，如WO00/18935所述，扩增提高pkt基因表达的调节因子，或缺失或削弱降低pkt基因表达的调节因子，来实现pkt基因表达的增强。此外，还有可能的是向pkt基因的启动子区导入几个核苷酸取代使得所述启动子更强。在Goldstein等(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)中公开了评估启动子效力的方法和强启动子的实例。此外，由于已知的是，在核糖体结合位点(RBS)和翻译起始密码子之间的间隔区序列，特别是紧靠起始密码子上游的几个核苷酸，对翻译效率有很大的影响，因此可以修饰这个序列。pkt基因的表达调节序列可以使用用于启动子鉴定的载体或基因分析软件例如GENETYX来鉴定。

通过这样的启动子取代或修饰来增强pkt基因的表达。表达调节序列的取代也可以通过例如使用温度敏感质粒来实现。用于棒状杆菌型细菌的温度敏感质粒的实例包括p48K和pSFKT2(JPA)、pHSC4(参考法国专利Laid-open Publication No.2667875，1992和JP5-7491A)，pBS5T等等。在棒状杆菌型细菌中这些质粒至少可以在25℃的温度下自主复制，但在37℃的温度下不能自主复制。表达调节序列的修饰可以与增加pkt基因的拷贝数相组合。

使用对棒状杆菌属是致命的果聚糖蔗糖酶作为同源重组的标记物的方法也是适合的。编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因可用于选择在其中载体被有效地从染色体缺失的菌株。(Schafer，A.等Gene 145()。可以使用如下所述的sacB基因和sacB的同源基因。

本发明的细菌不仅包括天然不具有D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性的细菌，还包括天然具有这些蛋白质的活性、并且被修饰从而所述活性被增强的细菌。前者是优选使用的。

在本发明中使用的细菌的具体实例包括属于肠杆菌科，例如埃希氏菌属(Escherichia)、泛菌属(Pantoea)的细菌，棒状杆菌型细菌例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，芽孢杆菌属细菌例如枯草芽孢杆菌，等等。然而，本发明的细菌不限于这些实例。

在本发明中，棒状杆菌型细菌包括根据微生物学领域的技术人员已知的分类法被分类为棒状杆菌型细菌的细菌，迄今被分类为短杆菌属(Brevibacterium)、但现在重新分类入棒杆菌属(Corynebacterium)(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1991))的细菌，以及属于短杆菌属的细菌，其是棒杆菌属的近亲。这种棒状杆菌型细菌的实例如下所列。

America)获得。每个菌株被分配了登记号，人们可以根据它的登记号请求提供每种菌株。在美国典型培养物保藏中心的目录中指明了每个菌株的登记号。根据布达佩斯条约的规定，于1987年10月27日将AJ12340菌株保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(the National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency BP-1539。根据根据布达佩斯条约的规定，于1989年1月5日将AJ12418菌株保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，收到的登记号是FERM BP-2205。

术语“芽孢杆菌属细菌”是指根据微生物学领域的技术人员已知的分类法被分类为芽孢杆菌属的细菌。在本发明中，芽孢杆菌属细菌包括，但不限于，枯草芽孢杆菌168 Marburg菌株(ATCC 6051)、枯草芽孢杆菌PY79菌株(Plasmid，1984，12，1-9)等等，解淀粉芽孢杆菌的实例包括，但不限于，解淀粉芽孢杆菌T菌株(ATCC 23842)、解淀粉芽孢杆菌N菌株(ATCC

通过将上述DNA(pkt基因)导入到已经具有生产有用代谢物的能力的细菌中，可以获得本发明的细菌。做为选择，通过使已经导入了pkt基因的细菌赋予生产有用代谢物的能力，可以获得本发明的细菌。在后者的情况中，导入pkt基因和赋予生产有用代谢物的能力可以按任何顺序进行。

用语“具有生产有用代谢物的能力的细菌”是指一种细菌，当本发明的细菌在培养基中培养时它具有产生和引起有用代谢物在培养基中积累的能力。通过培育，包括诱变处理和遗传修饰，可以赋予或增强生产代谢物的能力。用语“ 细菌具有生产有用代谢物的能力”是指细菌能够产生和引起代谢物以大于野生型菌株或未突变菌株的量在培养基中积累。在此使用的用语“细菌具有生产有用代谢物的能力”还指一种细菌，其能够产生和引起目标代谢物以不低于0.5g/L、更优选不低于1.0g/L的量在培养基中积累。

用语“有用代谢物”是指初级代谢物，例如L-氨基酸、有机酸、维生素、糖类和/或Embden-Meyerhof、戊糖磷酸(pentose-P)途径、Entner-Doudoroff途径、柠檬酸循环和氨基酸生物合成的中间物。在本发明中要生产的L-氨基酸没有特别的限制，包括L-赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸(L-citrulline)、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、和L-甘氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。更优选地，本发明的细菌是具有生产源自乙酰CoA的代谢物的能力的细菌。这种代谢物选自由L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、琥珀酸酯(succinate)和聚羟基丁酸酯构成的组。

以下，将详细描述赋予了生产有用代谢物的能力的菌株的实例和赋予这种能力的方法。

在下文中，将说明给如上所述的亲本菌株赋予生产有用的代谢物能力的方法。

为了赋予生产有用代谢物的能力，可以使用通常用来培育属于埃希氏菌属或棒状杆菌型细菌的生产有用代谢物的细菌的方法。例如，可以使用用于获得具有生产有用代谢物能力的营养缺陷突变菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株的方法，和用于产生具有增强的有用代谢物生物合成酶活性的重组菌株的方法(″Amino Acid Fermentation″，the Japan Scientific

当产生重组菌株时，可以增强单个或多个有用代谢物生物合成酶的活性。此外，赋予营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变性质的方法可以与增强有用代谢物生物合成酶活性的方法组合。

具有生产有用代谢物的能力的营养缺陷突变菌株(有用代谢物例如L-氨基酸)、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株，可以通过使亲本或野生型菌株经过通常的诱变处理，例如X射线或紫外线照射、用诱变试剂例如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理来获得。然后，可以从突变的菌株中挑选具有生产有用代谢物能力的营养缺陷菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株。

为如上所述的细菌赋予生产L-谷氨酸的能力的方法包括，例如，修饰所述细菌使得编码涉及L-谷氨酸生物合成的酶的基因表达增强和/或过量表达。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的实例包括谷氨酸脱氢酶(以下也称为“GDH”)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶(以下也称为“CS”)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下也称为“PEPC”)、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶，等等。在这些酶中，优选CS、PEPC和GDH中一种或多种的活性被增强，更优选的是所有这三种酶的活性被增强。

通过如上所述方法修饰、从而CS基因、PEPC基因和/或GDH基因的表达被增强的细菌的实例包括在US6,197,559、US6,331,419和欧洲专利公开No.0999282和No.1078989中公开的细菌。

修饰细菌来赋予L-谷氨酸生产能力可以通过降低或失活酶的活性来进行，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径分支的、并产生L-谷氨酸以外的化合物的反应。催化从L-谷氨酸生物合成途径分支的并产生L-谷氨酸以外的化合物的反应的酶的实例包括，2-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶，等等。在这些酶中，优选的是降低或消除2-酮戊二酸脱氢酶的活性。

为了降低或失活上述酶的活性，可以通过普通的诱变处理或遗传工程来导入降低或失活酶的细胞内活性的突变。诱变处理的实例包括通过X-射线或紫外线照射、用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理，等等。降低或消除酶的细胞内活性的方法的实例包括突变或缺失微生物的细胞内编码所述酶的基因，使得与非突变菌株相比细胞内活性被降低或消除。突变或缺失基因的方法的实例包括修饰表达调节序列，例如启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列，向开放阅读框中导入错义突变、无义突变、或移码突变，和缺失基因的部分(J Biol Chem.)8611-7)。可以通过使用同源重组技术或通过使用转座子或IS因子将突变的基因导入到微生物中，在所述同源重组技术中染色体上的野生型基因被取代为所述突变的基因。同源重组技术包括使用线性DNA、温度敏感质粒和非可复制质粒的方法。在Proc Natl Acad Sci USA.2000 Jun

