制备脂肪烷烃及其中间体烯烃的方法 优先权信息
本申请请求 2012 年 01 月 04 日向中国国家知识产权局提交的、 专利申请号为 .0的专利申请的优先权和权益， 并且通过参照将其全文并入此处。 技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及烃类化合物的制备方法。更具体地， 本发明涉及微生物、 适于转化微生物的系统、 制备重组微生物的方法、 生产烃类化合物 的方法、 烃类化合物以及制备生物燃料的系统。 背景技术
第一代生物柴油，主要以动植物油脂为原料油，通过化学法或酶法催化的酯交换工 艺来制备。这种生产方式的不足在于生产原料短缺、 甲醇的使用以及甘油副产物的去除 等问题。 目前， 在工业上用于制备生物柴油的主要油脂原料（如大豆油、 菜籽油等）同 时也是人类生活的必需品， 而大量种植油料作物又受到耕地不足、粮食供应不足、 天气 地理环境不适等多方面限制。
第二代生物柴油，则是近年来随着合成生物学和代谢工程的迅速发展，通过选择合 适的微生物并利用各种生物技术改造其代谢合成途径（如脂肪酸合成途径、异戊二烯合 成途径等）而获得的。 研究人员能利用微生物直接生产性能更加优越、 品质更高的新型 第二代生物柴油一一长链烷烃。但是第二代生物柴油的生产仍然受到微生物自身代谢途 径的限制， 得到的产物产量低、 副产物多。
因此， 目前利用生物方法生产燃料的方法， 仍有待改进。 发明内容
本发明旨在解决现有技术的问题之一。 为此， 根据本发明的一个方面， 本发明提出 了一种微生物。 根据本发明的实施例， 该微生物包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核 酸序列编码聚酮合酶基因 sgcE或其功能等同体。 利用根据本发明实施例的微生物， 能 够有效地生产烃类化合物。
根据本发明的实施例， 上述 t生物还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的一个实施例， 进一步包括第二核酸序列， 其中， 所述第二核酸序列编 码^ J旨酶基因 sgcElO或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例， 进一步包括第三核酸序列， 其中， 所述第三核酸序列编 码乙酰辅酶 A羧化酶基因或其功能等同体。
才艮据本发明的一个实施例， 所述乙酰辅酶 A羧化酶基因为选自 accA、 accB、 accC 和 accD的至少一种。 根据本发明的一个实施例， 进一步包括第四核酸序列， 其中， 所述第四核酸序列编 码烯醇还原酶基因 mupE、 fabl或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一 种。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为选自细菌、 真菌、 放线菌、 螺旋体、 支原 体、 衣原体、 立克次体、 病毒和酵母的至少一种。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为大肠杆菌。
根据本发明的第二方面，本发明还提出了一种适于转化微生物的系统。根据本发明 的实施例， 该适于转化微生物的系统包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核酸序列编码 聚酮合酶基因 sgcE或其功能等同体。 利用该系统， 能够转化微生物， 从而得到前述的 微生物， 进而可以有效地生产烃类化合物。
根据本发明的实施例， 上述适于转化微生物的系统还可以具有下列附加技术特征： 根据本发明的一个实施例， 进一步包括第二核酸序列， 其中， 所述第二核酸序列编 码^ J旨酶基因 sgcElO或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列被设置于不同的 载体上。
根据本发明的一个实施例， 进一步包括第三核酸序列， 其中， 所述第三核酸序列编 码乙酰辅酶 A羧化酶基因或其功能等同体。
才艮据本发明的一个实施例， 所述乙酰辅酶 A羧化酶基因为选自 accA、 accB、 accC 和 accD的至少一种。
根据本发明的一个实施例， 所述第一、第二和第三核酸序列被设置在相互不同的载 体上。
根据本发明的一个实施例， 进一步包括第四核酸序列， 其中， 所述第四核酸序列编 码烯醇还原酶基因 mupE、 fabl或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例， 所述第一、 第二、 第三和第四核酸序列被设置在相互不 同的载体上。
根据本发明的一个实施例， 进一步包括 IPTG-诱导型启动子， 其中， 所述第一、 第 二、 第三或第四核酸序列的至少之一被设置在所述 IPTG-诱导型启动子的控制之下。
根据本发明的一个实施例， 所述 IPTG-诱导型启动子为选自 T7启动子、 tac启动子 和 lac启动子的至少一种。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一 种。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为选自细菌、 真菌、 放线菌、 螺旋体、 支原 体、 衣原体、 立克次体、 病毒和酵母的至少一种。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为大肠杆菌。
根据本发明的第三方面，本发明提出了一种制备重组微生物的方法。根据太 日 ^ 实施例，该方法包括使用前面所述的适于转化微生物的系统转化微生物， 以便获得该重 组微生物。 利用该方法， 能够有效地制备重组微生物， 该重组微生物能够有效地生产烃 类化合物。
