• 【医】 N.N.N.培养基(含琼脂、盐、兔血,用以培养黑热病病原体)

• n. (= Satyendra N. Bose) 萨特延德拉·纳特·玻色（印度物理学家，专门研究数学物理，玻色子就是以他的名字命名的 ）

• 【医】 数值口径, 光口

• 稳压(流)器,调节剂,校准器

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种高纯度NK细胞的分离培养方法。

cell，NK)是机体重要的免疫细胞，作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。近年来，NK细胞因其细胞杀伤活性高，起效快，且不受MHC限制等优点，相对于αβT细胞，γδT细胞和CIK等其它用于免疫治疗的细胞NK细胞受到了更广泛的关注和临床应用。

但是NK细胞数量较少，在外周血中仅占淋巴细胞的10％-15％，在脐带血中NK的含量更低，只有5％左右，正常人体外周血中和脐带血中NK细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。NK细胞的数量和纯度是临床疗效的重要影响因素，NK细胞数量太少不能达到治疗的效果，纯度低则会影响对肿瘤的杀伤作用。尤其是临床上多采用健康供者的血液来制备NK，然后采用同种异体回输以达到治疗目的，这就对所回输NK细胞的纯度要求比较高，如果其中混入过多T细胞B细胞等杂细胞则会引起机体的排斥反应。因此，如何分离制备得到高质量高纯度的NK细胞成为其临床应用中亟待解决的问题。

目前，国内外已经有大量的研究者进行了人NK细胞的培养和生物治疗方面的研究，但培养得到的NK细胞存在数量较少、或纯度较低、或杀伤活性低等问题，不能满足实际应用的需要。例如：公开号为CN A的专利申请，报道了一种NK细胞体外活化扩增培养的方法，其培养过程中不仅需要添加饲养细胞，虽然可在体外大量扩增NK细胞，但是安全性问题和回输到体内后并无饲养层细胞，体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响是其无法回避的问题。

公开号为CN A的专利申请报道了一种NK细胞的培养方法，培养15天后，NK细胞仅扩增139.5倍，数量仍较少，而且杀伤活性较低。

公开号为CN A的专利申请报道的NK细胞体外培养方法，得到的培养产物中，NK细胞仅扩增102.81±94.06倍，而且采用传统的Ficoll法密度梯度离心法分离NK细胞，数量和纯度不佳。

因此，急需对NK细胞的制备方法进一步改进，以制备高产量、高纯度、杀伤活性好的NK细胞。

本发明旨在克服现有外周血/脐带血NK细胞体外分离、纯化、扩增方法的不足，提供一种高产量、高纯度NK细胞的分离培养方法。

本发明提供了一种用于分离培养高纯度NK细胞的试剂盒，它包含培养基1-3；其中，

培养基1是在无血清培养基中，添加终浓度为500-1000U/mL的IL-2、终浓度为30-50μg/mL的IL-15和终浓度为5-10％的添加物组成；

培养基2是在无血清培养基中，添加终浓度为500-1000U/mL的IL-2组成；

培养基3是在无血清培养基中，添加终浓度为500-1000U/mL的IL-2和终浓度为5-10％的添加物组成；

其中，所述无血清培养基为淋巴细胞培养用无血清培养基；所述添加物为：自体血浆、胎牛血清或市售血清替代物。

淋巴细胞培养用无血清培养基：即适合淋巴细胞生长的无血清培养基。

自体血浆：指与所取NK细胞为同一个体的血浆；自体血浆作为NK细胞分离中的副产物，可用于后续的NK细胞活化培养。

其中，所述淋巴细胞培养用无血清培养基为AIM-V培养基、X-VIVO 15培养基、GT-T551H3培养基或Alys-505N培养基。

其中，它包含培养基1-3；其中，

培养基1是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2、终浓度为30μg/mL的IL-15和终浓度为10％的自体血浆组成；