通过使用获自候选菌株的细胞提取物或其纯化的级分测量酶活性并将它与野生型或未修饰的菌株比较，可以确认目标酶的细胞内活性和活性下降的程度。例如，2-酮戊二酸脱氢酶活性可以通过Reed等的方法(Reed L.J.和Mukherjee B.B.，Methods in Enzymology，13，pp.55-61，1969)来测量。在美国专利5,378,616和5,573,945中描述了在α-酮戊二酸脱氢酶活性上有缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性、属于埃希氏菌属的细菌的实例，和获得它们的方法。具体地，这些菌株包括如下大肠杆菌W3110sucA::Kmr大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)通过破坏大肠杆菌W3110中的α-酮戊二酸脱氢酶基因(以下称为“sucA基因”)获得了大肠杆菌W3110sucA::Kmr。这个菌株是在α-酮戊二酸脱氢酶上完全缺陷的。

在WO95/34672和美国专利5,977,331中详细阐述了在其中使用同源重组破坏了sucA基因的棒状杆菌型细菌。

生产L-谷氨酸的细菌的其他实例包括属于埃希氏菌属并对天冬氨酸抗代谢物具有抗性的那些。这些菌株也可以是在α-酮戊二酸脱氢酶活性中有缺陷的，并包括，例如，菌株AF13199(FERM BP-5807)(美国专利5,908,768)，或菌株FFRM P-12379，其被额外修饰以具有降低的分解L-谷氨酸的能力(美国专利5,393,671)；大肠杆菌菌株AJ13138(FERM

属于泛菌属的生产L-谷氨酸的细菌的实例包括在α-酮戊二酸脱氢酶活性中有缺陷的或具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的突变菌株，而且可以如上所述获得。这种菌株包括Pantoea ananatis AJ13356或AJ13601(美国专利6,331,419)。Pantoea ananatis P-16645。然后它于1999年1月11日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，接受的登记号是FERM AJ13356和AJ13601在α-KGDH活性中是有缺陷的。当分离上述菌株时它们被鉴定为成团肠杆菌，并分别作为成团肠杆菌AJ13356菌株和AJ13601菌株保藏。然而，在16S rRNA的核苷酸测序等的基础上，它们近来被重新分类为Pantoea ananatis。虽然AJ13356、AJ13601和它们的亲本AJ13355(FERM BP-6614)都作为成团肠杆菌在上述保藏单位保藏，为了本说明书的目的它们被描述为Pantoea ananatis。

具有生产L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌的其它实例包括有机酸类似物抗性突变体和escletin抗性突变体(JP56-1889A、JPA、JP5702689A、JP88994A)。

BP-3004，JP56-151495A)可以用作亲本菌株来修饰以具有增加的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性的生产L-谷氨酰胺的细菌的实例包括，生产L-谷氨酰胺的棒状杆菌型细菌，其被修饰以具有增强的谷氨酸脱氢酶活性、谷氨酰胺合成酶活性(EP 1229121A)，或具有降低的谷氨酰胺酶活性(EP1424397A)。并且，可以使用携带突变谷氨酰胺合成酶、属于埃希氏菌属的细菌，在所述突变谷氨酰胺合成酶中相应于野生型谷氨酰胺合成酶中397位的酪氨酸氨基酸残基被任何氨基酸残基取代。

赋予6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性(JP3-232497A)、嘌呤类似物抗性、甲硫氨酸亚砜抗性(JP 61-202694A)、α-Ketomalinic acid抗性(JP56-151495)的方法可以用于通过培育来赋予或增强生产L-谷氨酰胺的能力。具有生产L-谷氨酰胺的能力的棒状杆菌型细菌的具体实例包括，但不限于黄色短杆菌AJ11573(FERM P-8123，JP61-202694A)用作亲本菌株、被修饰以具有增加的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性的生产L-脯氨酸的细菌的实例包括属于埃希氏菌属的生产L-脯氨酸的细菌，所述细菌携带在L-脯氨酸的反馈抑制中脱敏的(desensitized)γ-谷氨酰激酶，和/或其中L-脯氨酸降解系统被破坏。通过将编码在L-脯氨酸的反馈抑制中脱敏的γ-谷氨酰激酶的DNA导入细胞中(Dandekar，A.M.，Uratsu，S.L.，J.Bacteriol.，170，12，8))，例示了培育具有在L-脯氨酸的反馈抑制中脱敏的γ-谷氨酰激酶的细菌的方法。通过将突变导入脯氨酸脱氢酶基因中从而不表达活性的脯氨酸脱氢酶，例示了破坏L-脯氨酸降解系统的方法。并且，通过获得在L-脯氨酸同化能力中有缺陷的菌株并且通过使用L-脯氨酸营养缺陷型作为指标选择在细胞外过度生产L-脯氨酸的菌株，可以获得L-脯氨酸降解系统被破坏的细菌。属于埃希氏菌属的生产L-脯氨酸的细菌包括大肠杆菌菌株NRRL

可以用作亲本菌株被修饰以具有增加的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性的生产L-精氨酸的细菌的实例包括属于埃希氏菌属的生产L-精氨酸的细菌，例如大肠杆菌菌株237(VKPM B-7925)和具有突变N-乙酰谷氨酸合成酶的它的衍生菌株(美国专利Laid-open Publication)，其中导入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的生产精氨酸的菌株(JP57-5693A)等等。

生产L-精氨酸的细菌的其他实例是具有编码L-精氨酸生物合成酶的扩增的基因的菌株，所述L-精氨酸生物合成酶例如N-乙酰基谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(N-acetylglutamyl phosphate reductase)(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂解酶(argH)和氨甲酰基磷酸酯合酶(carAB)。编码这些酶的基因的名称分别在酶的名字后的括号中给出。

可以用作亲本菌株被修饰以具有增加的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性的生产L-亮氨酸的细菌的实例包括属于埃希氏菌属的生产L-亮氨酸的细菌，例如对4-氮亮氨酸(4-azaleucine)或5，5，5-三氟亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株H-9068(ATCC 21530)、H-9070(FERM BP-4704)和H-9072(FERM

可以用作亲本菌株被修饰以具有增加的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性的生产L-半胱氨酸的细菌的实例包括属于埃希氏菌属的生产L-半胱氨酸的细菌，例如大肠杆菌菌株JM15，其用编码反馈抗性丝氨酸酰基转移酶的不同cysE等位基因转化(美国专利6,218,168)；大肠杆菌菌株W3110，其过量表达适合于分泌细胞毒性物质的蛋白质的基因(美国专利5,972,663)；具有降低的半胱氨酸脱硫水化酶(cysteine desulfohydrase)活性的大肠杆菌菌株(JP11-)；对由cysB基因编码的半胱氨酸调节子使用阳性转录调节物活性增加的大肠杆菌菌株W3110(WO01/27307A1)等等。

可以用作亲本菌株被修饰以具有增加的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性的生产琥珀酸酯的细菌的实例包括属于埃希氏菌属和棒状杆菌型细菌的生产琥珀酸的细菌，例如黄色短杆菌MJ233Δ1dh菌株(JP11-206385A)，和黄色短杆菌MJ233/pPCPYC菌株(WO01/27258)。