根据本发明的实施例，上述制备重组微生物的方法，还可以具有下列附加技术特征： 根据本发明的一个实施例， 所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一 种。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为选自细菌、 真菌、 放线菌、 螺旋体、 支原 体、 衣原体、 立克次体、 病毒和酵母的至少一种。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为大肠杆菌。
根据本发明的一个实施例， 所述重组微生物包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核 酸序列编码聚酮合酶基因 sgcE或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例， 所述重组微生物进一步包括第二核酸序列， 其中， 所述 第二核酸序列编码硫酯酶基因 SgcE10或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例， 所述重组微生物进一步包括第三核酸序列， 其中， 所述 第三核酸序列编码乙酰辅酶 A羧化酶基因或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例， 所述乙酰辅酶 A羧化酶基因为选自 accA、 accB、 accC 和 accD的至少一种。
根据本发明的一个实施例， 进一步包括第四核酸序列， 其中， 所述第四核酸序列编 码烯醇还原酶基因 mupE或其功能等同体。
根据本发明的第四方面，本发明还提出了一种生产烃类化合物的方法。根据本发明 的实施例， 该方法包括下列步骤： 培养微生物， 以便生产所述烃类化合物； 以及分离所 述烃类化合物， 其中， 所述微生物包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核酸序列编码聚 酮合酶基因 sgcE或其功能等同体。 利用该方法， 能够有效地生产烃类化合物。
根据本发明的实施例，上述用于生产烃类化合物的方法，还可以具有下列附加技术 特征：
根据本发明的一个实施例， 所述微生物进一步包括第二核酸序列， 其中， 所述第二 核酸序列编码硫酯酶基因 sgcElO或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物进一步包括第三核酸序列， 其中， 所述第三 核酸序列编码乙酰辅酶 A羧化酶基因或其功能等同体。
才艮据本发明的一个实施例， 所述乙酰辅酶 A羧化酶基因为选自 accA、 accB、 accC 和 accD的至少一种。
根据本发明的一个实施例， 所述烃类化合物具有化学式 CxHy, 其中 x=4-40的任意 整数， y=6-82的任意整数。
根据本发明的一个实施例， 所述烃类化合物为婦烃化合物。
根据本发明的一个实施例， 所述烯烃化合物为十五烯烃。
根据本发明的一个实施例， 进一步包括第四核酸序列， 其中， 所述第四核 床 码烯醇还原酶基因 mupE、 fabl或其功能等同体。
根据本发明的一个实施例， 所述烃类化合物为烷烃化合物。
根据本发明的一个实施例， 所述烃类化合物为十五烷烃。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一 种。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为选自细菌、 真菌、 放线菌、 螺旋体、 支原 体、 衣原体、 立克次体、 病毒和酵母的至少一种。
根据本发明的一个实施例， 所述微生物为大肠杆菌。
根据本发明的一个实施例， 进一步包括对所述烃类化合物进行氢化的步驟。
根据本发明的一个实施例， 所述氢化反应是在 10%Pd/C的作用下进行的。
根据本发明的一个实施例， 分离所述烃类化合物进一步包括： 使所述烃类化合物进 入有机相； 以及从有机相中纯化所述烃类化合物。
根据本发明的第五方面， 本发明还提出了一种烃类化合物， 其是通过前面所述的制 备烃类化合物的方法制备的。
根据本发明的实施例， 该烃类化合物可以用作生物燃料。
根据本发明的第六方面， 本发明还提出了一种制备生物燃料的系统， 包括： 生物反应器， 其中， 所述生物反应器中设置有前面所述的微生物， 用于在所述生物 反应器中产生烃类化合物。
根据本发明的实施例， 上述用于制备生物燃料的系统还可以具有下列附加技术特 征：
根据本发明的一个实施例， 进一步包括： 氢化装置， 所述氢化装置与所述生物反应 器相连， 以便从所述生物反应器接收所述烃类化合物， 并对所述烃类化合物进行氢化。
根据本发明的一个实施例， 所述氢化装置中设置有 10%Pd/C , 以便催化所述氢化反 应。
根据本发明的一个实施例， 所述氢化装置为耐高温高压的反应容器。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得 明显， 或通过本发明的实践了解到。 附图说明
本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明 显和容易理解， 其中：
图 6显示了大肠杆菌 WK1经 IPTG诱导后，其培养物进行提取后的 GC-MS结果图， 目标分子 C15H32 已经用箭头指出；
图 8显示了大肠杆菌 WK2经 IPTG诱导后，其培养物进行提取后的 GC-MS结果图， 目标分子 C15H32 已经用箭头指出；
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相 图描述的实施例是示例性的， 仅用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。
