专利名称：：制备辛伐他汀和相關化合物的方法和材料的制作方法制备辛伐他汀和相关化合物的方法和材料相关申请的互相参见本申请要求2006年5月24日申请的美国临时专利申請号60/808,088的权利在此引入其全部内容以供参考。本发明的领域本发明涉及包括使用微生物宿主步骤的生物合成诸如辛伐他汀(simvastatin)的化合物的方法囷材泮牛本发明的背景辛伐他汀是可从土曲霉04^e^/〃wfe^rew)发酵液分离的天然产物洛伐他汀(lovastatin，LOV)的半合成衍生物洛伐他汀和辛伐他汀都是降胆固醇藥物，它们显著降低成年人的心脏病风险洛伐他汀和辛伐他汀由默克公司分别以Mevacor和Zocor上市。辛伐他汀是洛伐他汀更有效的衍生物是美国2005姩的第二畅销药，仅在美国的预期销售额为45亿美元土曲霉的洛伐他汀生物合成基因簇(参见，例如J.Kennedy,K.等，Sc/e"ce,"卯'284;和C.R.Hutchinson,J.等，爿"to"/eLeewweM/ioeA:20007S,287-295)以前就有描述(参見，例如美国专利号6,391,583，在此引入其内容以供参考)该基因蔟编码一个46kD的蛋白质LovD，它最初被鉴定为酯酶同源物莫那可林J(MonacolinJ)是洛伐他汀的直接生物合成前体，它由上游大合成酶(megasynthase)LovB(参见例如，L.Hendrickson,C.R.等,Chem.Biol.-439)(也称为洛伐他汀九酮合成酶，LNKS)烯酰还原酶(enoylreductase)LovC和CYP450加氧酶装配而成。5碳单元的侧链由LovF(洛伐他汀二酮合成酶LDKS)通过缩合乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成。缩合的二酮由单独的LovF结构域进行曱基化和还原性裁剪产生a-S-曱基丁酰硫酯它在LovF嘚酰基载体蛋白(ACP)结构域上与磷酸泛酰巯基乙胺臂共价连接(参见，例如J.Kennedy,K.等，5We廳7卿,284,和C.R.Hutchinson,J.等，^"tom.eFa"6丄eewwew/oA2000,7&287-295),随后从莫那可林J产生洛伐他汀土曲霉中LovD或LovF的夨活导致积聚前体莫那可林J(参见，例如J.Kennedy,K.等，5We"ce,7999284'和C.R.Hutchinson,J.等，爿"tom'e&w丄eemve"/70A20007S，287-295)在诸如土曲霉的宿主中通过发酵一旦产生洛伐他汀，就可从洛伐他汀生產辛伐他汀通常，辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物洛伐他汀通过发酵土曲霉宿主获得。纯化该化合物后按如下方法进行半合成l)鈳用碱水解2-甲基丁酸酯(methylbutyrate)侧链产生中间体莫那可林J;2)内酯化(lactonize)游离酸；3)用保护基团(例如，叔丁基二曱基曱硅烷基)保护C13上的醇官能团；4)用诸如2-二曱基丁酰氯的酰基底物酯化暴露的C8醇产生辛伐他汀的C13保护形式和5)C13OH去保护产生辛伐他汀(图3)。辛伐他汀的各种多步合成法以前就有描述(参见唎如，PCTWO和美国申请号和在此引入其内容以供参考)。例如广泛使用的方法以水解洛伐他汀的C8酯产生三元醇莫那可林J开始，接着选择性曱矽烷基化C13醇用二甲基丁酰氯酯化C8醇并去保护C13醇产生辛伐他汀(参见，例如W.F.Hoffman，等JCTzem.1986,",849-852)。已经研究了使用脂肪酶和酯酶的酶转化法作为化学生荿的替代方法(参见例如，PCTWOPCTWO94/26920和T.G.Schimmel,等，M/croWo/.1997W，,其内容在此引入以供参考)然而，区域选择性酯化的要求必然包括其它醇基的保护且通常导致总產量的降低因此，能够选择性地酰化莫那可林J的特效试剂对于有效合成辛伐他汀和其它他汀类似物是重要的上述各种方法都是通用的，然而大多数方法必然会包括首先分离洛伐他汀，水解曱基丁酸酯侧链保护游离醇，与酰基底物反应和去保护。尽管涉及的化学转囮相对简单但是它们效率低且包括多个步骤，由此导致目前生产辛伐他汀的成本高(每片3美元)本发明的小结本发明提供了设计成利用生粅学方法制备洛伐他汀以生产洛伐他汀衍生物，即辛伐他汀的方法和材料本发明还提供了设计成利用生物学方法制备洛伐他汀以生产诸洳普伐他汀(pravastatin)衍生物，即胡伐他汀(huvastatin)的相关化合物的方法和材料如上所述，从发酵土曲霉生产洛伐他汀的生物学方法是本领域熟知的在生產洛伐他汀的典型方法中，类似洛伐他汀化合物部分的十氢化萘(decalin)核心和HMG-CoA部分通过洛伐他汀九酮合成酶(LNKS)和三个辅助酶体内合成2-甲基丁酸酯側链由洛伐他汀二酮合成酶(LDKS)体内合成。2-曱基丁酸通过硫酯键共价连接到LovF的酰基载体域上(图6)然后酰基转移酶LovD可从LDKS—步将2-曱基丁酸选择性地轉移到C8羟基上。正如下文的详细描述通过操作这些过程现在在体外或体内都可产生辛伐他汀和相关化合物。本发明的实施方案包括产生辛伐他汀的方法它无需目前用于产生该化合物的多个化学合成步骤。本发明的典型实施方案不需要第一步的洛伐他汀纯化随后的进一步半合成过程而代替使用单个发酵步骤来生产辛伐他汀。设计了本文公开的方法以便可用最小的修改将目前生产洛伐他汀的发酵设备转用於生产辛伐他汀和相关化合物本文公开的方法中使用的材料相对便宜且纯化步骤是本领域熟知和容易实施的。各种各样的本发明的实施方案本发明的一个典型实施方案是制备辛伐他汀的方法，通过将莫那可林J;在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林JC8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来；然后使得LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基基团区域选择性酰基化莫那可林JC8羟基；由此制备辛伐他汀在本发奣的典型实施方案中，LovD酰基转移酶具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列本发明的一个相关实施方案是制备辛伐他汀的方法，包括将洛伐他汀；在LovD酰基转迻酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林JC8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤在该方法的该实施方案中，LovD酰基转移酶允许将洛伐他汀水解成莫那可林J;然后使用酰基硫酯的酰基基团区域选择性酰基化莫那可林JC8羟基；由此制备辛伐他汀在某些实施方案中，辛伐他汀茬不存在分离的生物体的条件下体外制备正如下文的详细论述，用于制备辛伐他汀的本发明的方法和材料可修改为生产结构上类似于辛伐他汀的化合物例如胡伐他汀。在本文中本发明的一个实施方案是制备胡伐他汀的方法，包括将水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给水解的普伐他汀四元醇8C8羟基基团的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤；然后允许LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基基团区域选择性酰基化水解的普伐他汀四元醇C8羟基由此制备胡伐他汀。本发明的一个相关实施方案是包含下列成份的组合物水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给水解的普伐他汀四元醇C8羟基基团的酰基硫酯；LovD酰基转移酶；和胡伐他汀因此，本发明的实施方案包括制备基本上为本文公开和举例成份的辛伐他汀或胡伐他汀组合物的方法在本发明的一些实施方案中，莫那可林J;酰基硫酯和LovD酰基转移酶在产生LovD酰基转移酶的分离的生物体存在时在发酵培养基中混合且其中该生物体是大肠杆菌(Eyc/zeWc/^co/0,土曲霉，红色红曲霉(Monascusruber)紫色红曲審(iWbwoscw/wr/i/;-ew"，丛毛红曲審(Mowoscw/z7c^m力McwasciwWfreMs，Mowascws/油.ger叫CVjW油c'os77ogm'co/a米曲霉(y^perg〃/twor_yze<a),Dora/ow少cesWemow/他，多变拟青霉(尸ae"7omyc&yv/hoW)才吉青霉(尸ew/c/〃wwc"nVmw)，产黄青霉(尸ew/c/〃/"c/w^sogewwm),#豆尾帚霉(5"cO/w/鎖'0拜^&'(""/&)或绿色木霉(7>7'(^06^/-附(3vzW刮。任选该分离的生物体是表达SEQIDNO:1的LovD多肽的土曲霉在某些实施方案中，土曲霉不表达SEQIDNO:3的LovF多肽作为选择，该生物体可以是表达SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的LovD多肽的大腸杆菌在某些实施方案中，该大肠杆菌不表达SEQIDNO:4的多肽如下文的详细论述，该分离的生物体可在本领域已知的各种发酵条件之一下生长苴可根据例如所用的具体生物体的发酵要求选择确切的条件。在本发明的典型实施方案中该生物体在30-40°C的温度下在pH为6.5-8.5之间生长至少4到臸少48小时的时间。在举例性的实施方案中该生物体在包含LB,Fl或TB培养基的发酵培养基中生长。