可以用作亲本菌株被修饰以具有增加的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性的生产L-赖氨酸的细菌的其它实例包括大肠杆菌WC196的S-(2-氨基乙基)半胱氨酸(以下称“AEC”)抗性突变菌株(WO96/17930)。WC196菌株被命名为大肠杆菌AJ13069菌株，于1994年12月6日保藏在独立行政法人，产业技术综合研究所，特许微生物保藏中心(TsukubaCentral

具有生产L-苏氨酸的能力的微生物的实例包括6-二甲基氨基嘌呤-抗性突变体(JP5-304969A)，其中具有增强酶活性的突变的苏氨酸生物合成酶基因用质粒来扩增的菌株(JP1-29559B，JP05-227977A)，其中苏氨酸操纵子用质粒来扩增的菌株(JP2-109985A)，其中扩增了编码丙酮酸羧化酶的基因和编码烟酰胺核苷酸转氢酶(nicotinamide nucleotide

B-5318菌株对于L-异亮氨酸是营养缺陷的，编码苏氨酸生物合成酶的苏氨酸操纵子位于C1温度敏感阻遏物、PR-启动子和来源于λ噬菌体的Cro蛋白质N末端的下游。此外，这个菌株含有质粒DNA，其被构建使得苏氨酸生物合成基因的表达被来自λ噬菌体的启动子和阻遏物调节。

此外，大肠杆菌MG442菌株(US4,278,765)也可以用作生产L-苏氨酸的菌株。MG442菌株作为CMIMB-1628保藏在俄国国立工业微生物保藏中心(VKPM)。

03/044192)。具有生产L-苯丙氨酸的能力的棒状杆菌型细菌的实例包括对于酪氨酸是营养缺陷的和对L-苯丙氨酰-L-酪氨酸有抗性的菌株(JP5-49489A)。

具有生产L-色氨酸的能力的细菌可以通过增强L-色氨酸生物合成酶，包括磷酸甘油酸脱氢酶和邻氨基苯甲酸合酶的活性来获得。这些酶可以是对L-色氨酸或L-丝氨酸的反馈抑制有抗性的。例如，具有这些反馈抗性酶的细菌可以通过将质粒pGH5导入大肠杆菌SV164菌株来获得，所述质粒pGH5含有编码L-色氨酸抗性磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因，所述大肠杆菌SV164菌株带有编码L-丝氨酸抗性邻氨基苯甲酸合酶的基因(WO94/08031)。

具有生产L-色氨酸的能力的细菌也可以通过增强由色氨酸操纵子编码的L-色氨酸生物合成酶的活性来获得。L-色氨酸操纵子中的这些酶包括色氨酸合酶和邻氨基苯甲酸合酶。这些细菌的实例包括其中导入了色氨酸操纵子的大肠杆菌菌株，所述色氨酸操纵子含有编码L-丝氨酸抗性邻氨基苯甲酸合酶的基因(JP57-71397A、JP62-244382A和美国专利No.4,371,614)。

具有生产L-缬氨酸的能力的细菌可以通过增强L-缬氨酸生物合成酶的活性来获得，所述L-缬氨酸生物合成酶包括由ilvGMEDA操纵子编码的那些，特别是由ilvG基因编码的乙酰羟酸合酶(acetohydroxylate synthase)(JP02-748418B)。这些酶可以是对L-缬氨酸的反馈抑制有抗性的。

具有生产L-缬氨酸的能力的细菌包括具有减少的乙酰乳酸合酶III基因(ilvIH基因)的表达的那些细菌。

具有生产L-缬氨酸的能力的细菌可以对氨基酸类似物具有抗性。这种细菌的实例包括对L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸是营养缺陷的并且对D-核糖、嘌呤核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的突变菌株(FERM P-1841，P-5556；JP53-025034A)，和对类聚酮(polyketonoid)有抗性的突变菌株(FERM P-9325；JP04-045314B)。

此外，优选本发明的细菌被进一步修饰以具有降低的6-磷酸果糖激酶活性。可以通过例如Denise Kotlars和Henri Buc描述的方法(Methods inEnzymology()来测量6-磷酸果糖激酶活性。在本发明的细菌中将6-磷酸果糖激酶的活性降低至低于野生型或未修饰菌株，优选低于野生型或未修饰菌株的90％、更优选低于70％、最优选不低于50％。通过突变或破坏编码这个酶的基因，可以降低6-磷酸果糖激酶的活性，其中所述方法可以类似于用于降低α-酮戊二酸脱氢酶活性的方法。

在本发明中，通过在培养基中培养上述细菌、容许有用代谢物积累到培养基和/或细菌细胞中、并从培养基和/或细菌细胞收集所述有用代谢物，可以生产有用代谢物。

培养、收集和从培养基纯化有用代谢物，可以通过使用细菌生产有用代谢物的常规发酵方法进行。培养基可以是合成的或天然的，只要培养基含有碳源和氮源和矿物质，而且如有必要，含有细菌生长所需的适量营养物。碳源包括各种碳水化物，例如葡萄糖和蔗糖，和各种有机酸。取决于所选细菌的同化方式，可以使用醇，包括乙醇和甘油。对于氮源，可以使用氨，硫酸铵，其他氮化合物例如胺、天然的氮源例如蛋白胨、大豆水解产物和消化的发酵微生物。对于矿物质，可以使用单磷酸钾(potassium monophosphate)、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等等。在本发明中，更可取的是向培养基中添加盐酸硫胺素(thiamine hydrochloride)(维生素B1)。盐酸硫胺素的浓度是大于10μg/L，优选大于10mg/L，更优选低于100mg/L。

培养优选在有氧条件，例如通气的摇动培养和搅拌培养，在20到42℃、优选37到40℃的温度下进行。培养基的pH值通常在5和9之间，优选在6.5和7.2之间。可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液来调节培养基的pH值。通常，1到5天的培养足以在液体培养基中积累目标的有用代谢物。

培养之后，可以通过离心或膜过滤从液体培养基除去固体例如细胞，然后可以通过离子交换、浓缩和/或结晶方法等收集和纯化目标的有用代谢物。

实施例以下将参考以下非限制性实施例更具体地说明本发明。缩写Pyr-丙酮酸(pyruvate)，PEP-磷酸烯醇丙酮酸，GA-3P-甘油醛-3-磷酸，AceCoA-乙酰CoA。理论重量得率(theoretical weight yield)(Y)计算为Y＝(产物的分子量×摩尔数)/(底物的分子量×摩尔数)。反应式被简化并仅显示碳化合物(carbon compounds)和能量分子。

实施例1.计算具有或不具有磷酸转酮酶活性的细菌的乙酰CoA形成1.不包含磷酸转酮酶活性的乙酰CoA生物合成途径的反应其后是糖酵解的PTS系统给出以下反应式葡萄糖＝PEP+Pyr+ATP+2 NADH由ppc基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化以下反应PEP+CO2＝草酰乙酸由pdh基因编码的丙酮酸脱氢酶催化以下反应Pyr＝乙酰CoA+CO2+NADH最终反应式是葡萄糖＝乙酰CoA+草酰乙酸+ATP+3NADH(A)2.包含磷酸转酮酶活性的乙酰CoA生物合成途径的反应其后是糖酵解的PTS系统给出以下反应式葡萄糖+PEP＝果糖-6-磷酸+Pyr磷酸烯醇丙酮酸合酶催化以下反应Pyr+ATP＝PEP由ppc基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化以下反应PEP+CO2＝草酰乙酸果糖-6-磷酸磷酸转酮酶磷酸+果糖-6-磷酸＝H2O+赤藓糖-4-磷酸+乙酰磷酸转醛醇酶(transaldolase)和转酮醇酶(transketolase)果糖-6-磷酸+赤藓糖-4-磷酸＝2木酮糖-5-磷酸D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶磷酸+木酮糖-5-磷酸＝甘油醛-3-磷酸+乙酰磷酸糖酵解甘油醛-3-磷酸＝PEP+2ATP+2NADH由pta基因编码的磷酸转乙酰酶乙酰磷酸＝乙酰CoA最终反应式是2葡萄糖+2CO2＝3乙酰CoA+2草酰乙酸+NADH(B)比较反应式(A)和(B)显示，使用磷酸转酮酶的活性容许从1分子葡萄糖产生1.5分子的乙酰CoA并保存1个CO2分子，相比之下，在没有磷酸转酮酶活性的葡萄糖代谢中从1分子葡萄糖获得1分子的乙酰CoA。