提供下列关于术语和方法的解释一遍更好的描述本发明，并指导本领域普通技术人 员实施本发明。 本文使用的 "包括" 表示 "包含" ， 单数形式的 "一个，， ， 除非上下明 确的另外指出。 例如， "包括一个细胞"指包含一个或者多个这类细胞， "包括硫酯酶" 指包含一种或者多种硫酯酶肽以及本领域普通技术人员已知的其同等物，等等。术语"或
者"是指陈述的可选择要素或者两个或更多个要素组合中的单个要素， 除非上下文明确 的另外指出。 例如短语 "生物燃料或者其中间体"是指生物燃料、 生物燃料中间体或者 生物燃料和生物燃料中间体两者的组合。
除非另外解释，所有本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员 通常的理解具有相同的含义。尽管与本文描述的类似或者等同的方法和材料可用于本发 明的实施或者实验， 但下文描述了适合的方法和材料。 所述材料、 方法和实施例子只是 说明性的， 而不是用于限制。根据下面的详细说明和权利要求， 本发明的其他特征将是 明显。
登录号： 贯穿本说明书的登录号来源于美国国立卫生研究院维护的 NCBI 数据库 (国立生物技术信息中心） 。 所述登录号是 2011年 3月 1 日由该数据库提供的。
酶分类号（ EC ):贯穿本说明书提供的 EC编号来自京都基因与基因百科全 ( l^-ntn Encyclopedia of Genes and Genomics ) 维护的 KEGG Ligand数据库， 这由东京大学部分 资助。 所述 EC编号是 201 1年 3月 1 日由该数据库提供的。 物。 碳源可以是各种形式， 包括但不限于聚合物， 糖、 酸、 醇、 醛、 酮、 氨基酸、
肽， 等等。 这些包括， 例如， 各种单糖诸如葡萄糖、 低聚糖、 多糖、 纤维素质、 木糖和阿拉 伯糖， 二糖， 诸如蔗糖、 饱和或者不饱和的脂肪酸、 琥珀酸盐、 乳酸盐、 乙酸盐、 乙醇， 等等， 或者其混合物。 此外， 碳源还可以是光合作用产物， 包括但不限于葡萄糖。
可检测的： 能够确定出现或者存在。 例如， 使用下面实施例子提供的方法， 从发酵 液中产物是可检测的。
DNA: 脱氧核糖核酸。 DNA是长链聚合物， 其包括大部分的有机体（一些病毒具 有包括核糖核酸 RNA的基因）的遗传物质。 DNA聚合物中的重复单位是 4种不同的核 苷酸， 其包括 4中碱基， 腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种， 所述碱基上结 合有脱氧核糖， 而磷酸基与所述脱氧核糖连接。 DNA分子中被称为密码子的是核苷酸 三联体编码肽的氨基酸。 术语密码子还指 mRNA中
3核苷酸的对应 （和互补）序列， 所述 DNA序列被转录成所述 mRNA。
内源的： 当在本文中对核酸分子和特定的细胞或者微生物使用时，是指位于细胞内 的核酸序列或者肽， 其不是利用重组工程技术导入细胞的。 例如， 当细胞最初从自然界 分离时， 已经存在于所述细胞中的基因。 即使调控序列诸如激活转录或者翻译的启动子 或者增强子序列已经通过重组技术被改变， 基因仍被认为是内源的。
外源的： 本文中对核酸分子和特定的细胞使用时，是指不是来源于自然界发现的特 定细胞的任意核酸分子。 因此， 一旦非天然存在的核酸分子被引入细胞， 则其被认为是 外源的。 对特定细胞来说， 天然存在的核酸分子也可以是外源的。 例如， 一旦从细胞 X 分离的完整编码序列被引入细胞 Y , 则该编码序列对细胞 Y来说是外源核酸， 即使 X 和 Y是相同的细胞类型。
表达： 基因的编码信息被转变为细胞的结构与功能诸如蛋白、 转移 RNA或者核糖 体 RNA的过程。表达的基因包括那些被转录为 mRNA然后被翻译为蛋白的基因， 以及 那些被转录为 RNA但不被翻译为蛋白的基因 （例如， 转移和核糖体 RNAs ) 。
发酵肉汤： 包括任意支持微生物生命（即主动代谢碳的微生物）的培养基。 发酵培 养基通常包含破源。 碳源是可以被微生物用作（利用或者不利用其他的酶）能量的任何 物。
烃： 包括那些包含元素碳（C )和氢（H ) 的化合物。 所有的烃都由碳骨架以及与 该骨架连接的氢原子构成。 有时， 该术语被用作术语 "脂肪烃" 的简称。 基本上存在 3 种类型的烃： （1 )芳香族烃， 其具有至少一个芳香环； （2 )饱和烃， 亦称为烷， 其缺 少汉键、 三键或者芳香键； 和（3 ) 不饱和烃， 其在碳原子之间具有一个或者多个双键 或者三键， 被分成： 烯烃、
炔和二烯。 液体的地盾提取的烃被称作石油或者矿物油， 而 气态的地质烃被称作天然气。所有这些均是作为制备有机化学品的原料的燃料 ^ ^ 的主要来源， 它们通常是石油地盾工具在地球表面下发现的。沉积岩中的石油储备是用 于能源和化学工业的烃的主要来源。烃在经济上非常重要， 因为它们包括了主要化石燃 料（煤、 石油、 天然气， 等等）和生物燃料以及塑料、 蜡、 溶剂和油类的成分。
分离的： "分离的" 生物学组分（诸如核酸分子、 蛋白或者细胞） 已经基本上从该 组分天然存在的其他生物学组分中分离或者纯化， 诸如其他染色体的和染色体外的 DNA和 RNA, 以及蛋白。 已经被 "分离的" 核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯 化的核酸分子和蛋白。 该术语还包括在宿主细胞中利用重组表达制备的核酸分子和蛋 白， 以及化学合成的核酸分子和蛋白。
微生物： 包括来自古细菌域、真细菌域和真核生物域的原核和真核微生物种， 后者 包括酵母和丝状酵母、 原生动物、 藻类或者更高等的原生生物。 术语 "微生物细胞" 可 以与 "微生物" 互换使用。
核酸分子：包括 RNA和 DN A分子，其包括但不限于， cDNA、基因组 DNA和 mRNA。 包括合成的核酸分子，例如那些化学合成或者重组产生的核酸分子。核酸分子可以是双 链或者单链的。 单链时， 核酸分子可以是正义链或者反义链。 此外， 核酸分子可以是环 状或者线性的。