培养基2是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2组成；

培养基3是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2和终浓度为5％的自体血浆组成。

本发明还提供了一种高纯度NK细胞的分离培养方法，它使用了上述试剂盒，步骤如下：

c、对步骤a得到的NK细胞，加入培养基1，37℃下孵育30min，然后取未贴壁的细胞悬液转入步骤b已包被抗体的培养瓶中，培养；

d、第3天，加入等体积培养基2，继续培养；第6天，加入培养基3，继续培养；每2天加入培养基2，培养至14天，即可。

其中，步骤a中，富集方法如下：

(1)取外周血或脐带血，抗凝后离心，吸取上清血浆灭活，再次离心；弃去沉淀，用PBS补充血浆的量，混匀；

(3)用PBS+2％FBS溶液重悬，混匀后加至淋巴分离液上，离心，收集白膜层细胞；然后用PBS+2％FBS溶液洗涤两次，收集细胞沉淀，即可。

其中，步骤(1)中，抗凝后离心的条件为800g，8min；再次离心的条件为600g，10min。

其中，步骤(1)中，灭活的方法为：56℃水浴30min。

其中，步骤(2)中，离心的条件为：1200g，20min。

其中，步骤b中，包被方法如下：

本发明还提供了上述方法制备的NK细胞产物。

本发明方法具有如下优点：

1、本发明方法得到的NK细胞纯度高达98％以上，排除了T细胞，Treg细胞，B细胞的污染，对肿瘤细胞的杀伤活性高，可满足美国NHLBI(National heart,lung and blood Insititute)用于同种异体回输的标准(CD3-CD56+NK细胞达到90％以上，CD19+B细胞和CD3+T细胞低于5％)，不但可用于自体NK回输，也可以用于同种异体NK的回输。

2、本发明方法不需要在整个培养阶段都添加多种活化因子，只在前三天活化诱导的时候加入IL15和IL2激活NK细胞，在后期的培养中只需维持IL2的浓度无需添加IL15，降低了培养成本，适用于临床大规模培养。

3、本发明方法培养过程中不依赖于饲养细胞,提高了使用安全性，同时避免了回输后由于体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响。

4、本发明方法分离纯化及体外扩增时间短；而且操作简单，减少了中间环节污染的可能性。

因此，本发明提供的试剂盒及分离培养方法，可以从外周血或脐带血中高效获得满足临床使用的NK细胞，细胞数量多，可扩增200-1000倍；纯度高、杀伤活性好，在同种异体NK回输方面具有突出优势；而且本发明方法操作简单、分离培养时间短，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

图1表示分离纯化前和分离纯化后NK细胞所占淋巴细胞的比率,A，分离纯化前全血中NK细胞所占淋巴细胞的比率；B，为对比Ficoll法初步分离纯化；C为本发明所用方法初步分离纯化；

图2表示培养14天CD3-CD56+NK细胞的阳性率,A为对比Ficoll法分离培养，B为本发明所用方法分离培养。

图3表示扩增培养14天NK细胞的扩增倍数。

图4表示扩增培养14天NK细胞对K562细胞的杀伤活性，效靶比为1：1和1：2，A和B为对比Ficoll法分离培养，效靶比为1：1和1：2；C和D为本发明所用方法分离培养，效靶比为1：1和1：2。

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，如无特殊说明，均是通过商业途径获得。

实施例1本发明分离培养方法

一、NK细胞的分离培养

1、外周血/脐带血单个核细胞的分离和NK细胞分选

外周血采集：来源于肿瘤患者或健康志愿者自体外周血30～60mL；

脐带血采集：来源于健康足月胎儿的脐带血70～90mL；

采用枸橼酸钠，或肝素钠抗凝采血管或采血袋采集新鲜血液，采集至NK分离制备时间不超过24小时。

用75％的酒精擦拭全血采集管，将抗凝全血倾倒入50ml离心管中混匀，取0.5mL抗凝血用于细胞五分类计数和流式检测。离心条件：离心力800g,离心8min,吸取上清血浆置于另一离心管中，于56℃水浴中灭活30min后600g离心10min。离心后弃去沉淀，将上清装于新的离心管中置于4℃冰箱备用(即为自体血浆)；

Cocktail(StemCell公司)50ul，充分混匀；室温孵育20分钟。配制体积分数为2％FBS的PBS溶液(PBS购自Hyclone公司)，并用等体积的PBS+2％FBS溶液重悬抗凝血，轻轻混匀；将稀释好的抗凝血缓慢加至淋巴分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，LTS1077)上。1200g离心20min；收集白膜层细胞；PBS+2％FBS洗涤两次富集的自然杀伤细胞；弃上清，收集细胞沉淀用于NK培养。

2、NK细胞活化和扩增

Herceptin(购自Rhoche pharma,440mg/瓶)用PBS稀释，使抗体终浓度为20μg/mL,将5mL稀释好的抗体加入T75细胞培养瓶中，轻轻转动，使抗体均匀铺满底面，将培养瓶放于37℃孵箱里包被2小时，或将培养瓶放于4℃冰箱，包被过夜。包被好的培养瓶可放于4℃冰箱保存一个月，使用前用PBS清洗两次；