实施例2.计算使用具有或不具有磷酸转酮酶活性的细菌时L-谷氨酸生产的理论得率。

1.包括PTS、糖酵解和TCA循环的L-谷氨酸生物合成途径的反应。

PTS+糖酵解葡萄糖＝乙酰CoA+草酰乙酸+ATP+3NADH(A)TCA循环乙酰CoA+草酰乙酸＝2-酮戊二酸+NADPH+CO2谷氨酸脱氢酶2-酮戊二酸+NH3+NADPH＝谷氨酸最终反应式葡萄糖＝谷氨酸+ATP+3NADH+CO2(C)L-谷氨酸的理论重量得率是81.7％2.包括糖酵解、非氧化性PPC和仅D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶的L-谷氨酸生物合成途径的反应糖酵解和非氧化性PPC5葡萄糖+5PEP＝5果糖-6-磷酸+5Pyr，其中果糖-6-磷酸+ATP＝2GA-3P2果糖-6-磷酸+2GA-3P＝2木酮糖-5-磷酸+2赤藓糖-4-磷酸2果糖-6-磷酸+2赤藓糖-4-磷酸＝4木酮糖-5-磷酸总反应式5葡萄糖+5PEP+ATP＝6木酮糖-5-磷酸+5Pyr然后，D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶木酮糖-5-磷酸+磷酸＝GA-3P+乙酰磷酸糖酵解和磷酸转乙酰酶GA-3P＝PEP+ATP+NADH乙酰磷酸＝乙酰CoA总反应式

(1)磷酸烯醇丙酮酸合酶PYR+2ATP＝PEP+磷酸假定NADH＝2ATP总反应式5葡萄糖＝6乙酰CoA+6PEP+7ATP磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)PEP+CO2＝草酰乙酸总反应式5葡萄糖+6CO2＝6乙酰CoA+6草酰乙酸+7ATP(2)TCA循环草酰乙酸+乙酰CoA＝酮戊二酸+CO2+NADPH总反应式5葡萄糖＝6酮戊二酸+6NADPH+7ATP谷氨酸脱氢酶酮戊二酸+NADPH＝谷氨酸最终反应式5葡萄糖＝6谷氨酸+7ATP(D)L-谷氨酸的理论重量得率是98％3.包括糖酵解、非氧化性PPC、两种磷酸转酮酶和乙醛酸支路的L-谷氨酸生物合成途径的反应PTS+糖酵解2葡萄糖+2PEP＝2果糖-6-磷酸+2PYR果糖-6-磷酸磷酸转酮酶2果糖-6-磷酸+磷酸＝赤藓糖-4-磷酸+乙酰磷酸转醛醇酶和转酮醇酶果糖-6-磷酸+赤藓糖-4-磷酸＝2木酮糖-5-磷酸木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶2木酮糖-5-磷酸+2磷酸＝2GA-3P+2乙酰磷酸总反应式

比较反应式(C)、(D)和(E)显示，使用磷酸转酮酶活性显著地增加了L-谷氨酸生物合成的理论得率，与在没有磷酸转酮酶活性的葡萄糖代谢中从1分子葡萄糖获得1分子L-谷氨酸相比，容许产生比利用的葡萄糖分子多1个分子的L-谷氨酸，并防止了CO2释放。

实施例3.计算使用具有或不具有磷酸转酮酶活性的细菌时琥珀酸生产的理论得率。

1.包括PTS、糖酵解和TCA循环的琥珀酸生物合成途径的反应。

2.包括糖酵解、非氧化性PPC和仅D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶的琥珀酸生物合成途径的反应糖酵解、非氧化性PPC、D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶给出总反应式(参见实施例2，反应式2)5葡萄糖+6CO2＝6乙酰CoA+6草酰乙酸+7ATPTCA循环

草酰乙酸+乙酰CoA＝琥珀酸+NADPH+NADH+ATP+2CO2最终反应式5葡萄糖＝6琥珀酸+6CO2+6NADPH+25ATP或假定NADH＝NADPH＝2ATP5葡萄糖＝6琥珀酸+6CO2+37ATP(G)琥珀酸的理论重量得率是79％3.包括糖酵解、非氧化性PPC、两种磷酸转酮酶和乙醛酸支路的琥珀酸生物合成途径的反应糖酵解、非氧化性PPC、果糖-6-磷酸磷酸转酮酶、D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶给出总反应式(参见实施例2，反应式4)2葡萄糖+2CO2＝3乙酰CoA+2草酰乙酸+NADH或4葡萄糖+4CO2＝6乙酰CoA+4草酰乙酸+2NADHTCA循环草酰乙酸+乙酰CoA＝琥珀酸+NADPH+NADH+ATP+2CO2总反应式4葡萄糖＝4琥珀酸+2乙酰CoA+4CO2+4NADPH+6NADH乙醛酸支路2乙酰CoA＝琥珀酸+NADH最终反应式4葡萄糖＝5琥珀酸+4CO2+4NADPH+7NADH或假定NADH＝NADPH＝2ATP4葡萄糖＝5琥珀酸+4CO2+22ATP(H)琥珀酸的理论重量得率是Y＝82％比较反应式(F)、(G)和(H)显示，使用磷酸转酮酶活性显著地提高了琥珀酸生物合成的理论得率，与在没有磷酸转酮酶活性的葡萄糖代谢中从1分子葡萄糖获得1分子琥珀酸相比，容许产生比利用的葡萄糖分子多1个分子的琥珀酸，并防止了CO2释放。

实施例4.计算使用具有或不具有磷酸转酮酶活性的细菌时L-亮氨酸生产的理论得率。

1.包括PTS和糖酵解的L-亮氨酸生物合成途径的反应。

糖酵解、非氧化性PPC、果糖-6-磷酸磷酸转酮酶、D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶给出总反应式(参见实施例2，反应式3)2葡萄糖＝3乙酰磷酸+2PYR+2ATP+2NADH磷酸转乙酰酶乙酰磷酸＝乙酰CoA总反应式2葡萄糖＝3乙酰CoA+2PYR+2ATP+2NADHL-亮氨酸生物合成

实施例4.从植物乳杆菌克隆磷酸转酮酶基因(xpk1)并评估xpk1基因扩增对大肠杆菌生产有用代谢物的影响xpk1基因可以从植物乳杆菌菌株8PA3(VKPM B-7495)的染色体DNA克隆。根据报道的核苷酸序列，可以合成用于扩增xpk1基因的、SEQ ID NO7(引物1)和No.8(引物2)中描述的引物。引物1含有导入其5’-末端的HindIII识别位点。引物2含有导入其5’-末端的EcoRI识别位点。

Taq聚合酶(Fermentas，Lithuania)在以下条件下进行PCR在95℃初始DNA变性5min；然后30个循环的95℃变性30sec、55℃退火60sec和72℃延伸120sec；最后在72℃多聚化7min。可以用HindIII和EcoRI处理获得的PCR片段并将其插入到预先用相同酶处理的载体pMW119中，所述PCR片段含有带其自身SD序列且没有启动子序列的xpk1基因。因而，可以获得质粒pMW-xpk1。