可操作的连接： 当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与 第二核酸序列可操作的连接。 例如， 如果启动子影响编码序列的转录或者表达， 则所述 启动子与所述编码序列为可操作的连接。 通常， 可操作连接的 DNA序列是连接的， 并 且必要时在相同阅读框内连接两个蛋白编码区域。 作为单个信使 RNA串联转录的分离 基因的结构被称为操纵子。
因此将基因紧密相邻置于单个启动子的转录调节下， 例如在 质粒载体中， 则构成合成操纵子。
ORF (开放阅读框） ： 不含任何终止密码子的一系列编码氨基酸的核苷酸三联体 (密码子） 。 这些序列通常可以被翻译为肽。
过表达： 当基因的转录速率与其内源转录速率相比提高的时候。 在一些实例中， 过 表达还包括基因的翻译速率高于该基因的内源翻译速率。检测过表达的方法是本领域公 知的。 例如可以利用 RT-PCR评价转录的 RNA水平， 以及利用 SDS-PAGE凝胶分析评 价蛋白水平。
纯化的： 术语 "纯化的"并不需要绝对的纯度； 它只是一个相对术语。 因此， 例如， 纯化的生物燃料或其中间体是指比位于其细胞环境内的产物浓度更高的产物。
重组： 重组核酸分子或者蛋白， 其具有非天然存在的序列， 具有由人工组合序列的 两个另外分离的序列片段制备的序列，或者以上两者。例如可以通过化学合成或者人工 操作核酸分子或者蛋白的分离片段， 诸如遗传工程技术， 实现这种人工组合。 重组还用 于描述以下核酸分子， 它们已经被人工处理，但包含的调控序列和编码区与分离所述核
酸的生物体中发现的相同。重组细胞或者微生物是包含外源核酸分子诸如重组核酸分子 的细胞或者微生物。
转化或者重组细胞： 例如通过分子生物学技术， 已经被引入核酸分子（诸 2 s* 基辅酶 A合酶的核酸分子） 的细胞。 转化包括能够将核酸分子引入这类细胞的所有技 术， 包括但不限于， 利用病毒载体转染、 接合作用、 利用质粒载体转化、 通过电穿孔的 棵 DNA引入、 脂质体转染和颗粒枪加速。
在允许产物生成的条件下： 任何允许微生物产生所需产物（诸如烷烃、 烯烃等）的 发酵条件。发酵条件通常包括温度范围、 通气水平和培养基选择， 将上述条件组合时允 许微生物生长。 示例性培养基包括肉汤或者凝胶。 通常， 培养基包括碳源诸如葡萄糖、 果糖、纤维素或者可以被微生物直接代谢的类似物，或者可以在培养基中使用促进代谢 碳源的酶。 为了确定培养条件是否允许产物生成， 将微生物培养 8、
16或者 24小时， 收集并分析样品。 例如， 可以检测样品或者培养基（细胞在其中生长）的细胞中所需产 物存在。 当分析产物的存在时， 可以使用下面实例提供的那些方法。
载体：作为引入细胞从而产生转化细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在细胞中 复制的核酸序列，诸如复制原点。载体还可以包括一种或者多种选择性标志物基因和本 领域已知的其他遗传成分。
在本发明中所使用的术语 "第一" 、 "第二" 等类似的术语， 是为了区别的目的， 而不以任何方式表明或者暗示各自所表示术语之间的重要性的区别。 微生物
根据本发明的第一方面， 本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例， 该微生 物包括第一核酸序列， 该第一核酸序列编码聚酮合酶基因 sgcE或其功能等同体。 利用 该 ^鼓生物， 可以通过在微生物细胞内过表达聚酮合酶基因 sgcE或其功能等同体， 从而 发挥聚酮合酶的生物活性， 进而聚酮合酶可以与宿主微生物体内的固有基因相互作用， 从可再生碳源产生烃类化合物。发明人发现，
利用该微生物所得到的烃类化合物可以作 为生物燃料或者其中间体。在本文中所使用的术语 "功能等同体"是指这样的一种基因， 其能够在宿主细胞内发挥例如与 sgcE相同的功能，但在序列上与例如 sgcE有所区别的 基因，从而利用该功能等同体也能够有效地生产烃类化合物。通过在微生物中引入外源 DNA序列， 可以在微生物细胞内表达具有生物活性的蛋白， 这些蛋白能够代谢可再生
碳源以产生烃类化合物作为生物燃料或其中间体。 因此，可以将这些微生物用于生产烃 类化合物， 以便得到可以作为生物燃料或者生物燃料中间体的烃类化合物。
根据本发明的实施例， 第一核酸序列不受特别限制， 只要其能够编码 SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列 （即 NCBI登录号： AAL06699.1所描述的 sgcE蛋白序列） 即可。 根据本发明的具体示例， 第一核酸序列具有如 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列， 发明 人惊奇地发现， 当采用该核苷酸序列时， sgcE基因在微生物细胞尤其是在大肠杆菌细
胞中的表达效率可以得到显著地提高， 进而可以进一步提高生产烃类化合物的效率。
根据本发明的实施例，在微生物中还可以进一步包含编码其他基因的核酸序列，从 而赋予微生物额外的功能。根据本发明的实施例 ,在微生物中进一步包括第二核酸序列， 该第二核酸序列编码硫酯酶基因 sgcElO或其功能等同体。由此，通过硫酯酶基闵。《 Ρ 1 π 的生物学功能， 可以便于所合成的烃类化合物成为游离状态，从而便于最终分离回收烃 类化合物， 从而可以显著地提高，
将这些微生物应用于制备烃类化合物时的生产效率。
根据本发明的实施例 , 第二核酸序列不受特别限制 , 只要其能够编码 SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列（即 NCBI登录号： AAL06692.1所描述的 sgcElO蛋白序列）即可。 根据本发明的具体示例， 第二核酸序列具有如 SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列， 发明 人惊奇地发现， 当采用该核苷酸序列时， sgcElO基因在微生物细胞尤其是在大肠杆菌
