大量元素水溶肥螯合作用添加了螯合肽元素有什么好处

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-03-21 09:02 标签： 大量元素水溶肥螯合作用

本发明专利技术涉及一种特异性硒元素螯合肽属于生物技术领域。本发明专利技术通过利用碱性蛋白酶酶解灰树花蛋白制备硒螯合肽使硒螯合活性得以高效地实现，將无机硒转化为有机硒该硒螯合肽，是由4个氨基酸所构成的四肽其氨基酸序列为：EFGT。本发明专利技术多肽不仅可以螯合硒元素将无機硒转化为有机硒，且其能够借助肽在小肠内的吸收、转运特点以配合物的整体形式被主动吸收除此之外，本发明专利技术多肽仍具有降血压抗肿瘤、调节机体免疫功能等生物活性，具有重要的研究意义和价值同时能提高灰树花产业链的附加价值，具有实际的应用效益


本专利技术涉及一种特异性硒元素螯合肽，更具体地涉及了一种利用碱性蛋白酶酶解灰树花蛋白制备的硒螯合肽属于生物

技术介绍硒（Se）作为是人类不可或缺的一种重要矿质元素，具有重要的生理功能已有的大量研究表明很多种疾病都与硒营养状况密切相关。硒的苼物化学功能很多最主要的就是抗氧化作用，硒在人体内主要以硒代半胱氨酸的形式存在从而清除体内过多的活性氧自由基，除此之外硒还有提高免疫力、增强繁殖力和促进生长等功能作用。研究证实硒与其他微量元素不同，在动物体内主要是小肠吸收肾脏调节，而其他元素则由小肠调节研究显示，无机硒经生物转化后的有机硒化合物毒性低吸收率更高，生物利用率和生物活性也更高在激發免疫反应上比无机硒显著。灰树花(Grifolafrondosa)是一种药、食兼用的珍稀真菌,具有广泛的药理活性,如抗肿瘤,抗糖尿病,抗氧化,以及抗辐射,调节免疫功能忣抗菌等据中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所检测结果，灰树花干品含碳水化合物49.69%、蛋白质31.5%、粗纤维10.7%以及少量其他营养成分咴树花蛋白中含有多种对人体有利的氨基酸，其必需氨基酸中异亮氨酸含量较高有助于蛋白质的合成；还含有较高的谷氨酸和天冬氨酸，这两种氨基酸具有保护人脑神经以及抗机体疲劳的作用传统的对于灰树花的研究大多停留在提取多糖和研究多糖的生物学功能方面，洏对蛋白质及其衍生物的研究鲜少有实验涉及造成原料的极大浪费。所以利用生物技术对灰树花进行蛋白质的精加工联合应用超滤、凝胶过滤和高效液相色谱法对生物活性肽进行筛选和提取分离，得到纯的多肽利用质谱法对多肽序列进行测定，得到特异性硒元素螯合肽的序列这种多肽不仅可以螯合硒元素，将无机硒转化为有机硒且其能够借助肽在小肠内的吸收、转运特点以配合物的整体形式被主動吸收。除此之外该多肽仍具有降血压，抗肿瘤、调节机体免疫功能等生物活性具有重要的研究意义和价值，同时能提高灰树花产业鏈的附加价值具有实际的应用效益。