用pMW-xpk1质粒转化生产有用代谢物的细菌菌株可以通过普通方法进行，以获得含有扩增的xpk1基因的菌株。

L-异亮氨酸和25g/l白垩(chalk)(pH7.2)。葡萄糖和白垩应单独地灭菌。培养可以在30℃摇动进行3天。在培养之后，积累的L-谷氨酸的积累量可以通过纸层析(液相组合物丁醇-乙酸-水＝4∶1∶1)及随后用茚三酮(ninhydrin)(丙酮中1％溶液)染色和进一步在含有0.5％CdCl2的50％乙醇中洗脱化合物来测定。

两种菌株702ilvA和702ilvA-pMW-xpk1可以在L-琼脂平板上在37℃生长18-24小时。然后，这些菌株可以在如上所述的相同条件中培养。

两种菌株57和57-pMW-xpk1可以在L-琼脂平板上在37℃生长18-24小时。然后，这些菌株可以在如上所述的相同条件下培养，培养基中不添加异亮氨酸。

大肠杆菌菌株JM15(ydeD)是大肠杆菌菌株JM15(美国专利6,218,168)的衍生物，其可以用具有编码膜蛋白的ydeD基因的DNA转化，所述膜蛋白不涉及任何L-氨基酸的生物合成途径(美国专利5,972,663)。

用于评估L-半胱氨酸生产的发酵条件在美国专利6,218,168的实施例6中详细描述。

实施例5使用棒状杆菌型细菌确认磷酸转酮酶基因的生理活性(5-1)磷酸转酮酶基因的克隆和表达质粒的构建(1)构建pVK9-xfp从菌株动物双歧杆菌JCM1190的染色体DNA克隆xfp基因。根据动物双歧杆菌ATCC 27674的xfp基因的报道的核苷酸序列(GenBank登记No.AY518213，SEQ ID NO9)，可以合成SEQ ID

5-007491A)以获得包括它的可复制起点的区域并将该区域导入pHSG299(Takara Bio Inc.的产品)的AvaII位点而获得的。使用动物双歧杆菌的染色体DNA作为模板并使用SEQ IDNO13和NO14所示引物作为引物，通过PCR扩增包含启动子区域的xfp基因片段。通过常规方法进行PCR。

Km的LB培养基(1L中10g细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物和10g NaCl)上，培养过夜。然后，选择出现的白色菌落，分成单个菌落来获得转化体。从转化体分离含有xfp基因的目标质粒pVK9-xfp。

NO15和NO16的合成DNA作为引物进行PCR，以获得PS2启动子的扩增产物。然后，为了获得xfp基因(编码区)的序列的扩增产物，使用pVK9-xfp作为模板以及SEQ ID NO17和NO18的合成DNA作为引物进行PCR。SEQ ID NO16和NO18是相互互补的。

然后，为了获得含有PS2启动子和动物双歧杆菌xfp基因的片段，以基本上相等的量混合PS2启动子和动物双歧杆菌xfp基因的上述基因片段，使用这种混合物作为模板以及SEQ ID NO14和NO19的合成DNA作为引物进行PCR。

Km的LB培养基(1L中10g细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物和10g NaCl)上，培养过夜。然后，选择出现的白色菌落，分成单个菌落来获得转化体。从转化体分离含有PS2启动子和xfp基因的目的质粒pVK9-PS2_xfp。

首先，使用pKK223-3(Pharmacia)作为模板以及SEQ ID NO20和NO21的合成DNA作为引物进行PCR来获得tac启动子的扩增产物。然后，为了获得xfp基因(编码区)的序列的扩增产物，使用动物双歧杆菌JCM1190的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO14和NO22的合成DNA作为引物进行PCR。SEQ ID NO20和NO22的核苷酸序列是相互互补的。

然后，为了获得含有tac启动子和动物双歧杆菌xfp基因的片段，以基本上相等的量混合tac启动子和动物双歧杆菌xfp基因的上述基因片段，使用这种混合物作为模板以及SEQ ID NO14和NO21的合成DNA作为引物进行PCR。

Km的LB培养基(1L中10g细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物和10g NaCl)上，培养过夜。然后，选择出现的白色菌落，分成单个菌落来获得转化体。从转化体分离含有xfp基因和tac启动子的目的质粒pVK9-tac_xfp。

根据重叠PCR方法通过用PS2启动子取代编码磷酸转酮酶的戊糖乳杆菌xpkA基因的启动子区域获得DNA片段。在此具体描述该方法。

NO15和NO23的合成DNA作为引物进行PCR，来获得PS2启动子的扩增产物。然后，为了获得xpkA基因(编码区)的序列的扩增产物，使用戊糖乳杆菌JCM1558的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO24和NO25的合成DNA作为引物进行PCR。SEQ ID NO23和NO25的核苷酸序列是相互互补的。

然后，为了获得含有PS2启动子和戊糖乳杆菌xpkA基因的片段，以基本上相等的量混合PS2启动子和戊糖乳杆菌xpkA基因的上述基因片段，使用这种混合物作为模板以及SEQ ID NO19和NO24的合成DNA作为引物进行PCR。

Km的LB培养基(1L中10g细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物和10g NaCl)上，培养过夜。然后，选择出现的白色菌落，分成单个菌落来获得转化体。从转化体分离含有PS2启动子和xpkA的目的质粒pVK9-PS2_xpkA。

(5-2)磷酸转酮酶的体内生理活性的确认(1)构建ATCC13869ΔaceE菌株PDH缺陷菌株是醋酸盐(acetate)营养缺陷的。另一方面，其中导入了磷酸转酮酶基因的PDH(丙酮酸脱氢酶)缺陷菌株对于醋酸盐不再是营养缺陷的。因此，证实了导入xfp或xpkA基因的影响。

Bio)，进行PCR反应。通过普通方法纯化之后，用BglII和BamHI消化PCR产物并平端化。将得到的PCR产物与已经用AvaII消化并平端化的pHSG299连接。所述质粒用于转化大肠杆菌JM109(TakaraBio Inc.)的感受态细胞，然后将转化体悬浮在含有25mg/ml卡那霉素的LB培养基中并培养过夜。挑出菌落并进行单菌落分离，然后获得转化体。从转化体分离含有sacB基因的目标质粒pBS3。

pBS3的构建步骤在图2中说明。

(B)构建pBS4S通过重叠PCR，通过破坏质粒pBS3中卡那霉素抗性基因的编码区中SmaI位点来获得质粒。首先，使用pBS3作为模板以及SEQ ID NO44和NO45的合成DNA作为引物，进行PCR，获得含有卡那霉素抗性基因的N-末端区域的PCR产物。另一方面，为了获得含有卡那霉素抗性基因的C-末端区域的PCR产物，使用pBS3作为模板和SEQ ID

通过导入不引起氨基酸取代的突变，破坏这个序列的SmaI位点。为了获得其中SmaI位点被破坏的突变卡那霉素抗性基因片段，将卡那霉素抗性基因的基因产物的N-末端区域和基因产物的C-末端区域混合，形成几乎等摩尔的混合物。使用得到的混合物作为PCR的模板以及SEQ ID NO44和NO47的合成DNA作为引物，进行PCR。获得在卡那霉素抗性基因中具有突变的PCR产物。通过在98℃热处理5分钟的一个循环之后，重复25次包括98℃10秒、57℃30秒和72℃1.5分钟的循环，使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)，可以获得目标PCR产物。

在纯化之后用BanII消化PCR产物，并插入到上述的pBS3的BanII位点中。获得的DNA用于转化大肠杆菌JM109(Takara Bio Inc.)的感受态细胞，悬浮在含有25mg/ml卡那霉素的LB培养基中并培养过夜。挑出菌落并进行单菌落分离，获得转化体。从转化体分离目的质粒pBS4S。pBS4S的构建步骤在图3中说明。