细胞中的表达效率可以得到显著地提高， 进而可以进一步提高生产烃类化合物的效率。
根据本发明的一个实施例， 在该微生物中， 可以进一步包含第三核酸序列。 该第三 核酸序列编码乙酰辅酶 A羧化酶基因或其功能等同体。 根据具体的示例， 所采用的乙 酰辅酶 A羧化酶基因为选自 accA、 accB、 accC和 accD的至少一种。 由此， 可以显著 提高利用该微生物生产烃类化合物的生产效率。
根据本发明的一个实施例， 在该微生物中， 还可以进一步包括第四核酸序列。 该第 四核酸序列编码烯醇还原酶基因 mupE、 fabl或其功能等同体。 通过在该微生物的细胞 中过表达烯醇还原酶基因 mupE、 fabl或其功能等同体， 可以在 ^效生物细胞内就能够完 成对所合成烃类化合物的氢化过程， 由此， 可以直接获得饱和度较高的烃类化合物， 更 适于作为生物燃料，
从而可以显著提高生物燃料的制备效果。 根据本发明的实施例， 优 选过表达 Fabl或其功能等同体， 发明人惊奇地发现， Fabl在微生物细胞内能够实现更 好的兼容性， 从而与 MupE相比能够具有更高的烃类化合物生产效率。
根据本发明的实施例， 第四核酸序列不受特别限制， 只要其能够编码 SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列 （即 NCBI登录号： AAM12917.1所描述的 MupE蛋白序列）即可。 根据本发明的具体示例， 第四核酸序列具有如 SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列， 发明 人惊奇地发现， 当采用该核苷酸序列时， mupE基因在微生物细胞尤其是在大肠杆菌细
胞中的表达效率可以得到显著地提高， 进而可以进一步提高生产烃类化合物的效率。
在本发明中， 所使用的术语 "微生物，， 可以为真核微生物， 也可以为原核微生物。 其类型并不受特别限制。 例如， 根据本发明的实施例， 可以采用的微生物包括但不限於 细菌、 真菌、 放线菌、 螺旋体、 支原体、 衣原体、 立克次体、 病毒和酵母。 可以为上述 微生物的至少一种。根据本发明的实施例，优选采用大肠杆菌作为生产生物燃料的微生 物。
适于转化微生物的系统、 制备重组微生物的方法
根据本发明的实施例， 可以通过常规的分子生物学方法获得上述微生物。 由此， 本 发明还提出了一种适于转化微生物的系统。利用该系统可以通过常规的方法，将目的基 因引入微生物细胞中，从而得到前面所述的适于制备烃类化合物的微生物。根据本发明 的实施例， 该系统包括第一核酸序列 , 该第一核酸序列编码聚酮合酶基因 sgcE或其功 能等同体。 由此， 可以通过常规的分子生物学手段，
将第一核酸序列引入到微生物中， 从而可以在微生物细胞中过表达聚酮合酶基因 sgcE或其功能等同体。 进一步可以通过 在^ 1生物细胞内过表达聚酮合酶基因 sgcE或其功能等同体， 从而发挥聚酮合 活性， 进而聚酮合酶可以与宿主微生物体内的固有基因相互作用， 从可再生碳源产生烃 类化合物。
另外， 为了在微生物细胞中引入其他的核酸序列， 从而为所得到的重组微生物赋予 额外的生物学功能。 根据本发明的实施例， 在该适于转化微生物的系统中， 还可以具有 其他的核酸序列。根据本发明的实施例， 在该适于转化微生物的系统中可以进一步包括 第二核酸序列， 该第二核酸序列编码硫酯酶基因 sgcElO或其功能等同体。 从而可以借 助该适于转化微生物的系统， 在微生物中引入硫酯酶基因
sgcElO或其功能等同体。 由 此， 通过硫酯酶基因 sgcElO的生物学功能， 可以便于所合成的烃类化合物成为游离状 态， 从而便于最终分离回收烃类化合物， 从而可以显著地提高， 将这些微生物应用于制 备烃类化合物时的生产效率。根据本发明的一个实施例，在该适于转化微生物的系统中， 可以进一步包含第三核酸序列， 该第三核酸序列编码乙酰辅酶 A羧化酶基因或其功能 等同体。
才艮据具体的示例， 所采用的乙酰辅酶 A羧化酶基因为选自 accA、 accB、 accC 和 accD的至少一种。 由此， 可以通过借助该适于转化 t生物的系统， 在 t生物细胞中 引入乙酰辅酶 A羧化酶基因或其功能等同体， 从而借助乙酰辅酶 A羧化酶基因的生物 学功能， 可以显著提高利用该微生物生产烃类化合物的生产效率。根据本发明的一个实 施例， 在该适于转化微生物的系统中，
还可以进一步包括第四核酸序列， 该第四核酸序 列编码烯醇还原酶基因 mupE、 fabl或其功能等同体。 借助该适于转化微生物的系统， 能够有效地将适于转化微生物的系统引入到微生物细胞中。通过在该微生物的细胞中过 表达烯醇还原酶基因 mupE、 fabl或其功能等同体， 可以在微生物细胞内就能够完成对 所合成烃类化合物的氢化过程， 由此， 可以直接获得饱和度较高的烃类化合物， 更适于
作为生物燃料， 从而可以显著提高生物燃料的制备效果。 根据本发明的实施例， 优选过 表达 Fabl或其功能等同体， 发明人惊奇地发现， Fabl在微生物细胞内能够实现更好的 兼容性， 从而与 MupE相比能够具有更高的烃类化合物生产效率。
借助上述适于转化微生物的系统转化微生物的方法， 并不受特别限制， 可以为诸如 电穿孔、 磷酸钙沉淀、 DEAE-葡聚糖介导的转染、 脂质体介导的转染、 接合作用、 转导 等等， 可以将异源 DNA序列 （即前面所述的第一、 第二、 第三和第四核酸序列） 稳定 地或者瞬时引入宿主细胞， 所述异源 DNA序列参与产生生物燃料或其中间物。 根据本 发明的实施例， 对于稳定转化， 异源
DNA序列还包括选择性标志物， 诸如， 抗生素抗 性， 例如新霉素、 四环素、 氯霉素、 卡那霉素的抗性， 弥补营养缺陷型的基因等等。 由 此， 根据本发明的实施例， 本发明还提供了一种获得重组微生物的方法， 该方法包括使 用前面适于转化微生物的系统转化微生物， 以便获得所述重组微生物。 由此， 根据本发 明实施例， 所得到的重组微生物中可以包含异源核酸序列， 例如第一、 第二、
