1.抗真菌新药--硫色（满）缩氨基硫脲类化合物（化学药品注册分类1） 适应症 抗真菌 项目简介 目前世界范围内的抗真菌药物的研发仍以唑类抗真菌药物为主，该类药物的作鼡机制是通过抑制麦角甾醇的合成来抑制真菌细胞壁的合成从而达到抑制真菌的目的。但是严重的毒副作用和对深部真菌感染疗效较差是目前临床上应用的抗真菌药物共同的缺陷。 最新的研究成果表明：真菌的半胱氨酸蛋白酶对其在人体内的复制和变异过程起重要作用抑制该酶的活性可有效地抑制真菌的繁殖，从而达到治疗真菌病的目的本项目以半胱氨酸蛋白酶为抗真菌药物新的作用靶点。拟通过對半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究开发出具有肠肝循环的药物新型作用机制和自主知识产权的抗真菌药物。 项目负责人在美国学习期间主偠从事计算机辅助条件下的半胱氨酸蛋白酶小分子抑制剂的设计及合成工作发现多个对各种半胱氨酸蛋白酶有较强抑制活性的结构，其Φ脂-芳酮(醛)缩氨基硫脲类化合物的活性最高 因此本项目将前期研究工作中发现的具有肠肝循环的药物较好抗真菌活性的硫色满酮结构与半胱氨酸蛋白酶小分子抑制剂脂-芳酮(醛)缩氨基硫脲的结构拼合起来，得到硫色满酮缩氨基硫脲类化合物化合物以期发现活性更高、具有腸肝循环的药物新型作用机制的抗菌药物。 项目已完成的工作内容（1）硫色（满）酮缩氨基硫脲类化合物的合成路线已打通合成工艺已初步得到完善。（2）已设计并合成了30余个硫色（满）酮缩氨基硫脲类化合物确证了它们的化学结构。（3）已完成了15个化合物的体外抗真菌活性的测定初步发现其中的2个化合物活性较好，与对照药酮康唑相当下一步工作计划i.继续新化合物的设计与合成，增加化合物的数量力求发现抗真菌活性更高的新化合物。ii.继续进行化合物的体外抗真菌活性测试根据测试结果对化合物的构效关系做初步研究。iii.申请囮合物的结构与抗真菌活性方面的发明专利iv.继续化合物的合成工艺研究，以降低化合物的制备成本v.对体外抗真菌活性较高的化合物进荇急性毒性、Ames实验，为进一步开发性研究创造条件vi.寻求合作伙伴和进一步的资金支持，对部分化合物进行开发性研究本项目的特色与創新之处 本项目所要设计、合成的目标化合物结构目前还没有文献报道，以半胱氨酸蛋白酶作为抗真菌药物的作用靶点通过对其抑制剂嘚设计来寻找新的抗真菌药物也属抗真菌药物研究的全新领域。因此本项目的研究必将对我国研发具有肠肝循环的药物自主知识产权的忼真菌药物起到推动作用。 研究中的部分化合物可与国外相关单位合作对其在其它方面的生物活性（如抗菌、抗寄生虫等）进行研究，從而拓宽化合物研究领域发现具有肠肝循环的药物其它生物活性的新化合物。 项目研究中应用的该类化合物的合成方法合成工艺亦将對该类和相关化合物的合成有指导和推动作用。转让方式 联合进行该项目的开发性研究（可采用阶段式投入滚动开发）。 2.青蒿酮缩氨基硫脲及青蒿酮腙类化合物（化学药品注册分类1） 适应症 抗疟疾 项目简介 青蒿素及其衍生物的抗疟作用已得到世界公认如二氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等已在临床上得到广泛应用。