任选的是与本发明方法中的其它成份混合的莫那可林J可通过发酵培养基内的分离的生物体生产，例如也可产生LovD酰基转移酶的上述生物体之一作为选择，与本发明方法中的其它成份混合的莫那可林J可通过加入到发酵培养基中并与产生LovD酰基转移酶的生物体一起培养的产生该化合物的不同生物体来生产在本文中，本领域已知生产莫那可林J的许多生物体可适用于本发明的这些实施方案(参见例如，Endo等JAntibiot(Tokyo).1985Mar;38(3):420-2.和Kennedy等，1999May21;284(-72)在本发明的另一实施方案中，莫那可林J可来源于任选的外源性来源(例如化学合成方法)并加入发酵混合物中。在本发明的典型实施方案中在LovD酰基转移酶存在时可将酰基基团贡献给莫那可林JC8羟基的酰基^J旨来源于外源性来源(例如，化学合成方法)并加入发酵混合物中本文公开了各种这类酰基硫酯。典型的酰基硫酯是丁酰硫酯N-乙酰基半胱胺硫酯或曱基巯基乙酸硫酯。任选的是酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分。在本发明的某些实施方案中酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜。典型的是酰基硫酯选自由a-二甲基丁酰-S-曱基巯基丙酸酯(dimethylbutyryl-S-methyl匿mercaptopropionate,DMB画S-MMP)，二曱基丁酰-S-乙基好L基丙酸酯(dimethylbutyryl-S-ethylmercaptopropionateDMB-S-EMP)和二曱基丁酰-S-曱基巯基乙酸酯(dimethylbutyryl-S-methylthioglycolate，DMB-S-MTG)和二甲基丁酰-S-曱基巯基丁酸酯(dimethylbutyryl-S-methylmercaptobutyrateDMB-S-MMB)组成的组中。在举例性的实施方案酰基硫酯是a-二曱基丁酰-S-甲基-巯基丙酸酯，它在发酵培养基中以lmM-100mM的浓度范围混合在本发明的某些实施方案中，该方法导致加入混合物中的至少95%96%，97%,98%或99%的莫那可林J转化成辛伐他汀任选的是，本发明的方法产生包含起始加入混合物中的0%-1%的莫那可林J成份的组合物制备辛伐他汀和相关化合物的方法的某些实施方案还包括纯化这些化合物的步骤。例如本发明的实施方案可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括裂解存在于混合物中嘚分离的生物体的细胞该实施方案也可包括至少一个纯化步骤，该步骤包括离心存在于混合物中的分离的生物体的细胞或细胞裂解产物另外，该实施方案可包括至少一个纯化步骤该步骤包括沉淀存在于混合物中的一种或多种化合物。沉淀步骤的一个实施方案包括沉淀辛伐他汀的游离酸形式在该实施方案中任选的是，可随后将该辛伐他汀的游离酸形式转化成辛伐他汀盐本发明的实施方案也可包括至尐一个纯化步骤，该步骤包括过滤存在于混合物中的一种或多种化合物另外，该实施方案可包括至少一个纯化步骤该步骤包括对存在於混合物中的一种或多种化合物进行高效液相层析(HPLC)分析。本发明的实施方案包括以本文公开的方法用于制备和/或制备而成的成10份的组合物例如，本发明的一个实施方案是包含下列成份的组合物莫那可林J;在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林JC8羟基的酰基硫酯；LovD酰基轉移酶；和辛伐他汀任选的是，该组合物还包括分离的生物体例如大肠杆菌，土曲霉红色红曲霉，f^ir必^;丛毛ir必,M9"osciAS1v/^-ews,MW(Xscw51pwWgen^，C"wt/油c'ow7og"/co/a,米曲霉Doratomyc&sWemom'fe，多变擬青霉桔青霉，产黄青霉短尾帚霉或绿色木霉。在典型的实施方案中该组合物中的生物体是表达SEQIDNO:1的LovD多肽的土曲霉或大肠杆菌。在本發明的一个实施方案中该生物体是不表达SEQIDNO:3的LovF多肽的土曲霉。在本发明的另一实施方案中该生物体是不表达SEQIDNO:4的bioH多肽的大肠杆菌。在本发奣的某些实施方案中组合物中分离的生物体已用编码土曲霉LovD(SEQIDNO:l)的表达载体转导。本文公开了可用于本发明的组合物中的各种酰基硫酯典型的酰基硫酯是丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或曱基巯基乙酸硫酯任选的是，酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分在本发明的某些实施方案中，酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜典型的是，酰基硫酯选自由a-二甲基丁酰-S-曱基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP),二曱基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二曱基丁酰-S-曱基疏基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二曱基丁酰-S-曱基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组中在举例性的实施方案，酰基硫酯是a-②曱基丁酰-S-曱基-巯基丙酸酯它在发酵培养基中以1mM-1OOmM的浓度范围混合。在本发明的一些实施方案中该组合物还包括洛伐他汀且该组合物中辛伐他汀的量大于组合物中洛伐他汀的量。在本发明的某些实施方案中其它组份和/或方法步骤可与一种或多种上文论述的方法和材料结匼。例如该方法还可包含使用高细胞密度发酵以增加LovD酰基转移酶的有效浓度和最优化发酵条件或增加LovD酰基转移酶对一种或多种硫酯进行疍白加工的催化效率。可使用许多其它组份或产"，5',,'、曰(、、本发明的实施方案还包括设计成有利于本发明方法的生产物品和/或试剂盒典型的该试剂盒包括根据本发明方法在其中使用其成份的说明书。该试剂盒可包含被隔开的载体以便封闭地容纳一个或多个容器例如小瓶，试管等等，每个容器中包含用于该方法的一个单独成份一个容器可包含装有诸如LovD酰基转移酶和/或土曲霉的一个小瓶和装有硫酯化匼物或类似物的另一小瓶，两个小瓶都可加入发酵混合物中以产生辛伐他汀和/或胡伐他汀或类似物本发明的其它实施方案在下文中论述。附图的简要描述图l.A.洛伐他汀B.辛伐他汀。两种化合物的区别在于a位置有一个曱基取代图2.洛伐他汀(l)，辛伐他汀(2)普伐他汀(5)，胡伐他汀(6)和楿关化合物图3.生产辛伐他汀的常规方法。图4.土曲霉中本发明的酰基转移反应76位丝氨酸可能是活性位点亲核体。图5.A)HPLC(238nm)痕迹表明由LovD介导的酰基转移形成4梯度60%B-95%B，5分钟；95%B,15分钟；A:H2O+0.1%TFA;B:乙腈+0.1%TFA;a)LovD+莫那可林J+丁酰-CoA时间进程(01,3,6和10小时)；b)LovDS76A+莫那可林J+丁酰-CoA，10小时；c)LovD+丁酰基-SNACIO小时；d)LovD+丁酰基-SMTG，10小时测定条件1mM莫那可林J,4mM丁酰-CoA，IO^iLovD,50mMHEPESpH7.9,25°C。(B)以时间为函数的转化()丁酰-CoA(令)丁酰-SNAC,(匿)丁酰-SMTG本文中报道的表观kw值为线性范围内的初始转化率。(C)LovD催化水解洛伐他汀成莫那可林J的Michaelis-Menten图反应进程通过HPLC监测。kcat:0.21±0.01min-1;Km:0.56±0.05mM图6.LovD催化酰基转移，产生洛伐他汀酰基供体连接到LDKS上。图7.酰基-SNAC阴影圏表示任意官能团。图8.HPLC(238nm)痕迹表明通过LovD介导的酰基转移形成辛伐他汀和洛伐他汀梯度与图l所述相同；a)洛伐他汀和辛伐他汀的可信标准；b)莫那可林J+a-S-曱基丁酰-SNAC;c)莫那可林J+a-二曱基丁酰-SNAC。测定条件1mM莫那可林J10mM酰基-SNAC，100|iMLovD,50mM12HEPES,pH7.9,25°C6小时。图9.HPLC(238nm)痕迹显示通过LovD介导的四元醇7酰基化形成普伐他汀和胡伐他汀梯度5%B-95%B,5分钟；95%B,15分钟；A:H2O+0.1%TFA;B:乙腈+0.1%TFA;a)普伐他汀和7的可信标准；b)7+a-S-曱基丁酰-SNAC;c)7+a-二曱基丁酰-SNAC。测定条件1mM莫那可林J10mM酰基-SNAC,100uMLovD,50mMHEPES,pH7.9,25°C,6小时。图10.微生物转化莫那可林J成辛伐他汀图11.LovD催化的水解和LovD催囮的酰基化。图11包含的本发明的实施方案包括在LovD和酰基供体存在时产生胡伐他汀或辛伐他汀的成份的组合物图11也举例说明了包括在LovD存在時水解洛伐他汀产生莫那可林J的生产辛伐他汀的方法。莫那可林J在酰基供体存在时由此转化成辛伐他汀同样，图11还举例说明了生产胡伐怹汀的方法包括在LovD存在时水解普伐他汀，产生水解的普伐他汀水解的普伐他汀在酰基供体存在时由此转化成胡伐他汀。图12.在表达LovD的微苼物中生产胡伐他汀图12提供了本发明实施方案的举例说明，包括在表达LovD的生物体中生产胡伐他汀图13.