(C)构建pBS5T通过以下步骤构建具有来自棒状杆菌型细菌的温度敏感复制起点的质粒pBS5T。

通过用BamHI和SmaI消化pHSC4(US5616480A)并将消化的片段平端化来获得温度敏感复制的区域，然后将这个区域连接到pBS4S的平末端化的NdeI位点。获得的DNA用于转化大肠杆菌JM109(Takara Bio Inc.的产品)的感受态细胞，将转化体悬浮在含有25mg/ml Km的LB培养基中并培养过夜。挑出菌落并进行单菌落分离，然后获得转化体。从转化体分离含有sacB片段和温度敏感复制起点的目的质粒pBS5T。图4说明了pBS5T的构建方案。

(2)aceE基因破坏的片段的克隆通过重叠PCR方法，使用根据谷氨酸棒杆菌ATCC13032的aceE基因的报道的核苷酸序列(GenBank数据库登记No.NC 003450；SEQ ID NO38)的合成DNA作为引物，从ATCC13869获得编码丙酮酸脱氢酶(丙酮酸脱氢酶E1元件)的aceE基因破坏的DNA片段。

首先，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板以及SEQ IDNO26和NO27的合成DNA作为引物进行PCR，来获得aceE基因的N-末端侧的扩增产物。然后，为了获得aceE基因的C-末端侧的扩增产物，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO28和NO29的合成DNA作为引物进行PCR。SEQ ID NO26和NO28的序列是相互互补的。

然后，为了获得其中内部序列被缺失的aceE片段，以基本上等摩尔的量混合N-和C-末端的上述基因片段，使用这种混合物作为模板以及SEQ ID NO30和NO31的合成DNA作为引物进行PCR。

Km的LB培养基(1L中10g细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物和10g NaCl)上，培养过夜。然后，选择出现的白色菌落，分成单个菌落来获得转化体。从转化体分离目的质粒pBS5T-ΔaceE。

(3)构建aceE-破坏的菌株aceE基因编码丙酮酸脱氢酶E1元件。

MnSO4·7H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解产物和10μg/L生物素，pH值7.5(NaOH))上，在25℃培养约60小时，分离出现的菌落作为转化体。然后，转化体在34℃在CM-Dex液体培养基上培养过夜。在合适的稀释后，将培养的转化体悬浮在含有25mg/ml卡那霉素的CM-Dex培养基中，在34℃培养约30小时。作为质粒上破坏类型的aceE基因(ΔaceE)与染色体上天然aceE基因之间的单交叉同源重组的结果，获得了可以在这个培养基中生长、并且在染色体上兼有卡那霉素抗性基因和源自质粒的sacB基因的ΔaceE菌株。

MnSO4·4H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解产物、10μg/L生物素和2g/L醋酸钠、用KOH调节到pH7.5)中。在34℃进行培养约30小时。作为第二次交叉同源重组的结果，获得了不具有染色体SacB基因且对蔗糖不敏感的菌株。

以此方式获得的菌株包括具有破坏型的aceE基因的那些菌株和具有野生型aceE基因的那些菌株。通过使用在Dex-S10琼脂培养基上培养获得的细胞直接进行PCR反应，来确认aceE基因是破坏型还是野生型。选出含有破坏型的aceE基因的菌株，命名为“ATCC13869ΔaceE”。

(4)评估ΔaceE菌株中磷酸转酮酶的生理活性将pVK9(用于对照的质粒)、pVK9-xfp(用于扩增动物双歧杆菌的xfp基因的质粒)、pVK9-PS2_xfp(用于扩增动物双歧杆菌的xfp基因的质粒，其中它的天然启动子被PS2启动子取代)和pVK9-PS2_xpkA(扩增戊糖乳杆菌的xpkA基因的质粒，其中它的天然启动子被PS2启动子取代)各自导入ATCC13869ΔaceE菌株来获得表达磷酸转酮酶的菌株，并将pVK9导入ATCC13869菌株作为对照。具体地，通过电脉冲方法各自转化ATCC13869ΔaceE菌株和ATCC13869菌株，铺在含有25mg/ml卡那霉素的CM-Dex培养基(5g/L葡萄糖、10g/L多蛋白胨、10g/L酵母提取物、1g/LKH2PO4、0.4g/L

MOPS组成，通过KOH调节pH7.0)，和含有醋酸盐(2g/L醋酸钠)的基本液体培养基。分别在图6和5中说明在基本培养基上培养的结果和在含有醋酸盐的基本培养基上培养的结果。ATCC13869ΔaceE(pVK9)菌株可以在含有醋酸盐的基本培养基上生长，而不能在基本培养基上生长，因而展现了醋酸盐营养缺陷。携带pvK9-xfp、pVK9-PS2_xfp和pVK9-PS2_xpkA的ATCC13869ΔaceE菌株分别可以在基本培养基上生长，说明导入xfp或xpkA产生了对PDH缺陷菌株的醋酸盐营养缺陷的补偿。因此，证实了被导入谷氨酸棒杆菌中的磷酸转酮酶的生理活性。

实施例6.确认磷酸转酮酶的酶活性棒状杆菌型细菌可以在生物素有限、或培养基中添加青霉素或表面活性剂的情况下生产L-谷氨酸(参见WO95/34672)。另一方面，已知的是，被修饰以降低α-酮戊二酸脱氢酶活性(E1.2.4.2 sucA；2-酮戊二酸脱氢酶)的菌株甚至可以不在这种条件下生产L-谷氨酸(Kimura

首先，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板以及SEQ IDNO32和NO33的合成DNA作为引物进行PCR，来获得sucA基因的N-末端的扩增产物。然后，为了获得sucA基因的C-末端的扩增产物，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO34和NO35的合成DNA作为引物进行PCR。SEQ ID NO33和NO34的序列是相互互补的。

然后，为了获得其中它的内部序列被缺失的sucA片段，以基本上等摩尔的量混合N-和C-末端的上述基因片段，使用这种混合物作为模板以及SEQ IDNO36和NO37的合成DNA作为引物进行PCR。

按常规方式纯化得到的PCR产物，并用BamHI消化。通过使用连接试剂盒(Takara Bbamhio Inc的产品)将消化的PCR产物连接到已经用BamHI消化的以上描述的pBS3。连接混合物用于转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(TakaraBio Inc.的产品)。将细胞铺在含有100μM IPTG、40mg/ml X-Gal和25mg/mlKm的LB培养基(1L中10g细菌用胰蛋白胨、5g细菌用酵母提取物和10gNaCl)上，培养过夜。然后，选择出现的白色菌落，分成单个菌落来获得转化体。从转化体分离目标质粒pBS3ΔsucA。

(2)制备破坏了sucA的菌株在(A)中制备的pBS3ΔsucA不含有在棒状杆菌型细菌的细胞中可自主复制的区域。因此，如果用这个质粒转化棒状杆菌，通过同源重组将这个质粒整合到其染色体中的菌株将作为转化体出现，虽然它以极低的频率发生。通过电脉冲法用高浓度的质粒pBS3ΔsucA转化谷氨酸棒杆菌ATCC13869，铺在含有25mg/ml卡那霉素的CM-Dex培养基(5g/L葡萄糖、10g/L多蛋白胨、10g/L酵母提取物、1g/L MnSO4·7H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解产物和10μg/L生物素，通过NaOH调节pH值7.5)上，在31.5℃培养约30小时，然后将出现的菌落分离作为转化体。作为在质粒的sucA基因片段和染色体上天然基因之间同源重组的结果，这些转化体具有源自质粒的卡那霉素抗性基因和SacB基因。