第三和第 四核酸序列。 关于这些核酸序列， 前面已经进行了详细描述， 在此不再赘述。
根据本发明的实施例， 将上述异源 DNA序列 （即前面所述的第一、 第二、 第三和 第四核酸序列）引入宿主细胞的顺序并不受特别限制。 既可以是同时引入到微生物细胞 中， 也可以是依次引入到微生物细胞中。 根据本发明的实施例， 可以将各个异 Τ Ν Δ 序列设置在不同的载体上， 例如各个核酸序列包含在不同的载体上。这些载体可以是本 领域中任何已知的表达载体。 合适的表达载体包括，
但不限于， 病毒载体， 诸如杆状病 毒载体， 噬菌体载体， 诸如噬菌体载体， 质粒， 噬菌体， 粘粒， fosmids , 细菌人工染 色体， 病毒载体（例如， 基于以下病毒的病毒载体： 牛疽病毒、 脊髓灰质炎病毒、 腺病 毒、 腺相关病毒、 SV40、 单纯疱疹病毒， 等等） ， 基于 P1的人工染色体， 酵母质粒， 酵母人工染色体， 和任意对目的特定宿主具有特异性的其他载体
（诸如大肠杆菌、 Pseudomonas pisum和酿酒酵母） 。 根据本发明的实施例， 表达载体上可以进一步包括 一种或者多种选择标记基因， 以提供用于选择转化宿主细胞的表型性状。所述选择标记 基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞存活或者生长必需的蛋白。没有转化包 含选择标记基因的载体的宿主细胞将不会在培养基中存活。通常的选择标记基因编码以 下蛋白： （a
)提供对抗生素或者其他毒素的抗性， 例如， 氨苄青霉素， 新霉素， 甲氨 喋呤或者四环素， （b )弥补营养缺陷型缺陷， 或者（c )提供复合培养基没有的重要营 养物， 例如， 编码杆菌 D-丙氨酸消旋酶的基因。 在可选的实施方式中， 选择标记基因 是提供氨苄青霉素或者卡那霉素抗性 （用于原核宿主细胞， 诸如大肠杆菌） 的基因。
根据本发明的实施例，该适于转化微生物的系统可以进一步包括表达调控序列（启 动子， 增强子， 等等） ， 以指导所编码基因产物的合成， 优选启动子， 更优选 IPTG- 诱导型启动子。 所述第一、 第二、 第三或第四核酸序列的至少之一被设置在所述 IPTG- 诱导型启动子的控制之下。 由此， 可以通过在 IPTG-诱导型启动子的控制下， 由此容易
通过启动子的调控，表达目的蛋白，从而实现烃类化合物的合成。根据本发明的实施例， 可以用于本发明的启动子可以来源于 4敖生物或者病毒， 包括 CMV和 SV40。 根据使用 的宿主 /载体系统， 表达载体可以使用大量合适的转录和翻译控制元件中的任意一种， 包括组成型和诱导型启动子， 转录增强子元件， 转录终止子， 等等（参见例如， Bitter et al. , Methods in
根据本发明的实施例， 用于原核宿主细胞的合适启动子包括， 但不限于能够识别 T4、 T3、 Sp6和 Τ7聚合酶的启动子， 噬菌体 λ的 PR和 PL启动子， 大肠杆菌的 trp、 recA、 热休克和 lacZ启动子， 枯草芽孢杆菌的 α -淀粉酶和∑特异性启动子， 杆菌噬菌 体启动子， 链霉菌启动子， 噬菌体 λ的 int启动子， pBR322 P -内酰胺酶基因的 bla启 动子，
根据本发明的实施例，用于真核宿主内使用的合适真核启动子的非限制性实例来源 于病毒， 包括小鼠金属硫蛋白 I基因的启动子； 疱疹病毒的 TK启动子； SV40早期启 动子； Rous肉瘤病毒启动子； 巨细胞病毒启动子； 酵母 gal4基因启动子； 和 IgG启动 子。
根据本发明的实施例， 合适的诱导型启动子包括不限于： 受体蛋白、 代谢物或者化 学制品影响的启动子。 具体地， 包括： 牛白血病病毒启动子、 金属硫蛋白启动孚 雲 米松诱导型 MMTV启动子、 SV40启动子、 MRP ροΙΠΙ启动子、 四环素诱导型 CMV启 动子以及来自 trp和 lac操纵子的启动子。
根据本发明的一些实施例， 前述的核酸序列可以被连接到组成型启动子上。 因而利 用该系统转化微生物所得到的重组微生物能够持续地表达外源基因，从而代谢合成烃类 化合物。
根据本发明的实施例， 上述适于转化微生物的系统， 可以转化的微生物的类型并不 受特别限制。 可以为真核微生物， 也可以为原核微生物。 其类型并不受特别限制。 例如， 根据本发明的实施例， 可以釆用的微生物包括但不限于细菌、 真菌、 放线菌、 螺旋体、 支原体、 衣原体、 立克次体、 病毒和酵母。 可以为上述微生物的至少一种。 根据本发明 的实施例， 优选用于转化大肠杆菌，
以便用于生产生物燃料。 烃类化合物及其生产方法和系统
根据本发明的实施例， 本发明还提出了一种生产烃类化合物的方法。 该方法包括下 列步骤： 培养^ t生物， 以便生产所述烃类化合物； 以及分离所述烃类化合物， 其中， 所 述微生物包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核酸序列编码聚酮合酶基因 sgcE或其功 能等同体。 通过在合适的条件下对根据本发明实施例的微生物进行培养， 在微生物细胞 中表达聚酮合酶 sgcE或其功能等同体的作用下，
微生物细胞通过对底物的代谢， 可以 合成烃类化合物。本领域技术人员可以通过对微生物以及所采用的外源核酸的载体进行 分析， 能够获得最适合的培养条件。
另外， 根据本发明的实施例， 微生物中还可以包含额外的核酸序列， 例如第一、 第 二、 第三和第四核酸序列。 关于这些核酸序列， 前面已经进行了详细描述， 在此不再赘 述。