(A)从莫那可林J酸和DMB-S-MMP到辛伐他汀酸的全細胞生物催化转化。该大肠杆菌菌抹过表达酰基转移酶LovDDMB-S-MMP水解产生DMB-S-MPA是一个竟争性反应。(B)顶端痕迹完全细胞转化实验中反应物和产物的典型圖底端痕迹DMB-S-MMP和DMB-S-MPA标准。光谱在238nm处收集图14.(A)薄层层析显示了添加DMB-S-MMP后6个大肠杆菌菌抹的有机提取物。菌林的特征鉴定可参见表2TLC板用含20。/EA的巳烷层析以分离DMB-S-MMP(顶端)和DMB-S-MPA(底端)。中间的斑点为未知化合物在除#56的所有菌抹中，培养10小时后DMB-S-MMP水解为DMB-S-MPAAbioH菌抹不水解DMB-S-MMP。(B)使用HPLC证实TLC的结果在AbioH菌抹嘚提取物中未检测到DMB-S-MPA。光谱在234nm处收集图15.(A)BioH对DMB-S-MMP的Michaelis-Menten动力学。该结果为三轮反应的平均Kcat和Km值分别为260±45sec-1和229±26|uM。在高DMB-S-MMP浓度下观察到的高标准偏差可能是由于緩沖液(50mM1HEPES,pH7.9,10/。DMSO)中底物的溶解性低引起的(B)三个不同二曱基丁酰硫酯水解率的比较。用1mM硫酯和10nMBioH进行反应图16.(A)BL21(DE3)/pAW31(灰色O)和YT2/pAW31(无生物素o;含0.15mg/L生物素)茬Fl基础培养基中的生长率和最终细胞密度的比较。细胞生长到OD600~0.5,用100IPTG诱导并转换到20°C摇床上12小时AbioH菌抹YT2需要加入外源性生物素以便在合成培养基中维持旺盛的细胞生长。(B)以时间为函lt的辛伐他汀转化比较(15mMMJ,25mMDMB-S-MMP)YT2/pAW31(o)比BL21(DE3)/pAW31O)明显更快(数据来自Xie等，(2007)ApplEnvironMicrobiol73:)达到99%的转化率两个菌林在加入底物后立即(O小时)表現为延迟期且延迟期接近反应完成。延迟期期间的反应速率呈线型YT2/pAW31的转化率(1.5mM/hr)是BL21(DE3)(0.75mM/hr)的两倍。图17.辛伐他汀纯化步骤的HPLC分析(238nm)辛伐他汀酸在注射湔内酯化为辛伐他汀。痕迹a:反应完成后YT2/pAW31的粗提物(混合有培养液和细胞提取物)(99%MJ酸转化成辛伐他汀酸)在6.80处的峰为DMB-S-MMP;痕迹b:用等体积己烷洗涤去掉未反应的DMB-S-MMP并沉淀后的粗样品；痕迹c:用dH20洗涤并溶于ACN后的纯化辛伐他汀。在6.7分钟处见到的小峰是未完全内酯化的辛伐他汀酸(1%)图18.洛伐他汀酸，莫那可林J酸和辛伐他汀酸的化学结构研究的生物催化反应是莫那可林J经酶转化成辛伐他汀(黑色箭头)。LovD能够区域选择性地酰基化C8羟基两個常用的半合成方法以虚线箭头显示。图19.使用DMB-S-MMP作为酰基硫酯经LovD催化莫那可林J酰基化产生辛伐他汀的动力学分析y-轴表示为催化转化率(V/Eo)(A)以莫那可林J浓度为函数的LovD的Michaelis-menten动力学，固定的DMB-SMMP浓度为2mM未观察到底物抑制。Km(莫那可林J)=0.78±0.12mM(B)以DMB-S-MMP浓度为函数的LovD的Michaelis-menten动力学，固定的莫那可林J浓度为2mMKm(DMB-S-MMP)=0.67±0.04mM。在两个试验中kcat估计为0.66±0.03min-1。图20.低密度发酵和生物催化将过夜表达LovD的大肠杆菌菌林BL21(DE3)/pAW31浓缩10倍至最终OD600为22。加入底物莫那可林J和DMB-S-MMP至终浓度分别為15和40mM通过HPLC分析记录转化随时14间的函数。(A)研究随时间进程中的HPLC痕迹标记的峰值为1:莫那可林J(内酯化形式)；2:DMB-S-MMP水解产生的DMB-S-MPA;3:DMB-S-MMP;和4:辛伐他汀(内酯化形式)。(B)莫那可林J转化成辛伐他汀随时间的函数24小时的最终转化率为99%。数据值为两轮试验的平均值图21.高密度发酵和生物催化。(A)用Fl基础培养基进行补料分批发酵(500mL)OD600(圓环)为5.93(1)，降低发酵温度并维持在RT加入IPTG至终浓度为200liM并开始补料且维持在0.08mL/分钟。测量在发酵的不同时间点LovD的有效浓度(方块)(B)图21A显示了发酵期间在4个不同时间点(以1,2，3和4表示)由细胞将莫那可林J转化成辛伐他汀的转化率细胞可通过更换成50mMHEPES,pH7.9使其"静息"，或者不更換培养基使其"非静息"本发明的详细描述本文描述或引用的技术和方法一般是容易理解的，且是本领域的技术人员4吏用常夫见方法,例如茬Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,(1995)中描述的广泛使用的分子克隆方法通常采用的如果合适，包含使用商品试剂盒和试剂的方法一般按厂家限定的方案和/或参数进行除非另有说明。除非另有说明本文使用的所有技术术语，符号和其它科学术语设定具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义在一些情况下，具有通常理解含义的术语为了清楚和/或便于参考在本文中进行了定义本文中该定义的内涵不应必然解释成表示它与本領域通常的理解有实质性区别。下文提供了某些术语的定义"洛伐他汀"(Mevacor)是由土曲霉产生的真菌聚酮化合物(参见，例如A.W.Alberts,J.等，尸rac.胸/.^c"d(/5*.爿.7-3961和A.Endo,>/1980，33'334-336;囷J.K.Chan,等,J爿w.Cto.5bc.1983船,;Y.Yoshizawa,等，/為.CW5bc.1994"6,)。它是一种药学上重要的化合物因为它对作为胆固醇生物合成限速步骤的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)具有有效抑制活性，且因此广泛用于治疗高脂血症高胆固醇血症，等等洛伐他汀也称为Mevacor。"辛伐他汀，是洛伐他汀的类似物它优于洛伐他汀，因为其不存在有害副作用且胃内吸收率高另外，已报道了辛伐他汀通过阻止Ab42即与AD相关的(3-淀粉样蛋白的生产来预防和减少阿尔茨海默氏病(AD)。夲领域已知辛伐他汀可在金属氨化物碱(metalamidebase)存在时使用曱基囟经由直接曱基化洛伐他汀分子式上的8'-曱基丁酰氧基侧链以合成法来制备C-甲基化步骤必需在极低温度下(-75至-30°)使用强碱在无水条件下进行，其在大规模生产中难以操作(参见例如，美国专利号5,393,893美国专利号4，582,915,美国专利号5763，646,美国专利号5,763,653EP专利号299,656和国际专利申请号WO99/45003，其内容在此引入以供参考)以合成法生产辛伐他汀的其它方法也是本领域已知的。例如洛伐他汀可用过量氢氧化锂水解以去掉2-曱基丁酰侧链并同时打开其6-元内酯环以产生三元醇酸。然后加热三元醇酸化合物以获得二醇内酯可保护二醇内酯的内酯环上的羟基以获得叔丁基二曱基曱硅烷基醚，然后六氢化萘环系统的C8羟基可用22-二曱基丁酸在双环己基碳二亚胺，或2,2-②曱基氯存在时酰基化产生一个化合物然后该化合物的叔丁基二曱基甲硅烷基保护基团可在最后步骤中使用氟化四丁铵去掉以产生辛伐怹汀(参见，例如美国专利号4,444,784，其内容在此引用以供参考)本文使用的"洛伐他汀衍生物"包含洛伐他汀衍生物或前体，例如普伐他汀胡伐怹汀，辛伐他汀或水解的普伐他汀四元醇。"莫那可林J变体，是指本领域公开的莫那可林J变体例如水解的普伐他汀四元醇或6-羟基-6-去曱基莫娜可林J等等。在本发明的某些实施方案中"莫那可林J变体"是指在图2中C6位置具有取代的莫那可林J化合物。在描述诸如辛伐他汀普伐他汀，莫那可林J和变体等的化合物时本领域的技术人员明白该术语试图包含这些化合物以及这些化合物的盐(例如，本领域已知的药用上可接受的盐)例如，正如本领域已知的辛伐他汀可出现游离酸形式以及辛伐他汀钠，钾或铵盐和来自碱土金属的其它盐或其它金属盐类。"土曲霉(^^wg/〃wte〃ew力，或"A^rew,'是土壤中常见的丝状子嚢菌各种土曲霉菌林是本领域已知，例如以诸如ATCC20542和ATCC20541保藏的菌抹正如本领域已知的，与丝狀真菌次生代谢产物的生物合成相关的基因可在真菌基因组上形成一簇且称为"基因簇"例如，"洛伐他汀生产基因簇"组基因包括LovA，即P450I;LovC,即脱氫酶；LovD,即酯酶和酰基转移酶；和LovF,即ScPKS或LDKS。以前已经确定这四个基因(LovA,LovCLovD，和LovF)中的每一个都是洛伐他汀合成所必需的(参见例如，美国专利号6,943,017其内容在此引入以供参考)。LovF(LDKS基因)被鉴定为聚酮合成酶基因LovD是推定的酯酶/羧肽酶样基因。以前曾实施了LovF基因的破坏(参见例如，美国专利号6,943,017其内容在此引入以供参考)。LovD与LovF相互作用产生洛伐他汀；然而LovD-LovF的相互作用不是生产辛伐他汀所必需的。另外洛伐他汀生产基因簇Φ的另一基因是LovE，它是可调控其它基因转录的Zn指基因洛伐他汀生产基因簇还包含LovB(NPKS基因)。"LDKS，或"LDKS基因"是指LovF基因即洛伐他汀生产基因簇的┅员所编码的蛋白质。LDKS代表洛伐他汀二酮合成酶LovF是产生LDKS的基因。LovF也是产生LovF蛋白的基因"LDKS基因"也指产生LDKS的基因。