接下来，将获得的第一次重组菌株在31.5℃在无卡那霉素的CM-Dex液体培养基上培养过夜。在合适的稀释之后，将培养的转化体铺在含有10％蔗糖的无卡那霉素Dex-S10培养基(10g/L蔗糖、10g/L多蛋白胨、10g/L酵母提取物、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/LMnSO4·4H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解产物和10μg/L生物素，通过KOH调节pH值7.5)上，在31.5℃培养约30小时，将出现的菌落分离作为转化体。作为第二次交叉同源重组的结果，获得了染色体丢失了SacB基因并且对蔗糖不敏感的菌株。

照这样获得的菌株包括具有破坏型sucA基因的那些和具有野生型sucA基因的那些。通过使用在Dex-S10琼脂培养基上培养获得的细胞直接进行PCR反应，来确认sucA基因是破坏类还是野生型。选择具有破坏型sucA基因的菌株。

CaCO3(用KOH调节到pH8.0)，在31.5℃摇动培养直到糖类被完全消耗。完成培养之后，测量培养液中积累的L-谷氨酸的量。选择可以比ATCC13869产生更高L-谷氨酸发酵产量的破坏了sucA的菌株，作为ATCC13869的破坏了sucA的菌株，并命名为ATCC13869ΔsucA。

(6-2)在破坏了sucA的ATCC13869菌株中确认磷酸转酮酶基因表达和酶活性通过使用已经被修饰以增强磷酸转酮酶表达的菌株，研究了磷酸转酮酶基因的表达和它的酶活性。

将pVK9(用于对照的质粒)、pVK9-xfp(用于扩增动物双歧杆菌的xfp基因的质粒)、pVK9-tac_xfp(用于扩增动物双歧杆菌的xfp基因的质粒，其中它的天然启动子被tac启动子取代)、pVK9-PS2_xfp(用于扩增动物双歧杆菌的xfp基因的质粒，其中它的天然启动子被PS2启动子取代)和pVK9-PS2_xpkA(用于扩增戊糖乳杆菌的xpkA基因的质粒，其中它的天然启动子被PS2启动子取代)各自导入以上描述的谷氨酸棒杆菌ATCC13869ΔsucA来获得表达磷酸转酮酶的菌株。具体地，通过电脉冲方法用每种质粒转化ATCC13869ΔsucA菌株，铺在含有25mg/ml卡那霉素的CM-Dex培养基(5g/L葡萄糖、10g/L多蛋白胨、10g/L酵母提取物、1g/L

EDTA、1mM MgCl2、0.2mM PMSF、2mM DTT)中。通过超声波细胞破碎机(“Bioruptor”)破坏细胞。通过离心(15,000g，60min))除去未破坏的细胞来获得粗酶溶液。通过使用CBB溶液(蛋白质分析CBB溶液，Nacalai Tesque的产品)用牛血清白蛋白作为标准样品，定量粗酶溶液中的蛋白质浓度。

通过SDS-PAGE，分离粗酶溶液中的蛋白质。接下来将描述分离的具体过程。在浓度调整之后，将粗酶溶液与样品缓冲液(“Laemmli样品缓冲液”，BIORAD的产品)以1∶1混合。在95℃加热2分钟后，将得到的混合物上样到“Ready GelJ 10％”(BIORAD的产品)上，使得上样的蛋白质的量为10μg，随后在200V的恒定电压下在MiniProtean III

结果以下在表3中示出。在对照(pVK9)中没有检测到酶活性，而在磷酸转酮酶活性已经被增强的菌株中检测到酶活性。

CaCO3(用KOH调节到pH8.0)，在31.5℃摇动培养直到糖类被完全消耗。完成培养之后，测量培养液中积累的L-谷氨酸的量和OD。结果在图8中示出。结果显示，与对照相比，其中扩增了xfp基因的所有菌株显示了高L-谷氨酸产量。

(7-2)添加青霉素时的评估为了在补偿的(equalized)最终OD下评估，通过添加青霉素G停止细胞的增殖。当培养开始后OD达到10到14的范围内时在多个生长点处，通过向如上文(1)中描述的培养基中添加青霉素G，使得它的终浓度是4U/ml，来比较L-谷氨酸的产量。结果在图9中示出。这些结果显示，即使在它们的最终细胞计数相等的点上在它们之中比较L-谷氨酸的产量，与对照菌株相比，在xfp基因或xpk基因扩增的菌株中L-谷氨酸产量更高。上述结果显示，导入磷酸转酮酶对于改善L-谷氨酸发酵产量是有效的。

实施例8.动物双歧杆菌的xfp基因的表达对Pantoea ananatis菌株的L-谷氨酸积累的影响使用Bio-Rad MicroPulser通过电穿孔将表达动物双歧杆菌的xfp基因的pVK9-PS2-xfp质粒和对照pVK9穿梭载体导入NP106/RSFCPG生产L-谷氨酸的菌株。通过将AJ13601菌株铺在不含有氯霉素作为选择标记物的培养基上，来从AJ13601菌株(FERM

为了用pVK9-PS2-xfp质粒或pVK9载体转化NP106/RSFCPG菌株，在添加四环素(10μg/ml)的LBG-M9培养基(胰蛋白胨(trypton)(10g/L)、酵母提取物(5g/L)、NaCl(5g/L)、葡萄糖(5g/L)、0.5×M9盐溶液)上过夜培养获得的细胞，用新鲜的LBG-M9培养基1∶100稀释，在34℃通气培育直至OD595＝0.6。通过离心收获来自10ml培养物的细胞，用冰冷的去离子水和用冰冷的10％甘油洗涤三次，重悬浮在10％甘油中。将10ng质粒DNA添加到细胞悬液，施加电脉冲(E＝20kV/em，t＝5msec)。在电穿孔后立即添加1ml

可以从表4中看出，携带pVK9-PS2-xfp质粒的菌株显示L-谷氨酸积累比用载体pVK9转化的对照菌株高大约2.6g/L，其对应于至少6％的收率增加。

实施例8.通过将磷酸转酮酶活性的增强和6-磷酸果糖激酶(PFK)活性的降低进行组合来改善L-谷氨酸的发酵产量8-1.制备sucA和PFK双破坏的菌株(1)构建用于破坏pfk基因的质粒使用根据谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的相应基因的核苷酸序列(GenBank数据库登记No.NC_003450；SEQ ID NO61)设计的合成DNA作为引物，通过重叠PCR法获得了缺乏源自菌株ATCC13869的pfk的ORF的基因片段。具体地，使用谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的染色体DNA作为模板以及SEQ IDNO50和NO51的合成DNA作为引物，通过常规PCR方法获得了pfk基因的N-末端区域的扩增产物。另一方面，为了获得pfk基因的C-末端区域的扩增产物，使用菌株ATCC13869的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO52和NO53的合成DNA作为引物进行常规PCR。SEQ ID NO51和NO53的序列是相互互补的。

然后，为了获得其中它的内部序列被缺失的pfk基因片段，以基本上等摩尔的量混合pfk的N-末端和C-末端区域的上述扩增产物，使用这种混合物作为模板以及SEQ ID NO54和NO55的合成DNA作为引物通过常规PCR获得基因扩增产物。按普通方法纯化PCR产物，然后用BamH I消化，并插入到上述pBS5T的BamH I位点。这个DNA用于转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(Takara Bio Inc.的产品)，将细胞铺在补充有100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml卡那霉素的LB培养基上并培养过夜。然后，挑选出现的白色菌落，分成单个菌落来获得转化体。从获得的转化体分离质粒，选择具有插入目标PCR产物的质粒，并命名为pBS5T-Δpfk。