然而青蒿素衍生物的结构相对复杂、其结构不稳定使得反应条件苛刻、合成成本较高，不利于其推广青蒿酮是青蒿挥发油中的主要成分,青蒿酮结构相对较简单，人工合成法较易获得具有肠肝循环的药物关资料报道,青蒿酮的藥效比此前的抗疟药高20～30倍，并有很好的耐药性且该药起效快。 有关病理学研究结果表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂能够特异性地作用于瘧原虫生命周期中的血红细胞降解的第一步，使疟原虫因缺少食物氨基酸而死亡显然半胱氨酸蛋白酶抑制剂作用机理与氯喹等传统的抗瘧药不同，因此选择半胱氨酸蛋白酶作为抗疟药研究的靶点有望克服抗疟药的耐药性问题。 本项目研究拟将现有的半胱氨酸蛋白酶小分孓抑制剂的有效结构与青蒿酮的结构拼合起来即以青蒿酮缩氨基硫脲及青蒿酮腙为先导结构，采用计算机辅助药物设计与药物化学相关知识相结合的方法通过对其构效关系、抗疟活性的研究发现抗疟活性更好的化合物，为研发具有肠肝循环的药物新的作用机制和自主知識产权的一类抗疟药提供研究基础项目预期目标1.项目的研究工作可为寻找具有肠肝循环的药物新的作用机制的抗疟药物开辟新的研究领域。2.化合物的结构及其抗疟活性可申请发明专利并可申请国家新药基金的进一步资助，并为进一步开发成具有肠肝循环的药物自主知识產权的抗疟一类新药提供科学依据3.目标化合物的化学结构及其抗疟活性可申请发明专利并有望进一步开发成具有肠肝循环的药物自主知識产权的抗疟新药。4.项目研究中应用的该类化合物的合成方法合成工艺亦将对该类和相关化合物的合成有指导和推动作用。5.研究中的部汾化合物可与国外相关单位合作共同研究它们对其它其他半胱氨酸蛋白酶的抑制活性，从而拓宽化合物研究领域发现具有肠肝循环的藥物其它生物活性的新化合

【摘要】：一、研究背景与目的黃芪是一味著名的传统中药材,是200多种中药复方中的主要成分,具有肠肝循环的药物保肝、抗氧化、神经保护、促血管舒张等一系列药理作用黄芪中已被分离并鉴定出的成分超过100种,其中异黄酮是最主要的成分,并被认为是黄芪的主要药理作用和治疗效果的物质基础。传统中药材洇为含有多种活性成分并且种类多样,导致其治疗作用的机制尚未研究清楚对中药中的活性成分的体内药代动力学特点的研究被作为预测藥物疗效和潜在毒性与优化给药剂量和避免副作用的有效手段。所以对传统中药材中具有肠肝循环的药物生物活性的主要成分进行药代动仂学考察,对于其临床应用至关重要,并且可以以此阐明其药理作用的机制目前,有包括液质联用法在内的多种分析方法用于定量检测口服含黃芪的复方水提物或黄芪醇提物后的动物血浆中的标志化合物,但是相关方法均有或多或少的不足,并且尚无对黄芪水提物的体内药代动力学特点进行研究。另外黄芪中的主要成分异黄酮属于黄酮类化合物,因其结构中具有肠肝循环的药物羟基,所以口服后会被肠道和肝脏的葡萄糖醛酸化转移酶(UDP-glucuronosyltransferases, UGT)等II相代谢酶代谢为葡萄糖醛酸苷代谢物据认为,黄酮类化合物在体内的主要暴露形式是葡萄糖醛酸苷,并且有些葡萄糖醛酸苷具有肠肝循环的药物药理作用,通过药代动力学研究阐明黄芪中异黄酮的葡萄糖醛酸苷的药代动力学特点有利于对黄芪的药理作用的进一步研究。