在洛伐他汀合成中LDKS通过縮合乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成莫那可林J的5碳单元侧链。缩合的二酮由单独的LovF结构域进行曱基化和还原性裁剪产生ci-S-曱基丁酰硫酯它在LovF的酰基载体蛋白(ACP)结构域上与磷酸泛酰巯基乙胺臂共价连接。本文使用的"LovD酰基转移酶，是指诸如土曲霉LovD多肽(例如SEQIDNO:l)的那些多肽它们可使用酰基^J旨区域特异性地酰基化莫那可林J的C8羟基以产生辛伐他汀。也正如本文所公开的LovD酶可进一步利用酰基硫酯区域特异性地酰基化水解的普伐他汀四元醇的C8羟基以产生胡伐他汀。LovD酰基转移酶包括可在例如但不限于真菌聚酮基因簇中发现的土曲霉LovD多肽(例如，SEQIDNO:1)的同源酶例如，夲领域提供了密实菌素生物合成途径的Mlc催化相同转酰基反应的证据(参见例如，Y.AbeT.等，Mo/Ge"om/cs.20022<57,636-646),而squalestatin途径中的酰基转移酶可催化ACP-结合的四酮硫酯和糖香配基之间的类似反应(参见，例如R.J.Cox,F.等，C7zewCowmw"(Tflm^2004,26>)。土曲霉LovD多肽的氨基酸序列(例如SEQIDNO:l)类似于催化卩-内酰胺型抗生素水解失活的C型(3-内酰胺酶(参见，例如E.Lobkovsky,E.M.等,所oc/zem&^y,1994，33,和A.Dubus,D.等所oc/ze肌《/，)土曲霉LovD多肽(例如，SEQIDNO:l)与e"&TOfca"erc/o"caeP99内酰胺酶(参见例如，S.D.Goldberg,等尸rafe/"2003，72)的序列对比显示出中等序列同源性，包括潜在的保守活性位点残基例如催化性Ser76，Lys79,Tyrl88和Lys315(参见，例如S.D.Goldberg,等，iV幽."5W.2003"，)LovD酰基转移酶也可指与土曲霉LovD多肽(例如，SEQIDNO:1)在序列上相关但含有轻微氨基酸差异(例如1-10个氨基酸取代突变)的遗传改造和天然存在的酶。例如辛伐他汀可由在序列上相似于土曲霉LovD多肽(例如，SEQIDNO:l)的天然存在的酶(例如來自密实菌素基因簇的MICH)产生。"LovD酰基转移酶"也可指土曲霉LovD多肽(SEQIDNO:l)的突变体本领域已知该突变体可用标准分子生物学技术来制备，以便产生例洳改进催化效率或类似特征的SEQIDNO:1的突变体例如，我们目前^f吏用合理和定向的进化方法来改进土曲霉LovD的催化转化率一般来说，该突变体与SEQIDNO:1具有50%-99%的序列相似性在本文中，术语"LovD同源性酶"包括与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,95%97%,98%或99%序列相同性的LovD多肽，其中该多肽具有利用酰基硫酯区域特异性地酰基化莫那可林J的C8羟基以产生辛伐他汀和/或利用酰基硫酯区域特异性地酰基化水解的普伐他汀四元醇的C8羟基以产生胡伐他汀的能力该突变体容易制备且随后在观察诸如辛伐他汀的目的化合物生产的试验中可得到鉴定(一般使用土曲霉LovD多肽(例如，SEQIDNO:1)他汀"异源性"在涉忣诸如编码序列和调控序列的核酸序列时表示在正常情况下与重组构建体的区域不相连，和/或在正常情况下与特定细胞无关的序列因此，核酸构建体的"异源性"区域可以是在天然情况下未发现与另一核酸分子相连的位于该另一核酸分子内部或与其连接的可鉴定的核酸片段唎如，构建体的异源性区域可包括一个编码区其侧翼为在天然情况下未发现与该编码区相连的序列。同样用正常情况下在宿主细胞中鈈存在的构建体转化的宿主细胞可认为是异源的(参见，例如美国专利号5，712146，6,558,9426,627,427，5,849,541在此引用其内容以供参考)。例如可分离含Lov基因的構建体并在不产洛伐他汀的真菌或酵母宿主细胞中表达，18从而可生产洛伐他汀(参见例如，美国专利号6,391,583和6,943,017,在此引入其内容以供参考)作为叧一实施例，正如本领域所知诸如细菌的原核细胞也可以作宿主细胞。也可将真菌基因克隆进表达载体中用于在原核生物中表达(参见唎如，美国专利号5,849,541,在此引入其内容以供参考)可使用诸如大肠杆菌的原核生物作为异源性宿主。可用目的基因构建质粒并将质粒转化进大腸杆菌翻译目的基因，此后可纯化该目的基因产生的蛋白质该表达和蛋白质纯化的方法是本领域已知的。例如土曲霉的LovD外显子可从汢曲霉基因组DNA逐个扩增并使用重叠延伸PCR进行剪接以产生连续的阅读框。可导入限制性位点且可将基因盒与载体连接以产生可转化进大肠杆菌的表达构建体。因此大肠杆菌可用作异源性宿主以表达土曲霉基因。大肠杆菌可与产生另一目的底物的另一菌株共培养另外，可姠该培养物或共培养物中加入底物洛伐他汀生物合成基因的异源性表达是本领域已知的(参见，例如美国专利号6,391,583和6，943017，其内容在此引叺以供参考)作为另一实施例，某些聚酮化合物例如来自真菌或其它生物体的聚酮化合物可在大肠杆菌，酵母和其它宿主生物体中进荇异源性表达。可向这些宿主生物中添加其它底物因为它们同时需要异源性表达所需的PKS和可产生PKS所需要的至少一些底物分子的酶(参见，唎如美国专利号7,011,959,其内容在此引入以供参考)。同样真菌Lov基因可在大肠杆菌或其它细菌中表达，可向这些宿主细菌中添加其它底物例如酰基-SNAC或其它酰基供体基团。这些酰基供体基团具有细胞通透性且可进入该细菌细月包。"表达载体"是指可导入宿主细胞的核酸正如本领域所知，表达载体可作为染色体的一部分或在细胞或任何细胞区室中的其它DNA,例如在细胞质中的复制载体在细胞中永久或瞬时维持表达载體还包含驱动RNA表达的启动子，该RNA—般在细胞或细胞提取物中翻译成多肽例如，本发合适启动子启动子可包含的调控序列允许调控与宿主细胞的生长相关的表达或者导致响应化学或物理刺激打开或关闭基因的表达。对于大肠杆菌和某些其它细菌宿主细胞可使用来自生物匼成酶，赋予抗生素抗性的酶19和噬菌体蛋白的基因的启动子且包括，例如半乳糖，乳糖(lac)麦芽糖，色氨酸(trp)p-内酰胺酶(b/a)，噬菌体XPL和T5启動子。另外也可使用合成启动子，例如tac启动子(美国专利号4,551,433)对于大肠杆菌表达载体，有用的是包含大肠杆菌复制起点例如来自pUC，plPplI,和pBR嘚复制起点。为了将RNA有效翻译成蛋白质该表达载体一般也含有位于待表达基因编码序列起始密码子上游的核糖体结合位点序列。其它元件例如增强子，分泌信号序列转录终止序列，和可用其鉴定和/或选择含有该载体的宿主细胞的一个或多个标记基因也可存在于表达載体中。可使用基中生长时它赋予转化细胞可选择的表型例如，可将含Lov基因簇或其部分的表达载体导入异源性宿主例如大肠杆菌中。洇此重组表达载体可含有至少一个表达系统，而后者又可由Lov的至少一部分和/或与可引起编码序列在相容宿主细胞中有效表达的启动子和任选的终止序列可操作相连的其它生物合成基因编码序列组成"编码序列"可以是"编码"特定基因的序列，例如来自Lov基因簇的基因编码序列昰当置于合适调控序列控制下时在体外或体内转录(对于DNA)或翻i,(对于mRNA)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5'(氨基)端和3'(羧基)端翻译终止密码子确萣转录终止序列通常位于编码序列的3，端DNA"调控序列"集中指启动子序列，核糖体结合位点多聚腺苷化信号，转录终止序列上游调控區，增强子等等，它集中保证编码序列在宿主细胞中的转录和翻"^奪"可操作地连接"是指元件的排列，其中配置所述组件以便完成其通常嘚功能因此，与编码序列可操作地连接的调控序列能够实现编码序列的表达调控序列不必与编码序列相邻，只要它们对于指导其表达起作用"产洛伐他汀生物体"是指本领域已知生产洛伐他汀的各种不同生物曲霉是产洛伐他汀生物体的例子。已报道产洛伐他汀(mevinolin)的非土曲霉嘚微生物包括Monascus种类例如红色红曲霉，紫色红曲霉丛毛红曲霉，Mv^ewM戸Z7扭rws,以及青霉属fPe"fc/〃/画」,菌寄生属(7/;^o，ces9,Z)oratomyces茎点霉属(P/zowa人正青霉属(^pew'c/〃f訓」，棵孓嚢菌属(ty附woascM^禾口木霉属(7Wc/zo(ie/-m^)种类，尸/c/2/a/aZwce/w^.0C朋(i/(iacan'os77ogm.co/a,米曲霉,Z)orato附yces5te附om,fe,多变拟青霉，桔青霉产黄青霉，短尾帚霉和绿色木霉(参见例如，美国专利号6,391,583;Juzlova等J.Ind.Microbiol.16:163-170;Gunde-Cimerman等，FEMSMicrobiol,Lett.132:39-43(1995);和Shindia等FolioMicrobiol.42:477-480(1997),其内容在此引入以供参考)。本文使用的"不产洛伐他汀的生物体"是指没有人工操作时不产生洛伐他汀的许多生物体(例如大肠杆菌)。例如这些生物体可通过本发明的方法诱导生产LovD，或在LovD存在时培养以便生产洛伐他汀或辛伐他汀"LDKS基因被破坏的土曲霉"包括无LDKS基因，具囿突变的LDKS基因LDKS基因被敲除，LDKS基因缺失LDKS基因的表达被破坏，或LDKS基因被破坏的土曲霉"LDKS基因被破坏的土曲霉，包括通过本领域已知的方法静默LDKS基因的土曲霉。"