根据本发明的实施例， 可以通过在培养微生物的过程中， 提高生物合成途径中间物 的细胞内浓度（例如，遗传修饰的宿主细胞的中间物浓度）以进一步提高终产物的产量。 有许多方式可以增加中间物的胞内浓度， 包括不限于， 增加培养基中生物合成途径底物 的浓度； 增强在生物合成途径中起作用的酶的催化活性； 增加底物 （例如， 初始底物） 的细胞内浓度， 所述底物是在生物合成途径中起作用的酶的底物；
通过本发明生产烃类化合物的方法， 可以有效地获得具有化学式 CxHy的烃类化合 物， 其中 x=4-40的任意整数， y=6-82的任意整数。 根据具体的示例， 可以有效地获得 十五烯烃。 # 居本发明的实施例， 通过在 ?生物中引入第四核酸序列， 即所述第四核酸 序列编码烯醇还原酶基因 mupE、 Fabl或其功能等同体。
可以有效地在微生物细胞中实 现对烯烃的还原， 获得烷烃化合物， 例如十五烷烃。 根据本发明的实施例， 优选过表达 Fabl 或其功能等同体， 发明人惊奇地发现， Fabl 在微生物细胞内能够实现更好的兼容 性， 从而与 MupE相比能够具有更高的烃类化合物生产效率。
另外， 根据本发明的实施例， 对于微生物所生产的烯烃， 例如十五婦烃。 可以通过 氢化反应的化学处理方法， 实现将其还原为烷烃。 根据具体的实例， 可以采用 1 < ?M/r 作为催化剂， 完成该氢化反应。
因此， 根据本发明的实施例， 可以有效地获得生物燃料， 或者其中间体。 因此可以 在产生有用生物燃料或其中间体的发酵过程中使用经过修饰的微生物，并且可以利用可 再生碳源 （生物质）作为起始原料。
根据本发明的实施例， 所采用的微生物的类型不受特别限制。 可以为真核微生物， 也可以为原核 ?生物。 例如， 根据本发明的实施例， 可以采用的 生物包括但不限于细 菌、 真菌、 放线菌、 螺旋体、 支原体、 衣原体、 立克次体、 病毒和酵母。 可以为上述微 生物的至少一种。 根据本发明的实施例， 优选釆用大肠杆菌， 以便用于生产生物燃料。 这是因为对于大肠杆菌或酵母而言， 易于遗传修饰，
易于控制生长、 产生以及减少或者 消除降低生物合成途径效率的副反应。此外，这种修饰的微生物可以直接利用可再生能 源以生产可直接用做生物燃料的燃料， 不需要专门的储存或运输方法。
通过使用特定的发酵技术可以增强生物燃料或者其中间体的生产和分离。例如， 产 生最大化并降低成本的方法是增加碳源百分比，所述破源被转变为烃类产物。在正常的 细胞生命周期中， 碳被用于细胞功能包括产生脂、 糖、 蛋白、 有机酸和核酸。 降低生长 相关活性必需的碳的量可以增加碳源转变为输出物的功效。这可以通过首先增殖微生物 到所需密度来实现， 诸如在对数生长期的顶峰实现的密度。 在这个时间点，
复制检查点 基因可用于终止细胞生长。输入的碳数转变为烃类产物的百分比是成本动因。效率越高 (即百分比更高） ， 成本越低。 对于含氧破源 （即基于葡萄糖和其他糖的来源） ， 氧必 须以二氧化碳的形式释放。每释放 2个氧原子， 还释放一个碳原子， 导致约 34% ( w/w ) 的最大理论代谢效率。 但是对于其他烃类产物和碳源来说， 该数字是变化的。 文献中通 常的效率是约小于
可以从发酵培养基中分离发酵期间生成的生物燃料或其中间体。可以使用任何已知 的从水介质分离烃类化合物的技术。本文提供一个示例性分离法是两相（汉相）分离法。 该方法涉及在足以产生生物燃料或者其中间体的条件下发酵遗传工程化的制备宿主，允 许在有机相中收集生物燃料或者其中间体， 并从水性发酵肉汤分离有机相。
双相分离利用生物燃料或者其中间体的相对不混溶性促进分离。不混溶是指化合物 相对不能溶于水， 由化合物的分配系数定义。 分配系数 P被定义为化合物在有机相（在 双相系统中， 有机相通常是生成过程中由生物燃料或者其中间体形成的相， 但是， 在一 些实例中可以提供有机相（诸如乙酸乙酯以促进产物分离））中的平衡浓度除以水相（即 发酵肉汤）中处于平衡状态的浓度。 当描述两相系统时， 通常采用
logP来描述 P。 logP 为 10的化合物将为有机相分配 10: 1 , 而 logP为 0.1的化合物将为水相分配 10: 1。 本领域普通技术人员将理解， 通过选择发酵肉汤和有机相使生成的烃类化合物具有高 logP值， 即使发酵容器中浓度非常低， 烃类化合物也将进入有机相。
通过本文所述方法产生的烃类化合物在发酵肉汤以及细胞质中是相对不混溶的。因 此，烃类化合物会在胞内或者胞外于有机相中聚集。产物在有机相中的聚集将 1 SS '? 化合物对细胞功能的影响， 这将允许制备宿主产生更多的产物。 换言之， 烃类化合物的 浓度不会对宿主细胞有显著的影响。
根据本发明的实施例，本发明还提供了一种烃类化合物，其实通过前述的制备烃类 化合物的方法所得到。 根据具体的实施例， 该烃类化合物， 可以用作生物燃料。 根据本 发明实施例的烃类化合物可以用作生物燃料或者其中间物， 即为烷烃或者烯烃。 为烷烃 者可以直接用作燃料，而为烯烃者则可以通过加氢还原或者酶催化法得到烷烃再用于燃 料。 本领域普通技术人员将理解， 根据燃料的预定目的，
可以制备和使用不同的烃类化 合物。 例如， 对于预期在寒冷气候中使用的汽车燃料， 可能希望支化烷烃， 因此利用本 文提供的教导， 可以制备支化烃。 利用本文描述的方法， 可以制备包括产物单一的烷烃 类燃料，其具有需要的燃料质量。与石油衍生的燃料或者源自甘油三酯的生物柴油相比， 它们不含杂质， 此外，基于烷烃类燃料可以与其他燃料或者燃料添加剂组合以产生具有 所需性质的燃料。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种制备生物燃料的系统，其包括生物反应 器和氢化装置。 根据本发明的实施例， 生物反应器中设置有根据本发明的微生物， 这些 微生物用于在生物反应器中产生烃类化合物。根据本发明的实施例， 氢化装置与生物反 应器相连， 可以从生物反应器中接受烃类化合物， 从而实现对烃类化合物的氢化。 如前 所述，可以通过化学处理地方法实现对烃类化合物的氢化，