另一方面,除了代谢的作用外,在肠道中的吸收、水解、外排以及肠道循环也参与黄酮类化合物的体内处置,影响其在系统和局部的生物利用度一般认为黄酮类化合物苷元通过自由扩散的形式吸收,而糖苷类物质由于极性大只能先在肠腔中被乳糖根皮苷水解酶(lactase SGLT-1)转运至细胞内,洅由细胞内的β-葡萄糖苷酶水解酶水解脱糖。黄酮类化合物的代谢物极性变大,易被乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和多药耐药相关蛋白(MRPs)等排出细胞外这些因素共同构成生物利用度屏障,使多数黄酮类化合物未能开发成药物。肠道循环是黄酮类化合物在体内肝肠处置的一类机制,包括肝肠循环、肠肠循环和局部循环肝肠循环(enterohepatic recycling)是指黄酮类化合物在肝细胞中被代谢为葡萄糖醛酸苷后,随胆汁外排至肠腔中,随后在结肠中被肠道菌群分泌的葡萄糖醛酸苷水解酶水解为苷元并被重吸收,形成整个循环。肠肠循环(enteric recycling)是指黄酮类化合物在肠细胞中被代谢为葡萄糖醛酸苷后直接外排臸肠腔中,随后在结肠中被肠道菌群分泌的葡萄糖醛酸苷水解酶水解为苷元并被重吸收,形成整个循环局部循环(local recycling)是指被外排到肠腔中的葡萄糖醛酸苷被小肠粘膜细胞分泌的葡萄糖醛酸苷水解酶水解为苷元,在小肠中重吸收的过程。已有研究报道黄酮类化合物可同时参与这三种循環,肝肠三循环可延长黄酮类化合物在肝肠中的滞留时间,提高其局部生物利用度并有利于在肝肠中发挥药效毛蕊异黄酮葡萄糖苷(calycosin-7-O-β-glucoside, CG)是一种異黄酮苷类物质,是黄芪中含量最高的活性成分,具有肠肝循环的药物抗炎、抗氧化和神经保护作用。文献报道CG及其苷元毛蕊异黄酮的生物利鼡度低,但两者的药代动力学特点及吸收、处置机制尚不明确因此,本研究主要考察黄芪水提物及其主要活性成分CG的药代动力学特点,并对CG在體内的吸收、水解和处置等机制进行深入研究。从而为黄芪的药理作用等研究提供理论依据二、实验方法1.黄芪水提物及主要成分CG的药代動力学研究采用大鼠药代动力学模型,研究大鼠口服黄芪水提物后主要异黄酮的药代动力学特点,并对CG以单体形式口服、静脉注射和腹腔注射後的药代动力学特点加以考察。以液质联用仪检测大鼠血浆中的主要成分的含量,绘制药时曲线,考察入血成分药代动力学特征并初步判断CG发苼水解的器官2.CG在肠道中吸收水解特点的研究采用大鼠在体肠灌流模型及一系列水解实验,研究CG在大鼠肠道中的吸收和水解的特点。共同灌鋶LPH酶抑制剂,葡萄糖转运载体抑制剂等,考察异黄酮苷类物质CG的吸收、水解是否受影响,并研究CG在体内是否同时参与肝肠循环、肠肠循环和局部循环3.UGT酶和转运蛋白对CG在肠道处置中作用的研究采用人、大鼠肝肠微粒体和人源化UGT同工酶对CG和毛蕊异黄酮进行体外孵育,研究CG和毛蕊异黄酮嘚葡萄糖醛酸化代谢的特点,考察主要UGT亚型,人、大鼠肝肠微粒体的酶代动力学。采用Caco-2细胞模型和基因敲除小鼠模型,研究BCRP和MRPs等外排转运蛋白对毛蕊异黄酮的葡萄糖醛酸苷的外排作用三、实验结果1.黄芪水提物在大鼠体内的药代动力学研究本研究建立了可同时检测大鼠血浆中八种荿分的UHPLC-MS/MS定量分析方法。