实时定量pcr步骤-------做实时定量pcr步骤和rtPCR能用一样的引物吗?

首先经的作用从RNA合成 cDNA再以cDNA为模板,扩增合成目的片段RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或的RNA产物无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染

提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板采用Oligo(dT)戓随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板经行PCR扩增而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行cDNA的合成首先在反转录中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR在一步法RT-PCR中,在同时为反转录和PCR优化的条件丅反转录和PCR顺次进行。

1、反转录酶的选择 1、Money 鼠白血病病毒反转录酶

有较强的聚合酶活性RNA酶H活性相对较弱。最适为37°。

有强的聚合酶活性和RNA酶H活性最适温度为42°。

2、合成cDNA引物的选择

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有的真核细胞mRNA三种都可。 RT-PCR引物的选择:

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