例如可以在氢化装置中设置 有 10%Pd/C , 以便催化所述氢化反应。 为此， 根据本发明的一个实施例， 氢化装置可以 为耐高温高压的反应容器， 由此， 可以实现有效地将烃类化合物进行氢化处理。
关于在该系统中所采用的微生物， 前面已经进行了详细描述， 此处不再赘述。 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术 或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂 等译的《分子克隆实验指南》， 第三版，
科学出版社）或者按照产品说明书进行。 所用试剂 或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。
构建下列质粒用于在 BL21 ( DE3 )宿主细胞中引入外源核酸序列。 所有被克隆的基因 均在 IPTG-诱导型启动子（T7, tac或者 lac启动子）的控制下。
按照标准分子生物学方法， 进行基因的克隆和载体的构建， 简言之， 包括下列步骤： 将 sgcE基因克隆于 pET28a上。 质粒质粒 pWKl (图 1 )是 sgcE基因通过 BamH I和 Hindlll克隆于 pET28a载体而得到的。 将构建得到的质粒 pWKl转化到含质粒 pMSD8的大 肠杆菌 BL21(DE3)中， 得到大肠杆菌菌株 WK1。 实施例
2生产作为生物燃料的烃类化合物
在 37摄氏度过夜培养的大肠杆菌 WK1种液， 按体积比 1 : 100的比例稀释到 200ml 的 LB培养基中； 在 37摄氏度培养 3小时后， 在大肠杆菌 WK1的 OD600 为 0.4-0.6时， 加入 IPTG (异丙基- β -D-硫代半乳糖苷 )至终浓度为 0. ImM; 在加入 IPTG诱导 15-20小时 后， 用乙酸乙酯萃取菌液， 有机相回收后旋转蒸发溶剂干燥至
实验结果： 在大肠杆菌 WK1 菌体沉淀中可以明显的检测到生物柴油正十五烷 C15H32 (图 6 )。 说明通过在大肠杆菌中引入 sgcE, 能够有效地得到烷烃化合物。 实施例 3
I和 Xho I酶切质粒 pWKl后， 回收 sgcE基因片段； 将 sgcE基因片段和 pWK2载体片段相连接， 转化入大肠杆菌， 通过 卡那霉素抗性筛选和酶切验证鉴定 sgcE片段正确插入的克隆， 即得到质粒 pWK4 (图 4 )。
将构建得到的质粒 pWK4转化到含质粒 pMSD8的大肠杆菌 BL21(DE3)中，就得到大肠 杆菌菌株 WK2。
实施例 4生产作为生物燃料中间体的烃类化合物
在 37摄氏度过夜培养的大肠杆菌 WK2种液， 按体积比 1 : 100的比例稀释到 200ml 的 LB培养基； 在 37摄氏度培养 3小时后， 大肠杆菌 WK2的 OD600 为 0.4-0.6时， 加入 IPTG (异丙基 - β -D-硫代半乳糖苷）至终浓度为 O. lmM; 在加入 IPTG诱导 15-20小时后， 用乙酸乙酯萃取菌液， 有机相回收后旋转蒸发溶剂干燥至
实验结果： 在大肠杆菌 WK2菌体沉淀中可以明显的检测到生物柴油前体十五烯 C15H18
(图 7 )和少量的 C15H32 (图 8 )。 结果显示通过基因工程改造的大肠杆菌 WK2能用于生产 生物柴油前体十五烯 C15H1S。
将得到的烯烃进行加氢还原可以得到 C15H32。 简言之： 将得到的烯烃沉淀收集在能耐 高温高压的 500ml圆底烧瓶中， 加入 10% Pd/C。 将反应容器密封， 排除空气， 5分钟后通 入氢气， 使压力在 25摄氏度下上升到 35 psi， 边反应边搅拌反应物直到不能在观察到液滴， 反应大约需要 16个小时来完成。 实施例 5
按照标准分子生物学方法， 进行基因的克隆和载体的构建， 简言之， 包括下列步骤： A)将 mupE基因克隆于 pET28a上
将构建得到的质粒 pWK7转化到含质粒 MSD8的大肠杆菌 BL21(DE3)中，就得到大肠 杆菌菌株 WK3。 实施例 6
在 37摄氏度过夜培养的大肠杆菌 WK3种液， 按体积比 1 : 100的比例稀释到 200ml 的 LB培养基；在 37摄氏度培养 3小时后，大肠杆菌 WK3的 OD600 为 0.4-0.6时加入 IPTG (异丙基- P -D-硫代半乳糖苷）至终浓度为 O.lmM; 在加入 IPTG诱导 15-20小时后， 用乙 酸乙酯萃取菌液， 有机相回收后旋转蒸发溶剂千燥至 l-2ml。
将得到的烯烃进行加氢还原得到 C15H32。 将得到的烯烃沉淀收集在一个能耐高温高压 的 500ml圆底烧瓶中， 加入 10% Pd/C。 将反应容器密封， 排除空气， 5分钟后通入氢气， 使压力在 25。 C上升到 35 psi,边反应边搅拌反应物直到不能在观察到液滴，反应大约需要 16个小时来完成。 工业实用性
本发明的烃类化合物的制备方法， 能够有效地生产烃类化合物， 该烃类化合物可以 用作生物燃料。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人员将会理解。 根据已 经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明 ^ 围之内。 本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中， 参考术语 "一个实施例"、 "一些实施例"、 "示意性实施例"、 "示 例"、 "具体示例"、 或 "一些示例" 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结 构、 材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语 的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或
者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