MnSO4·7H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解产物和10μg/L生物素、用NaOH调节pH7.5)上，在25℃培养约60小时。得到的转化体在34℃摇动培养过夜，然后适当地稀释，平铺在补充有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex培养基上并培养30小时。作为所述质粒上的pfk基因片段和位于菌株ATCC13869的染色体上的相同基因之间同源重组的结果，可以在这种培养基上生长的菌株是在其中卡那霉素抗性基因和来自所述质粒的SacB基因被整合到其染色体中的菌株。

然后，将第一重组体在31.5℃在无卡那霉素的液体CM-Dex培养基中培养过夜，在合适的稀释之后，将它们铺在无卡那霉素、含10％蔗糖的Dex-S10培养基(10g/L葡萄糖、10g/L多蛋白胨、10g/L酵母提取物、1g/LKH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.01g/LMnSO4·4H2O、3g/L尿素、1.2g/L大豆水解产物、10μg/L生物素和2g/L醋酸钠、用KOH调节pH7.5)上，在34℃培养约30小时。结果，获得了菌株，其由于第二次同源重组看起来丧失了SacB基因并对蔗糖不敏感。

获得的菌株包括具有源自pBS5T-Δpfk的破坏型的pfk基因的那些，和具有野生型pfk基因的那些。为了证实pfk基因是破坏型还是野生型，使用在Dex-10琼脂培养基上培养的细菌细胞进行直接PCR分析。选择仅具有破坏型pfk的菌株，命名为ATCC13869ΔsucAΔpfk。

NO61)的位置171处用精氨酸取代谷氨酸产生的。使用野生型pfk基因作为模板以及用于导入所述突变的合成DNA作为引物通过交叉PCR可以获得这些序列。

(2)构建突变pfk基因和磷酸转酮酶基因的表达载体为了构建PFK表达载体，使用谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO54和NO55的合成DNA作为引物进行常规PCR。按普通方法纯化PCR产物，然后用Xba I和Kpn I消化，将含有pfk基因的基因片段插入到上述pVK9的Xba I-Kpn I位点。这个DNA用于转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(Takara Bio Inc.的产品)，将细胞铺在补充有100μM IPTG、40μg/ml X-Gal和25μg/ml Km的LB培养基上并培养过夜。然后，挑选出现的白色菌落，分成单个菌落来获得转化体。从获得的转化体分离质粒，选择具有目标基因的插入的质粒，命名为pVK9-PFK。

Km的LB培养基上并培养过夜。然后，挑选出现的白色菌落，分成单个菌落来获得转化体。从获得的转化体分离质粒，选择具有PS2_xfp和pfk的插入的质粒，命名为pVK9-PS2_xfp_PFK。

按以下方式获得粗酶溶液。收集对数生长期中的细菌细胞，用100mM Kpi缓冲液(pH8.2)洗涤，然后溶于相同的缓冲液中，随后超声破碎。通过超速离心(60000rpm，30min)分离可溶组分来获得粗酶溶液。以下显示在粗酶溶液中定量蛋白质浓度的方法。将粗酶溶液和已知浓度用于产生标准曲线的BSA溶液各自与CBB溶液(蛋白质分析CBB溶液，Nacalai

8-3通过降低PFK活性增加L-谷氨酸的产量(1)在含有足量生物素的条件下评估通过使用菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13869ΔsucAΔpfk，评估了PFK活性降低对L-谷氨酸发酵产量的影响。将通过在CM-Dex平板上培养菌株获得的每个菌株的细胞接种到培养基中，所述培养基在1L纯水中含有30g葡萄糖、1gKH2PO4、0.4g MgSO4、15g(NH4)2SO4、0.01g FeSO4·7H2O、0.01gMnSO4·7H2O、13.7ml大豆水解产物溶液、200μg盐酸硫胺素、300μg生物素和50g CaCO3(用KOH调节pH8.0)，并在31.5℃培养。完成培养之后，测量培养液中积累的L-谷氨酸的量和细菌细胞浓度(OD)。结果在图10中示出。结果显示，与表达野生型pfk基因的菌株相比，表达突变pfk基因的菌株显示了更高的L-谷氨酸产量。

(2)添加青霉素时的评估当培养开始后OD达到10到14的范围内时在多个生长点处，通过向上述培养基中添加青霉素G到4U/ml的终浓度，以停止细胞生长来获得均等的最终细菌量，来比较L-谷氨酸的产量。结果在图11中示出。上述结果显示，在导入磷酸转酮酶的菌株中PFK活性的降低对于改善L-谷氨酸的发酵产量是有效的。

实施例9使用其中磷酸转酮酶活性被增强的细菌评估L-谷氨酰胺生产使用菌株黄色短杆菌AJ11576(JP56-16479A)，评估了导入磷酸转酮酶基因对于改善L-谷氨酰胺发酵产量的影响。

将pVK9(用于对照的质粒)和pVK9-PS2_xfp(用于扩增动物双歧杆菌的xfp基因的质粒，其中天然启动子被PS2启动子取代)各自导入上述菌株黄色短杆菌AJ11576来获得表达磷酸转酮酶的菌株。具体地，通过电脉冲法用每种质粒转化菌株，铺在含有25mg/ml卡那霉素的CM2G培养基(5g/L葡萄糖、10g/L多蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L

CaCO3(用NaOH调节到pH6.8)，在31.5℃摇动培养直到糖类被完全消耗。完成培养之后，测量培养液中积累的L-谷氨酰胺的量和OD。结果在图12中示出。显示了与对照菌株相比，所有扩增了xfp基因的菌株都显示了高的L-谷氨酰胺产量。

虽然已经参考本发明的优选的实施方案详细地描述了本发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是可以进行各种变化和采用同等物，而不背离本发明的范围。所有在此引用的参考文件，包括优先权文件、RU 和US 60/644,562，都并入为本申请的部分以作参考。

权利要求 1.具有生产有用代谢物的能力的细菌，其中所述细菌被修饰以具有增加的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性。

2.根据权利要求1的细菌，其中所述有用代谢物源自乙酰辅酶A。

3.根据权利要求1的细菌，其中所述有用代谢物选自由L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、琥珀酸酯和聚羟基丁酸酯构成的组。

4.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌天然不具有D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的活性，并且其中所述细菌用编码D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖-6-磷酸磷酸转酮酶的DNA片段转化。

5.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌被进一步修饰以具有减少的6-磷酸果糖激酶的活性。

6.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌选自由肠杆菌科、棒状杆菌型细菌和芽孢杆菌属细菌构成的组。

7.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌属于埃希氏菌属或泛菌属。

8.生产有用代谢物的方法，包括在培养基中培养根据权利要求1至7中任一项的细菌，并从所述培养基和/或所述细菌收集所述有用代谢物。

9.根据权利要求8的方法，其中所述有用代谢物源自乙酰辅酶A。

10.根据权利要求9的方法，其中所述有用代谢物选自由L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、琥珀酸酯和聚羟基丁酸酯构成的组。

全文摘要 本发明提供了具有生产有用代谢物的能力的细菌，所述有用代谢物源自乙酰辅酶A，如L－谷氨酸、L－谷氨酰胺、L－脯氨酸、L－精氨酸、L－亮氨酸、L－半胱氨酸、琥珀酸酯和聚羟基丁酸酯，其中所述细菌被修饰从而增强D－木酮糖－5－磷酸磷酸转酮酶和/或果糖－6－磷酸磷酸转酮酶的活性。本发明还提供了使用所述细菌生产有用代谢物的方法。

尤里·I·科兹洛夫, 知念秋人, 泉井裕, 原吉彦, 安枝寿, 康斯坦廷·V·赖巴克, 埃卡特里纳·A·斯利文斯卡亚, 乔安娜·Y·凯塔什基纳 申请人:味之素株式会社