LDKS基因被破坏的土曲霉"是指不能产生有功能的LDKS的土曲霉"LDKS基因被^C坏的土曲霉，也可指生产有功能的LDKS的土曲霉。该LDKS可通过本领域已知的方法例如基因敲除方法来失活或抑制。存在的LDKS的量可通过本领域已知的方法减少抑制，失活或破坏LDKS基因或蛋白质嘚其它方法包括，但不限于反义，siRNARNA/，或RNA干扰正如本领域所知。本文使用的"LDKS基因"也可指LovF基因破坏LovF基因是本领域已知的(参见，例如媄国专利号6,391,583，其内容在此引入以供参考)"LDKS基因被破坏的土曲霉，一般是遗传改造的生物体。土曲霉的遗传改造是本领域已知的土曲霉Lov基因的基因破坏以前已经实现(参见，例如美国专利号6,391,583和6,943,017,其内容在此引入以供参考)。在土曲霉中特异性破坏LovF基因(产生LDKS)以前已经实现(参见唎如。美国专利号6,943,017,其内容在此引入以供参考)LovF基因的破坏可通过本领域已知的其它方法实现。LDKS基因被破坏的土曲霉可存在于发酵混合物中可向LDKS基因被破坏的土曲霉的发酵混合物中加入底物以产生洛伐他汀类似物。本文使用的"增加辛伐他汀生产的成份或方法"是指一种合成或忝然的化合物或底物它增加某些中间体的生产以便增加产生的辛伐他汀量用于扩大和大规模合成辛伐他汀。增加某些中间体生产的成份戓方法是本领域已知的例如，在洛伐他汀生产中向发酵混合物中加入化合物以增加诸如莫那可林J的中间体的量是本领域已知的(参见例洳，美国专利号216,943,017,其内容在此引入以供参考)诸如莫那可林J的一些中间体也可用于生产辛伐他汀。因此可加入增加莫那可林J生产的化合物以增加辛伐他汀的生产例如，可向发酵混合物中直接加入增加莫那可林J生产的化合物以增加所产生的辛伐他汀的量增加辛伐他汀生产的荿份的例子是以ATCC保藏号98876保藏的含洛伐他汀生产基因簇D4B片段的克隆。该克隆可转化进不产洛伐他汀的生物体以产生莫那可林J正如本领域所知的。该克隆也可转化进产洛伐他汀的生物体以增加莫那可林J的生产^v而增加辛伐他汀的生产。另外增加辛伐他汀生产的成份的另一例孓是LovE/锌指基因，它可转化进产洛伐他汀的生物体以增加辛伐他汀的生产优选的是，该产洛伐他汀的生物体在LDKS基因上有破坏(参见例如，媄国专利号6,391,583其内容在此引入以供参考)。增加辛伐他汀生产的成份和方法可指许多其它成份和方法不限于上述的例子。本文公开的"酰基供体"或"酰基载体"是具有可转移到辛伐他汀和/或辛伐他汀前体或相关化合物上的酰基的化合物一般来说，"酰基供体"或"酰基载体"是将酰基基團贡献给莫那可林JC8羟基的酰基硫酯各种这类试剂是本领域已知的，本文进一步显示其具有该活性(参见例如，表1举例说明的酰基硫酯)除了本领域已知且通过本说明书显示具有该活性的那些夕卜，本领域已知具有酰基化莫那可林JC8的能力以产生辛伐他汀的任何潜在的酰基供體/载体可通过与本文公开的酰基供体(例如酰基-SNAC)的比较实验容易地鉴定。正如本领域所知酰基基团具有分子式RCON;其中R可以是烷基或芳基，N鈳以是-C1-OOCR，-NH2,-OR等等具有酰基基团的化合物包括，但不限于酰基氯，酯酰胺，或酸酐等等这些化合物可以是脂肪族或芳族，取代或未取代的例子包括，但不限于苯曱酰氯，苯甲酸酐苯甲酰胺，或苯曱酸乙酯等等酰基供体的其它例子包括，但不限于a-二曱基丁酰-SNAC,酰基^J旨，乙酰-CoA丁酰-CoA,苯曱酰-CoA,乙酰乙酰-CoA,(3-羟基丁酰-CoA,丙二酰-CoA,棕榈酰-CoA,丁酰硫酯，TV-乙酰基半胱胺硫酯(acetylcyteaminethioesters,SNAC)曱基巯基乙酸酉旨(methyl-thioglycolate，SMTG)苯曱酰-SNAC，苯曱酰-SMTG或a画S-曱基丁酰-SNAC。这些化合物可天然或合成产生且在一些情况下，它们可穿透细胞膜例如，许多这类化合物可在莫那可林J存在时加入LovD中以生產辛伐他汀本文使用的"酰基-SNAC"是指a-二曱基丁酰-SNAC。正如本领域所知酰基-SNAC在体内条件下可穿透细胞膜。LovD可使用酰基-SNAC作底物通过区域特异性地酰基化莫那可林J的C8羟基开始从莫那可林J到辛伐他汀的反应酰基-SNAC可将其酰基基团贡献给LovD。本发明的典型实施方案发明的实施方案本发明嘚一个典型实施方案是制备辛伐他汀的方法，通过将莫那可林J;在LovD酰基转移酶存在时将酰基部分贡献给莫那可林JC8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转迻酶混合起来；然后使得LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基；由此制备辛伐他汀在本发明的典型实施方案中，LovD酰基转移酶具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列本发明的一个相关实施方案是制备辛伐他汀的方法，包括将洛伐他汀；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤在该相关方法中，LovD酰基转移酶允许将洛伐他汀水解成莫那可林J;然后使用酰基硫酯的酰基区域选择性酰基化莫那可林J的C8羟基；由此制备辛伐他汀在某些实施方案中，辛伐他汀在不存在分离的生物体嘚条件下体外制备在本发明的一些实施方案中，莫那可林J;酰基硫酯和LovD酰基转移酶在产生LovD酰基转移酶的分离的生物体存在时在发酵培养基Φ混合且其中该生物体是大肠杆菌，土曲霉红色红曲霉，紫色红曲霉丛毛红曲霉,M9wcwcwv"re叫Mowascws/wZ/ge;-w51，C朋(i油ca"'cw7ogm'co/a米曲霉，Doratowyc&^te附om'to多变拟青霉，桔青霉产黃青霉，短尾帚霉或绿色木霉任选该分离的生物体是表达SEQIDNO:1的LovD多肽的土曲霉。在某些实施方案中土曲霉不表达SEQIDNO:3的LovF多肽。在本发明的某些實施方案中诸如SEQIDNOs:3和4的那些多肽的表达减少到其内源性活性的至少90,95或99%。作为选择该生物体可以是表达SEQIDNO:1的LovD多肽的大肠杆菌。在某些实施方案中该大肠杆菌不表达SEQIDNO:4的WoH多肽。因此该宿主可以是内源性产生LovD酰基转移酶的宿主或者任选是通过例如，本领域已知且在本文中进一步論述的克隆技术将LovD酰基转移酶基因导入该生物体的异源性宿主在一个典型的实施方案中，表达LovD酰基转移酶的异源性宿主是本领域已知用於该用途的细菌酵母，或真菌正如下文的详细讨论，该分离的生物体可在本领域已知的各种发酵条件之一下生长且可根据例如本发奣的实施方案中所用的具体生物体的最优化生长相关的发酵参数选择确切的条件(参见，例如Miyake等Biosci.Biotechnol.Biochem.,70(5):06)和Hajjaj等，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,67:01)引入其内容以供参考)。一般来说该生物体在30-40°C的温度下生长至少4到至少48小时的时间。一般来说该生物体在pH为6.5-8.5之间生长。在本发明的某些实施方案中,发酵培养基的pH可以昰6.9,7.0,7.17.2,7.3，7.4,7.57.6,7.7，7.87.9,8.0或8.1。在举例性的实施方案中该生物体在包含LB，F1或TB培养基的发酵培养基中生长任选的是，与本发明方法中的其它成份混合嘚莫那可林J通过发酵培养基内的分离的生物体例如，也产生LovD酰基转移酶的上述生物体之一来生产任选的是，与本发明方法中.的其它成份混合的莫那可林J可通过加入到发酵培养基中并与产生LovD酰基转移酶的生物体一起培养的产生该化合物的不同生物体来生产在本发明的另┅实施方案中，莫那可林J来自外源性来源并加入发酵混合物中任选的是，本发明的方法产生含0%-1%莫那可林J的成份的组合物该莫那可林J在開始时加入到混合物中。在本发明的某些实施方案中该方法导致加入混合物中的至少95%的莫那可林J转化成辛伐他汀。在本发明的典型实施方案中在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林JC8羟基的酰基硫酯可来源于外源性来源(例如，化学合成方法)并加入发酵混合物中夲文公开了各种这类酰基硫酯。典型的酰基硫酯是丁酰硫酯N-乙酰基半胱胺硫酯或曱基巯基乙酸硫酯。任选的是酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)嘚酰基部分。在本发明的某些实施方案中酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜。典型的是酰基硫酯选自由a-二曱基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二曱基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二曱基丁酰-S-曱基巯基乙酸酉旨(DMB-S-MTG)和二曱基丁酰-S-曱基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组Φ在举例性的实施方案，酰基硫酯是a-二曱基丁酰-S-曱基-巯基丙酸酉旨它在发酵培养基中以lmM-100mM的浓度范围混合。制备辛伐他汀的方法的某些實施方案还包括从混合物中纯化辛伐他汀的步骤例如，本发明的某些实施方案可包括至少一个纯化步骤该步骤包括裂解存在于混合物Φ的分离的生物体的细胞。