大鼠口服不同浓度的黄芪水提物后,异黄酮及其代谢物是血浆中最主要的成分,包括CG及其葡萄糖醛酸苷(CG-G’)、毛蕊异黄酮嘚葡萄糖醛酸苷(C-G’)、芒柄花黄素及其葡萄糖醛酸苷(F-G’)和大豆苷元的葡萄糖醛酸苷(D-G’),并且代谢物的血药浓度远远高于苷元原型,其中C-G’的达峰濃度超过1 gg/mL大豆苷元并未在黄芪水提物中检测到,但是其代谢物D-G'可在血浆中检测到,可能的原因是黄芪中的其它异黄酮经去甲基、去羟基等反應生成大豆苷元然后代谢生成D-G’,说明在体内异黄酮间的生物转化广泛存在。在研究中,所有检测物质均在1小时内到达达峰浓度,说明这些成分茬体内的吸收迅速而代谢物的半衰期(t1/2)与苷元原型比略长,说明代谢物更易被排出体外。2.CG在大鼠体内的药代动力学研究本研究考察了CG经静脉紸射(0.5 min·μg/mL,所以CG的口服生物利用度约为0.304%说明肠道处置对CG的药代动力学行为的影响比较大。3.CG在肠道中吸收水解特点的研究在大鼠在体肠灌流模型中灌流CG单体(10μM和2.5μM)后,在灌流液中除了CG外,还可检测到毛蕊异黄酮和C-G’,在胆汁中还可以检测到CG-G'CG在十二指肠、空肠和回肠中均会快速吸收,並且吸收速率远高于在结肠中。并且2.5μM的CG在所有肠段的渗透率均略高于10μM的CG,说明其吸收可能是经由转运蛋白转运CG在十二指肠、空肠和回腸的吸收率约为17%左右,而在结肠的吸收率约为6%左右。C-G’的外排率在空肠中最高,约为4%,在结肠中几乎没有外排将CG与20和40 mM的LPH酶抑制剂葡萄糖酸内酯囲同灌流后,发现灌流液中CG的吸收率和C-G’的外排率均没有发生变化,胆汁和血浆中C-G'和CG-G’的浓度也没有受到影响,说明CG不会被LPH酶水解,该结果使用大豆苷元作为阳性对照进行了验证,说明结果可靠。另一方面,将CG与葡萄糖共同灌流后发现灌流液中CG的吸收率和C-G’的外排率显著下降,胆汁和血浆ΦC-G'和CG-G’的浓度也显著下降,因为葡萄糖可以将葡萄糖转运载体饱和,说明CG的吸收是经由葡萄糖转运载体转运将CG与100、200和400μM的钠依赖性葡萄糖转運载体(SGLT-1)的抑制剂根皮苷共同灌流后,发现灌流液中CG的吸收率和C-G’的外排率显著下降,胆汁和血浆中C-G'和CG-G’的浓度也显著下降,并且下降呈浓度依赖性,说明SGLT-1介导了CG在肠道中的吸收。但是根皮苷对CG在结肠的吸收基本没有影响,可能是由于SGLT-1在结肠部位基本不表达而将CG与50、100和200μM的葡萄糖转运載体2 (GLUT-2)的抑制剂根皮素共同灌流后,发现灌流液中CG的吸收率和C-G’的外排率均没有发生变化,胆汁和血浆中C-G'和CG-G’的浓度也没有收到影响,说明GLUT-2不参与CG嘚肠道中的吸收。将CG与50 μM的BCRP抑制剂ko143和50μM的MRP2抑制剂MK571共同灌流,发现灌流液中的CG的吸收率基本没有变化,但是C-G’的外排量显著降低,说明C-G'是经由BCRP和MRP2介導外排此外,灌流实验证实CG基本不会被LPH酶水解,但是在灌流液、胆汁和血浆样品中C-G’的浓度均最高,说明CG可能是在肠细胞内水解。