将收集的细胞沉淀洗涤后取0.5mL进行计数和流式检测，比较分离纯化前后NK细胞所占的比率。如图1所示，分离纯化前外周血中CD3-CD56+NK细胞占淋巴细胞的比率占3.8％(图1A)，用本发明所使用的RosetteSep^TMEnrichment Cocktail方法分离纯化后，CD3-CD56+NK细胞比率可达到88.3％(图1C)，在此基础上进行下一步的活化和扩增可得到高纯度的NK细胞。

剩下的细胞加入无血清初始培养基(AIM-V培养基，可用其它适合淋巴细胞培养的培养基来代替，例如X-VIVO 15培养基，GT-T551H3培养基，Alys-505N培养基)轻轻吹打至细胞均匀分散，所述无血清初始培养基包含IL-2，IL-15和10％自体血浆，细胞接种浓度为1×10⁶/mL；将细胞接种于细胞培养皿里，于37℃孵箱里孵育30min，取出轻轻吹打，将未贴壁的细胞悬液转入已包被抗体的T75细胞培养瓶中；IL-2的浓度为500U/mL；IL-15的浓度为30μg/mL；

培养第3天观察细胞的状态，是否出现细胞集落，培养基的颜色，加入等倍体积的无血清初始培养基，所述无血清初始培养基包含IL-2，IL-2的浓度为500U/mL；

第6天观察细胞状态，细胞计数，补充新鲜培养基调整细胞密度为0.5-1×10⁶/mL，该新鲜培养基含IL-2和5％自体血浆的临床级无血清培养基，新鲜培养基中IL-2的浓度为500U/mL；

每两天观察细胞状态，细胞计数，补充新鲜培养基调整细胞密度为0.5-1×10⁶/mL，该新鲜培养基含IL-2的临床级无血清培养基，新鲜培养基中IL-2的浓度为500U/mL；

培养至第14天，收获处于对数生长期的NK细胞。

对比例1 Ficoll法分离后的培养

一、NK细胞的分离培养

1、外周血/脐带血单个核细胞的分离和NK细胞分选

外周血采集：来源于肿瘤患者或健康志愿者自体外周血30～60mL；

脐带血采集：来源于健康足月胎儿的脐带血70～90mL；

采用枸橼酸钠，或肝素钠抗凝采血管或采血袋采集新鲜血液，采集至NK分离制备时间不超过24小时。

取50mL外周血或脐带血，经800g×8min离心后，取上清备用。剩余抗凝血与PBS 1：1充分混匀。在离心管中加入等体积的Ficoll淋巴细胞分离液,用吸管沿管壁将血液缓慢加于分离液面上，注意保持界面清晰。550g离心30min，离心后取中间的白膜层，即可。

2、NK细胞活化和扩增

Herceptin(购自Rhoche pharma,440mg/瓶)用PBS稀释，使抗体终浓度为20μg/mL,将5mL稀释好的抗体加入T75细胞培养瓶中，轻轻转动，使抗体均匀铺满底面，将培养瓶放于37℃孵箱里包被2小时，或将培养瓶放于4℃冰箱，包被过夜。包被好的培养瓶可放于4℃冰箱保存一个月，使用前用PBS清洗两次；

将收集的细胞沉淀洗涤后取0.5mL进行计数和流式检测，比较分离纯化前后NK细胞所占的比率。如图1所示，分离纯化前外周血中CD3-CD56+NK细胞占淋巴细胞的比率占3.8％(图1A)，用Ficoll分离法分离纯化后(图1B)，CD3-CD56+NK占淋巴细胞的比率为5.3％，可在此基础上进行下一步的活化和扩增。

剩下的细胞加入无血清初始培养基(AIM-V培养基，可用其它适合淋巴细胞培养的培养基来代替，例如X-VIVO 15培养基，GT-T551H3培养基，Alys-505N培养基)轻轻吹打至细胞均匀分散，所述无血清初始培养基包含IL-2，IL-15和10％自体血浆，细胞接种浓度为1×10⁶/mL；将细胞接种于细胞培养皿里，于37℃孵箱里孵育30min，取出轻轻吹打，将未贴壁的细胞悬液转入已包被抗体的T75细胞培养瓶中；IL-2的浓度为500U/mL；IL-15的浓度为30μg/mL；