该实施方案也可包括至少一个纯化步骤该步骤包括离心存在于混合物中的分离的生物体的细胞或细胞裂解产粅。该实施方案可包括至少一个纯化步骤该步骤包括沉淀存在于混合物中的一种或多种化合物。该实施方案可包括至少一个纯化步骤該步骤包括过滤存在于混合物中的一种或多种化合物。该实施方案可包括至少一个纯化步骤该步骤包括对存在于混合物中的一种或多种囮合物进行高效液相层析(HPLC)分析。本文提供的说明书表明可使用这些方法的各种改变形式制备辛伐他汀和胡伐他汀等在本发明的某些实施方案中，例如宿主生物体产生酰基硫酯和/或莫那可林J作为选择，可向该生物体中加入酰基石克酯和/或莫那可林J作为辛伐他汀生产方法的組成部分该方法可进一步包括加入具有诸如编码SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的基因的已知有利于辛伐他汀和/或胡伐他汀或类似物生产的一个或多个土曲霉基因的表达载体并将其转化进异源性宿主中，其中由此表达具有酰基转移酶活性的多肽在另一实施方案中，莫那可林J可从异源性宿主中产生夲发明的另一实施方案是在表达LovD酰基转移酶基因的生物体中从莫那可林J生产辛伐他汀的方法，包括共培养表达LovD酰基转移酶的第一生物体与產生酰基硫酯和/或莫那可林J的第二生物体(例如在发酵混合物中)，其中该酰基硫酯在莫那可林J存在时与LovD酰基转移酶基因产物相互作用产生辛伐他汀任选的是，该第一生物体是天然不产生洛伐他汀的生物体(例如用LovD酰基转移酶基因转导的大肠杆菌)。作为选择该第一生物体昰诸如土曲霉(例如，LovF/LDKS基因失活的土曲霉)的产洛伐他汀生物体该方法可进一步包含向发酵混合物中加入一种或多种外源性成份以增加诸如莫那可林J的辛伐他汀前体的生产，从而增加辛伐他汀的生产本发明的方法还可包括向发酵混合物中加入其它成份以增加莫那可林J的生产苴因此增加辛伐他汀和/或胡伐他汀的生产。作为该方法的一个举例说明的实施方案该成份可以是具有LovE基因的克隆，其中该生物体用该克隆转化且翻译LovE从而增加辛伐他汀的生产。作为该方法的另一举例说明的实施方案该成份可以是含有土曲霉基因组D4B片段的克隆(ATCC保藏号98876),其Φ用该克隆转化该生物体以增加莫那可林J的生产。本发明的另一实施方案是在外源性酰基硫酯存在时体外或体内将莫那可林J转化成辛伐他汀的方法优选的是，该酰基硫酯能够穿透细胞膜本发明的另一实施方案是在酰基硫酯存在时在产生LovD的生物体中直接在该生物体内将莫那可林J转化成辛伐他汀的方法。在本发明的一个举例说明的实施方案中该生物体是LDKS基因被破坏的土曲霉。本发明的另一实施方案是由这樣的一种方法制备的辛伐他汀产品该方法包括将莫那可林J;在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯；和LovD酰基转迻酶混合起来的步骤；并使得LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基；由此制备辛伐他汀产品。本发明的一個相关实施方案是由这样的一种方法生产的胡伐他汀产品该方法包括将水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给沝解的普伐他汀四元醇C8羟基基团的酰基硫酯；和LovD酰基转移酶混合起来的步骤；并允许LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基区域选择性地酰基化沝解的普伐他汀四元醇C8羟基，由此制备胡伐他汀产品本发明的另一实施方案是生产辛伐他汀的方法，包括在SEQIDNO:1的LovD或LovD同源物存在时将洛伐他汀水解成莫那可林J并酰基化莫那可林J其中所述的水解和酰基化产生辛伐他汀。本发明的另一相关实施方案是生产胡伐他汀的方法包括茬SEQIDNO:1的LovD或LovD同源物存在时将普伐他汀变成水解的普伐他汀并酰基化莫那可林J变体，其中所述的水解和酰基化产生胡伐他汀本发明的实施方案包括以本文公开的方法用于制备和/或制备而成的成份的组合物。例如本发明的一个实施方案是包含下列成份的组合物莫那可林J;在LovD酰基转迻酶存在时将酰基基团贡献给莫那可林JC8羟基的酰基硫酯。这些组合物的某些实施方案中的成份还包括LovD酰基转移酶这些组合物的某些实施方案中的成份还包括辛伐他汀。任选的是该组合物还包括分离的生物体，例如大肠杆菌土曲霉，红色红曲霉紫色红曲霉,丛毛红曲霉,Mowoscwv^ews,Mowoscws"wZ^e-i^,Ca"c油car/os77ogm.co/a，米曲霉Dora/cw_yc&sWewom'fe，多变拟青霉,桔青霉,产黄青霉短尾帚霉或绿色木霉。在典型的实施方案中该组合物中的生物体是表达SEQIDNO:1的LovD多肽的土曲霉或夶肠杆菌。在本发明的一个实施方案中该生物体是不表达SEQIDNO:3的LovF多肽的土曲霉。在本发明的另一实施方案中该生物体是不表达SEQIDNO:4的bioH多肽的大腸杆菌。在本发明的某些实施方案中组合物中分离的生物体已用编码SEQIDNO:1的土曲霉LovD多肽的表达载体转导。本文公开了可用于本发明的组合物Φ的各种酰基硫酯典型的酰基硫酯是丁酰硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或曱基巯基乙酸硫酯任选的是，酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)的酰基部分在本发明的某些实施方案中，酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜典型的是，酰基硫酯选自由a-二曱基丁酰-S-曱基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)二曱基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二曱基丁酰-S-曱基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二曱基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组中。在举例性嘚实施方案中酰基硫酯是a-二曱基丁酰-S-曱基巯基丙酸酯，它在发酵培养基中以ImM-lOOmM的浓度范围混合且一般可以是大约10,2030，40,50,6070,80或90mM。在本发明的一些实施方案中该组合物还包括洛伐他汀且该组合物中辛伐他汀的量大于组合物中洛伐他汀的量。正如下文所详细讨论的用于制备辛伐怹汀的本发明的方法和材料可修改为生产结构上类似于辛伐他汀的化合物，例如胡伐他汀在本文中，本发明的一个实施方案是制备胡伐怹汀的方法包括将水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给水解的普伐他汀四元醇C8羟基基团的酰基硫酯；和LovD酰基轉移酶混合起来的步骤；然后允许LovD酰基转移酶使用酰基硫酯的酰基区域选择性地酰基化水解的普伐他汀四元醇C8羟基，由此制备胡伐他汀夲发明的一个相关实施方案是包含下列成份的组合物水解的普伐他汀四元醇；在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团贡献给水解的普伐他汀四元醇C8羟基基团的酰基硫酯；LovD酰基转移酶；和胡伐他汀。本发明的另一实施方案是包含一或多种胡伐他汀前体的组合物例如，27在硫酯存在时沝解的普伐他汀四元醇或6-羟基-6-去甲基莫娜可林J,其中该硫酯的选择在于其具有酰基化莫那可林J或诸如水解的普伐他汀四元醇的莫那可林变体嘚C8羟基基团的能力一般来说，该组合物还可包括上述生物体因此，本发明的实施方案包括制备基本上为本文公开和举例成份的辛伐他汀或胡伐他汀组合物的方法如果生产辛伐他汀的改造生物体(例如，LDKS基因破坏的土曲霉)也产生洛伐他汀(例如一点最小残留量)，本文公开嘚方法和材料允许改造生物体中的生化途径/过程以便辛伐他汀或诸如胡伐他汀的相关化合物是这些途径的主要产物一个相关实施方案是包含生物体和由该生物体产生的辛伐他汀和/或胡伐他汀的成份的组合物，其中该组合物中辛伐他汀和/或胡伐他汀的量大于组合物中洛伐他汀的量本发明的一个相关实施方案是包含LovD，水解的普伐他汀和酰基硫酯的成份的组合物。在举例性的实施方案中组合物的成份包含產生胡伐他汀的大肠杆菌。在有关实施方案中该组合物的成份是产生胡伐他汀的土曲霉(例如，LDKS基因破坏的土曲霉)如果生产胡伐他汀的妀造生物体(例如，LDKS基因破坏的土曲霉)也产生洛伐他汀(例如一点最小残留量)，本文公开的方法和材料允许改造生物体中的生化途径/过程以便胡伐他汀是这些途径的主要产物一个相关实施方案是包含生物体和由该生物体产生的胡伐他汀的成份的组合物，其中该组合物中胡伐怹汀的量大于组合物中洛伐他汀的量在本发明的某些实施方案中，其它的成份和/或方法步骤可与上述一种或多种方法和材料组合例如，该方法还可包括使用高细胞密度发酵以增加LovD酰基转移酶的有效浓度和优化发酵条件和/或通过蛋白质工程增加LovD酰基转移酶对一种或多种酰基^5克酯的催化效率可4吏用许多其它的成份或方法增加辛伐他汀的生产或有利于辛伐他汀生产的中间化合物的生产。如上所述在许多生粅体中观察到洛伐他汀的生产(需要LovD酰基转移酶活性)，例如土曲霉红色红曲霉，紫色红曲霉丛毛红曲霉，MowawwMomoscws戶6/gez-wsCaw/油car/os77ogm'co/a，米曲霉Z)orato附yc&s他wom'to，多变擬青霉桔青霉，产黄青霉短尾帚霉或绿色木霉。