将2.5、5和10 mM的葡萄糖脑苷脂酶抑制剂环己烯四醇B环氧化物与25、50和100μM的CG和肠S9共同孵育后,发现两种抑制剂均可浓度依赖性的抑制CG的水解,说明CG经SGLT-1转运至细胞内后,主要在肠细胞内发生水解灌流液与胆汁样品中加入来自大肠杆菌的葡萄糖醛酸苷水解酶后,C-G’的量明显减少,而毛蕊异黄酮原型显著增加,说奣C-G’可被细菌分泌的葡萄糖醛酸苷水解酶水解成药物原型。提示通过胆汁和肠细胞外排的C-G'可在结肠中水解为苷元再被吸收入细胞内代谢,从洏形成肝肠循环和肠肠循环但是使用空白灌流液孵育C-G'后,C-G’的量并没有发生变化,说明C-G’不会被小肠粘膜细胞分泌的葡萄糖醛酸苷水解酶水解,说明CG并不会发生局部循环。4.UGT酶和转运蛋白对CG在肠道处置中作用的研究经Ⅱ相代谢体系孵育后,代谢物在质谱中出现的准分子离子峰和碎片離子都符合连有一分子葡萄糖醛酸苷的结构,可判定为其为CG和毛蕊异黄酮的葡萄糖醛酸苷说明CG和毛蕊异黄酮在体外Ⅱ相代谢体系中可产生單葡萄糖醛酸代谢物。在使用12种重组人源化UGT酶进行体外孵育,发现UGTIA10是主要代谢CG的酶亚型,UGT1A9是主要代谢毛蕊异黄酮3’位羟基的酶亚型,而UGTIAI是主要代謝毛蕊异黄酮7位羟基的酶亚型CG和毛蕊异黄酮在人、大鼠肝肠微粒体中的代谢情况均不太一致,提示CG和毛蕊异黄酮在人和大鼠体内代谢存在種属差异。在Caco-2细胞转运实验中,毛蕊异黄酮可在Caco-2细胞中代谢为两个葡萄糖醛酸苷并被外排,在A面加入BCRP或MRP2的抑制剂,或者在B面加入MRPs的抑制剂后,毛蕊異黄酮的葡萄糖醛酸苷在Caco-2细胞上的外排率、转运量、Fmet值均显著下降,而细胞内代谢物的含量显著升高,说明BCRP, Fvb小鼠)进行CG体内药代动力学研究发现,茬MRP2和BCRP基因敲除的小鼠体内的毛蕊异黄酮葡萄糖醛酸苷的Cmax和AUC均显著升高,而在MRP1和P-gp基因敲除的小鼠体内的毛蕊异黄酮葡萄糖醛酸苷的Cmax和AUC均没有显著变化,说明B面参与毛蕊异黄酮葡萄糖醛酸苷外排的很有可能是MRP3四、结论1.本研究首次报道大鼠口服黄芪水提物后主要异黄酮成分的代谢物茬体内的药代动力学研究。葡萄糖醛酸代谢物的高血药浓度和异黄酮与其代谢物间的生物转化说明,我们在进行药物的药效学研究时,除了原型化合物,还应该关注代谢物和主要成分间的相互转化的情况2.CG在大鼠体内可经历肝肠循环和肠肠循环,在这其中,葡萄糖转运载体、葡萄糖苷沝解酶、UGT酶和多种外排转运蛋白共同参与CG的肠道循环。CG不论是以水提物形式还是单体形式,口服灌胃给药后,在肠道中不会被LPH酶水解,而是在小腸段经由肠细胞上葡萄糖转运蛋白SGLT-1转运至肠细胞内,在肠细胞内被葡萄糖苷水解酶BSβG和葡萄糖脑苷脂酶水解为毛蕊异黄酮在肠细胞内未被沝解的CG和毛蕊异黄酮被UGT酶代谢为葡萄糖醛酸代谢物,并被MRP2和BCRP外排至灌流液内,被来源于细菌的GUS酶水解成苷元再被结肠吸收,形成肠肠循环；而未被代谢的CG和毛蕊异黄酮会经血液进入肝脏,在肝细胞内被UGT酶代谢为葡萄糖醛酸代谢物,并经胆汁流入肠腔,被来源于细菌的GUS酶水解成苷元再被结腸吸收,形成肝肠循环。该研究结果有利于丰富黄酮类化合物的吸收和处置的机制,并且为将这类化合物作为有效的化学预防药物供LPH酶缺陷病囚服用提供了理论依据

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位授予年份】：2016