培养第3天观察细胞的状态，是否出现细胞集落，培养基的颜色，加入等倍体积的无血清初始培养基，所述无血清初始培养基包含IL-2，IL-2的浓度为500U/mL；

第6天观察细胞状态，细胞计数，补充新鲜培养基调整细胞密度为0.5-1×10⁶/mL，该新鲜培养基含IL-2和5％自体血浆的临床级无血清培养基，新鲜培养基中IL-2的浓度为500U/mL；

每两天观察细胞状态，细胞计数，补充新鲜培养基调整细胞密度为0.5-1×10⁶/mL，该新鲜培养基含IL-2的临床级无血清培养基，新鲜培养基中IL-2的浓度为500U/mL；

培养至第14天，收获处于对数生长期的NK细胞。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1两种方法获得的NK细胞鉴定及扩增倍数比较

分别测定实施例1及对比例制备的NK细胞产物，如下：

测定培养14天的CD3-CD56+NK细胞所占比率，方法如下：

在培养第0天和第14天分别取细胞培养液，PBS洗涤两次，洗涤后调整细胞浓度为5×10⁶/mL，加入流式抗体，室温壁光20min,洗去多余抗体，PBS重悬进行细胞表型的流式测定。所有抗体来自BD公司。

结果显示，经过14天的培养，用本发明方法培养CD3-CD56+NK细胞的阳性率为99.9％(图2B)，而对比例分离培养CD3-CD56+NK细胞的阳性率为55.4％(图2A)。

二、NK细胞的扩增倍数测定

测定培养14天的CD3-CD56+NK细胞扩增倍数，方法如下：

分别在第6、8、10、12、14天从不同志愿者外周血中培养的细胞，用台盼蓝染色后计数，计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第0天)，数值即为细胞的扩增倍数，经过本发明方法培养的细胞可扩增200-1000倍(图3)，细胞数可达到3-8×10⁹，可满足临床使用的需要。

而对比例方法的扩增倍数与本发明方法相当，但由于其杂细胞较多，特别是CD3+T细胞所占比率高，不适于临床使用。

而且，发明人考察了使用本发明分离培养用试剂盒与市售的NK扩增Kit的扩增效果，结果表明，使用本发明试剂盒中的联合用培养基对NK细胞的扩增倍数在数值上有一定优势，与商品化试剂盒扩增效果相当，甚至还更好。

可见，本发明方法获得的NK细胞数量多，分离培养效果好。

试验例2两种方法所得NK细胞对K562细胞杀伤活性比较

分别取实施例1及对比例制备的NK细胞产物，比较杀伤活性，

以处于对数生长期的K562细胞作为靶细胞，收集靶细胞，加入PBS缓冲液，离力条件为离心力250g,室温离心5min，洗涤2次后，细胞计数，用CFSE缓冲液调整K562的密度10×10⁶/ml,将CFSE加入细胞悬液中，终浓度为5μmol/ml。轻轻混匀后至于37℃，5％CO2的培养箱中孵育20min。孵育好后，加入十倍体积的预冷PBS，4℃，250g/min,离心5min，洗涤两次。

收集培养14天处于生长对数期的NK细胞，500g,室温离心5min,用PBS洗涤2次后，用10％FBS的1640培养基重悬。

将处理好的NK细胞与CFSE标记的K562细胞按效靶比1：1和2：1，加入24孔无菌细胞培养板中；并设只加CFSE标记的K562细胞和NK细胞作为对照孔，用于检测K562细胞和NK细胞的自发死亡率；用10％FBS的1640培养基补齐每孔的体积。将细胞培养板置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育4h。

计算公式：杀伤细胞毒性(％)＝(靶细胞死亡率-靶细胞自发死亡率)/(100-靶细胞自发死亡率)×100％

杀伤活性检测结果：见图4。

可见，本发明方法分离培养的NK细胞在效靶比为1：1和1：2时对K562细胞的杀伤分别为66.4％和84.6％,而对比例分离培养的NK细胞相应数值分别为19.3％和25.8％。可见，本发明方法培养的NK细胞对靶细胞具有良好的杀伤活性，优于对比例方法。

综上，本发明提供的分离培养方法，可以从外周血或脐带血中高效获得满足临床使用的NK细胞，细胞数量多、纯度高、杀伤活性好，在同种异体NK回输方面具有突出优势，而且本发明方法操作简单、分离培养时间短，具有良好的应用前景。