鉴于本文公开的本发明的特性使用已知方法和材料与本文提供的说明书相结合，本領域的技术人员可将一种或多种这些生物体的培养物(或已知产生洛伐他汀的任何其它生物体)与莫那可林J和在LovD酰基转移酶存在时将酰基基团貢献给莫那可林J的C8羟基基团的酰基硫西旨(例如a-二曱基丁酰-SNAC)混合以使用LovD酰基转移酶制备辛伐他汀。例如正如本说明书所示，本发明的特性允许人们在本领域已知的各种产洛伐他汀生物体中制备辛伐他汀和相关化合物而不需要关于这些生物体中表达的具体LovD酰基转移酶特征嘚任何具体知识。在新生物体(例如与土曲霉相关的真菌种类)中制备辛伐他汀和/或检测该生物体的该生产能力的举例性方法中，第一个步驟是制备莫那可林J和将酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基基团的酰基硫酯的混合物在第二个步骤中，将该混合物随后与该生物体(例如产洛伐他汀生物体)在发酵混合物中混合并使其生长。在第三个步骤中接着通过例如，使用下面实施例中所述的HPLC分析检测该混合物中存在的辛伐他汀由于高通量筛选方法是本领域已知的(参见，例如Kittel等Metab.Eng.2005，7(1):53-58,在此引入以供参考)该方法可在大量测试样品，例如本领域已知且技术囚员容易得到的巨量真菌培养物上进行以便容易地确定是否有和哪一种生物体表达具有LovD酰基转移酶活性的多肽使其可用于本文公开的本發明的实施方案。本文公开的方法也允许技术人员分离和复制出其它的LovD酰基转移酶实施方案例如具有诸如在各种反应条件下稳定性增强囷/或在各种反应条件下酶动力学良好的其它所需特性的那些实施方案。在本文中本发明的另一实施方案是鉴定本发明的其它LovD酰基转移酶嘚实施方案，该方法包括将可能表达LovD酰基转移酶的生物体(例如产洛伐他汀的生物体)或来自该生物体的细胞提取物与在LovD酰基转移酶存在时將酰基基团贡献给莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯(例如，a-二甲基丁酰-SNAC)混合且随后检测该混合物中存在的辛伐他汀的简单步骤存在辛伐他汀表礻存在所需的LovD酰基转移酶活性。由于有本文公开的方法以及本领域已知的高通量筛选方法(参见例如，Kittel等Metab.Eng.):53-58，在此引入以供参考)该方法鈳在大量测试样品，例如本领域已知且技术人员容易得到的巨量真菌培养物(例如产洛伐他汀的培养物)上仅用最少量的实验来实施。因此本领域已知的许多产洛伐他汀的生物体，本领域已知的高通29量筛选方法和本说明书可指导人们容易地确定是否有和哪一种多肽具有LovD酰基轉移酶活性使得它们可用于本文公开的本发明的实施方案。一旦使用这些方法观察到LovD酰基转移酶活性它随后可用于本领域可接受的方法中以克隆编码具有该活性的蛋白质的基因。作为选择随后可单独使用LovD酰基转移酶多核普酸序列(例如，来自土曲霉)或与上述功2具有同源性的新LovD酰基转移酶多核苷酸序列)在本文中，LovD的同源性酶可在例如但不限于，真菌聚酮基因簇中找到例如，密实菌素生物合成途径中嘚Mlc涉及催化相同的转酰基反应(参见例如，Y.AbeT.等，Afo/Ge"^G^"cwz'd636-646)，而squalestatin途径中的酰基转移酶看催化ACP-结合的四酮硫酯和糖普配基(参见例如，R.J.CoxF.等，C&mComww"〈Caw^2004,20)の间的类似反应。LovD的氨基酸序列类似于C型(3-内酰胺酶它催化(3-内酰胺型抗生素的水解失活(参见，例如E.Lobkovsky,E.M.等，伤oc/ze脂'sfo^1994,33，和A.Dubus,D.等所oc/7e肌1993，"2,537-543)LovD与e"tera6a勿c/麵aeP99內酰胺酶(参见，例如S.D.Goldberg，等5W.2003，")的序列对比显示出中等序列同源性，包括潜在保守的活性位点残基例如催化性Ser76，Lys79,Tyrl88和Lys315(参见，例如S.D.Goldberg,等，尸rate/"5W.20037二)。由于这些方法本发明的另一实施方案是与SEQIDNO:l所示的氨基酸序列具有至少80%,85%，卯％,95%96%,97%，98%,或99%的序列相同性的分离LovD酰基转移酶多肽其Φ该多肽在合适酰基硫酯供体(例如，a-二曱基丁酰-SNAC)存在时具有酰基化莫那可林JC8羟基的能力如本文所述，"区域选择性地酰基化(regioselectivelyacylate)莫那可林JC8羟基嘚酰基硫酯"是具有可转移到莫那可林J或相关化合物上以便按本文所述制备辛伐他汀或相关化合物的酰基基团的化合物各种该试剂是本领域已知的且本文进一步显示具有该活性(参见，例如表l中举例的酰基硫酯)。除了本领域已知且通过本说明书显示具有该活性的那些外本領域已知(或从头合成)具有酰基化莫那可林JC8的能力以产生辛伐他汀的任何潜在的酰基供体/载体可通过与本文公开的酰基供体(例如，酰基-SNAC)的比較实验容易地鉴定一般在该实验中，酰基硫酯是丁酰硫酯N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基巯基乙酸硫酯。任选的是酰基硫酯包含中等链长(C3-C6)嘚酰基部分。在本发明的某些实施方案中酰基硫酯能够穿过在发酵培养基内生长的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜。典型的是酰基硫酯选自由a-二甲基丁酰-S-甲基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二曱基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二曱基丁酰-S-曱基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)和二曱基丁酰-S-甲基巯基丁酸酯(DMB-S-MMB)组成的组中如本说明书所示，本发明的特性允许人们能够以最少量实验容易地鉴定一个化合物是"区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯"茬鉴定一个化合物是"区域选择性地酰基化莫那可林J的C8羟基的酰基硫酯，的一个举例性方法中，第一步是制备莫那可林J和土曲霉的混合物在第二步中，随后将该混合物与待测化合物在发酵混合物中混合并使其生长在第三步中，随后通过例如使用在下面实施例中所讨论嘚HPLC分析检测该混合物中存在的辛伐他汀，其中存在辛伐他汀鉴定该化合物具有该活性根据本领域已知的高通量筛选方法(参见，例如Kittel等，Metab.Eng.20057(1):53-58,在此引入以供参考)，该方法可在大量待测样品上进行以便容易地测定是否有和哪一种酰基供体化合物具有使其可用于本文公开的本发奣的实施方案中的效用本发明的实施方案还包括设计成有利于本发明方法的生产物品和/或试该试剂盒可包含被分区的载体装置以便封闭哋容纳一个或多个容器装置，例如小瓶试管，等等每个容器装置中包含用于该方法的一个单独成份。例如一个容器可包含例如，装囿LDKS基因破坏的土曲霉的一个小瓶和装有酰基-SNAC化合物或类似物的另一小瓶两个小瓶都可加入发酵混合物中以产生辛伐他汀。在本发明的一個典型实施方案中提供了含有用于生产辛伐他汀的材料的生产物品。该生产物品包括容器和标签合适的容器包括，例如瓶子，小并瓦注射器，和试管该容器可由诸如玻璃或塑料的各种材料构成。例如该容器可容纳产生辛伐他汀的成份的组合物(例如，酰基载体和苼物体)容器上或与其相连的标签表明该组合物用于检查细胞多肽。例如生产物品还可包含第二容器，该容器包含用于加入发酵混合物Φ的另一化合物或底物例如，该化合物或底物可用于增加辛伐他汀生产中某些中间体31例如莫那可林J的生产。它还可包括从商品和用户角度所需的其它材料包括其它緩沖液，稀释剂滤器，针头注射器，和带有使用说明的包装插件本发明的其它生物学特性在下面部汾讨论。本发明实施方案的生物化学特性书的下面部分和实施例中LovD酰基转移酶是SEQIDNO:1所示的土曲霉LovD多肽，且一般称为"LovD"或"LovD酶"检查了LovD酶与可供選择的酰基供体的搭配。我们发现酰基载体/供体不必与LDKS连接可供选择的含巯基载体是合适的，包括酰基-CoA(辅酶A)且更重要的是膜通透性酰基-SNAC(图7)。我们发现LovD不必与LovF相互作用且可接受各种不同供体的酰基基团我们还发现LovD可转移各种酰基底物到莫那可林J的C8-羟基上产生一种类型的洛伐他汀类似物。我们发现LovD可用各种酰基底物区域选择性地酰基化莫那可林JC8羟基位置其中成功的酰基是a-二甲基丁酰-SNAC，它在LovD和莫那可林J存茬时产生辛伐他汀我们还发现LovD的转酰基化活性可在体外证实并在异源性宿主中重建。我们发现LovD用a-二曱基丁酰直接酰基化莫那可林J以产生藥学上重要的辛伐他汀a-二曱基丁酰-SNAC是细胞可通透的。a-二曱基丁酰-SNAC的细胞可通透特性具有重要含义该化合物可作为体内前体提供给生物体例如表达LovD的原核生物或真核生物。当在莫那可林J存在时(内源性制备或外源性加入发酵培养基中)发酵时，原核生物或真核生物可直接提供辛伐他汀例如，检查了大肠杆菌作为微生物宿主将莫那可林J生物转化为辛伐他汀莫那可林J和二曱基丁酰-SNAC都可加入过表达LovD酶的大肠杆菌菌林的生长培养基中(图10)。从产量良好的发酵培养液中分离了辛伐他汀该技术可用于天然洛伐他汀生产者土曲霉中。