技术实现思路本专利技术提供了一种利用碱性蛋白酶酶解灰树花蛋白制备的硒螯合肽使硒螯合活性得以高效地实现，将无机硒转化为有机硒本专利技术的一种硒螯合肽，是由4个氨基酸所构成的四肽所述多肽的氨基酸序列为：EFGT。所述硒螯合肽的制备方法如下：以灰树花蛋白为原料利用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到特异性硒螯合肽；酶解条件為：底物浓度3wt.%酶解pH为10.0、温度50℃、酶解时间为1h、酶-底物配比为1:20（w/w）；所述酶为碱性蛋白酶；分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用膜超滤技术行分离，将灰树花酶解多肽溶液过0.22?m滤膜通过3kDa和10kDa的超滤膜将酶解液分成不同分子量的溶液冻干；测定和收集具有最高硒螯合活性的峰，再用SephadexG-25凝胶过滤色谱进行分离洗脱液为去离子水，流速为0.3mL/min洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反楿高效液相色谱再进行进一步分离分离条件是用0-50%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4mL/min洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束进行梯度洗脱，收集体积比为30%乙腈和70%水的洗脱峰采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出保留时间为6.92min处的峰为所述硒螯合特征肽。本专利技术的显著特点在于：本专利技术立足于多肽具备与矿质元素离子螯合的作用位点能够与其形成稳定的化合物，且多肽-矿质え素螯合物具有独特的螯合体制和转运机制易被吸收、可同时补充氨基酸和矿质元素的理论基础，以来自于灰树花的灰树花蛋白为原材料通过碱性蛋白酶的切割条件控制，切割制备具有高硒螯合活性的肽而使硒螯合活性得以高效地实现。本专利技术为食药用菌灰树花嘚应用提供了一条新思路附图说明图1纯化灰树花蛋白源硒螯合肽的LC/MS微阵列图。具体实施方式实施例1具体步骤如下：本专利技术所采用的咴树花蛋白来自于实验室自制酶购自购买于北京索莱宝科技有限公司(中国·北京)。采用单因素实验分别对四个酶解因素进行考察，分別为多肽溶液与亚硒酸钠溶液（0.5M）体积比（6:16:2，6:36:4，6:5）、酶解温度（30℃40℃，50℃60℃，70℃80℃，90℃）、pH（3.04.0，5.06.0，7.08.0，9.010.0）以及酶解时间（1，35，79，1020，3060，90120min）；获得最佳的酶解条件为底物浓度3wt.%,酶解pH为10.0、温度50℃、酶解时间为1h、酶-底物配比为1:20（w/w）、多肽溶液与亚硒酸钠溶液（0.5M）体积比为6:4；所述酶为碱性蛋白酶。所述硒螯合肽的制备方法如下：（1）称取3.0g灰树花蛋白溶解于100ml蒸馏水中然后用2mol/LNaOH调节其pH至10.0。先将该溶液水浴加热到50℃接着再按酶-底物配比1:20（w/w）加入相应量的酶，酶解时间1h接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟上清液收集后備用，所述酶为碱性蛋白酶（2）利用膜超滤技术行分离上清，首先将上清溶液过0.22?m滤膜再通过3kDa和10kDa的超滤膜将上清液液分成不同分子量嘚溶液冻干，测定和收集各分子量范围样品并测定硒螯合活性；（3）对膜超滤技术分离的具有最高硒螯合活性的样品再进行下一步的分离用SephadexG-25凝胶过滤色谱（长100cm，外径2.0cm）进行分离洗脱液为去离子水，流速为0.3mL/min洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制備RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离分离条件是用0-50%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4mL/min洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积仳50%乙腈和50%水混合液结束进行梯度洗脱，收集体积比为30%乙腈和70%水的洗脱峰采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出保留时间为6.92min处的峰为所述硒螯合特征肽。（4）冷冻干燥得到本专利技术的硒螯合肽EFGT的硒螯合力为60.66mg/g。采用比色法测定硒螯合肽对硒离子的螯合作用称取多肽溶液6mL，按亚硒酸钠和多肽体积比为4:6加入亚硒酸钠（0.5mol/L）搅拌均匀，调节pH至9.0在50℃条件下持续反应90min，冷却4500r/min离心10min去除固体加入5倍体积95%乙醇，沉淀静置12h4500r/min離心10min去除上清液，用等体积无水乙醇洗涤数次干燥得螯合物粉末。称取灰树花蛋白肽-硒螯合物0.2g放入100mL小烧杯中，加入5mL消化液在电炉上消化至无色透明为止，用40wt.%NaOH溶液和5wt.%NaOH溶液调节pH7.0后定容至50mL，待测将定容好的溶液放至10mL离心管中（保存），取0.5mL样液加入40mL蒸馏水，用1mol/LHCl调节pH至2~3后加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5wt.%的3,3'-二氨基联苯胺（DBA）2mL置于60℃水浴50mi本文档来自技高网

1.一种特异性硒元素螯合肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：EFGT

1.一种特异性硒元素螯合肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：EFGT2.根据权利要求1所述的一种特异性硒元素螯合肽，其特征在于：所述肽为螯合硒元素的蛋白肽3.一种如权利要求1所述的特异性硒元素螯合肽的制备方法，其特征在于：以灰树花蛋白为原料采用碱性疍白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到硒螯合肽；所述酶解条件为：底物浓度3wt.%酶解pH为10.0、温度50℃、酶解时间为1h、酶-底物配比为1:20（w/w）；所述酶为碱性蛋白酶。4.根据权利要求3所述的特异性硒元素螯合肽的制备方法其特征在于：所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用膜超滤技术行分离，将灰树花酶解多肽溶液过0.22?m滤膜通过3k...

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