可构建LDKS缺陷型菌林使其不能合成2-曱基丁酸酯侧链a-二曱基丁酰-SNAC可加入发酵培养基中。辛伐他汀可在该单步骤发酵期间合成如上所述，LovD可催化洛伐他汀生物匼成期间最后的酰基转移步骤且可区域特异性乙酰化莫那可林J中的C8羟基基团LovD显示出对十氢化萘糖苷配基，酰基载体和酰基基团的广阔底粅特异性当添加非天然底物a-32二曱基丁酰-SNAC时，LovD在体外和体内都可产生药用上重要的辛伐他汀当a-二曱基丁酰硫酯前体供应给土曲霉的LovF-缺陷型菌抹时，可改道洛伐他汀生物合成途径直接产生辛伐他汀本发明允许1);默生物转化莫那可林J成为辛伐他汀(图10);2)共培养LovD过表达菌林与产生莫那可林J的菌抹；和3)单步发酵土曲霉(^1LZ^:》产生辛伐他汀。在每一情况下酰基底物a-二曱基丁酰-SNAC可以是化学合成的并加入到发酵液中。LOVD不需与LOVF相互作用且LOVD可催化酰基-COA和其它可供选择的含巯基载体的转酰基反应(图5)我们首先检查了酰基-CoA是否可用作转酰基反应的底物。LovD的连续基因通过偅叠延伸PCR使用剪接从土曲霉基因组DNA扩增并插入pET28a表达载体中过表达可溶的，N-末端6xHis融合的LovD在大肠杆菌菌抹BL21(DE3)/pAW31中进行LovD使用镍-NTA亲和柱纯化到同质(朂终产量40mg/L)。底物莫那可林J(lmM)通过LiOH水解洛伐他汀来制备并加入含纯LovD(lO1iM)和丁酰-CoA(4mM)的反应混合物中丁酰-CoA是最好地模拟天然a-曱基丁酸酯侧链的商业上可獲得的酰基-CoA。该反应混合物在室温下温育用乙酸乙酯提取并通过HPLC和LC-MS分析(图5)。在反应混合物中形成与洛伐他汀具有相同紫外吸收的单一更疏水的化合物它与莫那可林J的消失相关联(图5，痕迹a)发现新化合物的质量为391(M+H)，与丁酰基团添加到莫那可林J上一致莫那可林J的C8羟基选择性酯化产生4通过质子NMR光谱法(CDCl3，500MHz)证实4(内酯化形式)的质子NMR除了线性酰基侧链的脂肪族信号外几乎与洛伐他汀相同。4中诊断性H8多重谱线(指定使鼡'H」HCOSY！H-"CHMQC和'H^CHMBC)前移为55.38，相比较在莫那可林J中相同质子观察到54.23这与C8酰氧基取代的去屏蔽效应一致。携带其它羟基基团的碳的质子Hll和H13分别从莫那可林J上的54.71和54.38改变为4中的54.51和S4.36正如图5A所示(痕迹a),使用丁酰-CoA作为酰基供体在10小时后观察到87%的莫那可林J转化成4。时间-过程研究揭示出0.18分"的表观转囮率(图5B)观察到的87%转化很可能接近平衡，正如图5B所证实为了检查转化平衡的生化特性，我们测定了LovD是否也催化反向的水解反应33事实上，当洛伐他汀用作唯一底物时容易^T测到莫那可林J的形成，其kw和Km值分别为0.21±0.01分"和0.56±0.05mM(图5C)当LovD上推定的活性位点丝氨酸(Ser76)突变成丙氨酸时，检测鈈到4的形成或洛伐他汀的水解(图5A,痕迹b)4的酶合成证实了LovD确实催化图4所示的酰基转移反应。另外该结果表明催化转化不需要LovF与LovD结构域之间嘚直接相连，与以前假定的LovD催化模式相反(参见例如，J.Kennedy,K.等6We"ce，/卯兒284禾口C.R.Hutchinson,J.等,^wfow/eKaw丄eewwew/zoeA:2000，75,287-295)酰基-S-CoA可取代酰基-S-LovF，虽然由于丧失潜在的蛋白质-蛋白质相互作用很可能具有明显更高的Km用一些不同的商业上可获得的酰基取代基进行转酰基试验揭示了LOVD对中等链长(C3-C6)的酰基有偏好我们通过用各种商业上可获得的酰基-CoAs进行转酰基试验测定了LovD对不同酰基取代基的耐受性(表1A)。所有试验用lmM莫那可林J,4mM酰基-CoA和10uMLovD进行10小时我们的结果清楚地表明LovD對中等链长(C3-C6)的酰基显示出偏好性，以丁酰-CoA为最佳烷酰基-CoA底物令人惊奇的是，更大体量的苯甲酰-CoA是所检查的最佳酰基底物之一将几乎70%的辛伐他汀转化成相应的8-苯酰氧基-洛伐他汀类似物(表观kca「0.16分-')。导入a-P不饱和显著降低反应率正如在巴豆酰-CoA存在时可见6%的莫那可林J酰基化。乙酰乙酰-CoA和P-羟基丁酰-CoA都是LovD的优秀底物与分别来自天然宿主的莫那可林X(参见，例如A.Endo，K.等/1986，3S,321-327)和莫那可林M(参见例如，A.Endo,D.等0-1673)的分离良好吻合。在所测定的CoA底物中LovD对丙二酰-和棕榈酰-CoA无活性。酰基-SNAC更便于合成制备且在体内条件下可穿透细胞膜换用这种酰基载体进行另外的转酰基化试验，揭示了酰基-SNAC是LOVD的有效底物34为了进一步检查LovD对备选酰基载体特別是那些更便于合成制备、且在体内条件下可穿透细胞膜的酰基載体的底物特异性，我们测定了丁酰-硫酯的两个变体作为LovD的底物(图5)N-乙酰基半胱胺硫酯(SNAC)已被广泛用作探针和研究天然产物生物化学的前体(參见，例如Auclair等，5We"ce-369)。最近表明曱基巯基乙酸硫酯(SMTG)是红霉素的前体定向生物合成中SNAC的廉价替代物(参见例如，S.Murli,K.S.等彻/.jE謂.醒.Mz'Co/.2005，77)。图5(痕迹c和d)顯示了当这些丁酰硫酯用作酰基供体时将莫那可林J转化成4SNAC和SMTG硫酯都能有效代替丁酰-CoA,其表观keat值分别为0.09分-'和0.23分"(图5B)，进一步表明LovD与LovF之间的蛋白-疍白相互作用以及LovD与磷酸泛酰巯基乙胺臂之间的相互作用不是酰基转移所必需的。然而丁酰硫代乙烷不是LovD的有效底物且仅支持4。/的莫那可林J转化成4。同样苯曱酰-SNAC和苯曱酰-SMTG可有效替代苯曱基-CoA,其表观k。at值分别为0.12分"和0.15分"(表1A)使用a-S-甲基丁酰-SNAC和a-二甲基丁酰-SNAC测定洛伐他汀和辛伐怹汀的体外化学酶法合成揭示了莫那可林J在酰基-SNAC存在时转化成辛伐他汀随后我们合成了anS-曱基丁酰-SNAC和a-二曱基丁酰-SNAC并分别测定了洛伐他汀和辛伐他汀的体外化学酶法合成。结果在图8和表1A中表示洛伐他汀和辛伐他汀的可靠样品用作HPLC检测的参照(图8,痕迹a)。与丁酰-戊酰-和己酰-SNAC相比，囹人惊奇的是天然的a-S-曱基丁酸酯侧链是更差的底物洛伐他汀合成的表观keat(0.04分")比LovD对丁酰-SNAC低50%以上。这表明野生型LovD对转移分支的底物不是最优选嘚在a-位置加入第二个曱基取代进一步降低乙酰化率，很可能是由于增加了二曱基部分的空间位阻在标准测定条件下，当a-二曱基丁酰-SNAC用莋底物时大约10%的莫那可林J转化成辛伐他汀(表观kcat-0.02分")。当100uMLovD和过量10倍的a-二曱基-SNAC或a-二甲基-SMTG加入体外反应混合物中时我们能够达到的平衡转化率>70%(图8,痕迹b和c)LOVD能够体外转移各种酰基底物(不仅是LDKS)到莫那可林J的C-8-羟基基团以产生一类洛伐他汀类似物为了测试LovD对莫那可林J变异体的底物特异性，峩们试^r了四元醇7转化成8普伐他汀(5)和胡伐他汀(6)(图9)。以前已显示了当给莫那可林J生物合成阻断的土曲霉突变体供应8-desmethyl-莫那可林J时可容易地分離密实菌素(参见，例如J.L.Sorensen,K.等，所omo/.C7zew.2003/，50-59)这暗示LovD可耐受十氢化萘核心C6位置的取代。事实上LovD对C6羟基取代显示出不严格的特异性并以更高效率催化7的酰基化。使用相应的酰基硫酯合成8普伐他汀，或胡伐他汀的表观转化率分别为0.18,0.11,0.03分"可信的普伐他汀的滞留时间与酶合成的化合物楿同。通过LC-MS证实了新形成的化合物的质量我们在反应混合物中未检测到任何二酰基化产物。体内数据表明LOVD可用于洛伐他汀类似物的制备型生物合成为了证实LovD可用于洛伐他汀类似物的制备型生物合成我们首先尝试使用大肠杆菌作为异源性宿主进行体内苯曱基化反应。BL21(DE3)/pAW31过表達菌抹在摇瓶(200mL)中生长至OD6oo为1.0此时向培养基中加入1mMIPTG,0.8mM莫那可林J和4mM苯曱酰-SNAC或苯曱酰-SMTG。LovD的表达和生物转化在18°C下进行提取培养物并分析8-苯曱酰-莫那可林J的形成。当添加苯曱酰-SNAC时在诱导后20小时内检测到84。/的莫那可林J转化。该产物经内酯化并通过单硅胶层析步骤纯化NMR光谱证实C8羟基的区域选择性苯曱酰化，因为诊断性H8多重谱线前移到55.61相反，添加苯曱酰-SMTG的培养基观察到仅40%苯曱酰化苯曱酰-SMTG被大肠杆菌迅速降解且在24尛时后的培养基中检测不到痕迹。在纯化的LOVD和莫那可林J存在时酰基底物a-二甲基丁酰-SNAC产生辛伐他汀36我们用a-二曱基丁酰-SNAC作底物进行低细胞密喥发酵以便以单个生物合成步骤从莫那可林J产生辛伐他汀。培养2天后我们观察到~90%的莫那可林J转化成辛伐他汀(参见，例如下面列出的"发酵條件")纯化该产物且质子和碳NMR光谱与以商品购买的化合物相同。辛伐他汀的产量较低与体外观察到的转化率较慢一致在SNAC前体细胞内浓度較低时产量进一步减少。其它因素例如辛伐他汀的可逆水解(我们观察到在LovD存在时的辛伐他汀水解，即水解kcat(0.02分")比图5C所示的洛伐他汀水解慢10倍)和延长发酵后LovD的失活可导致观察到的转化我们预期通过一些方法可明显提高该产量，例如l)使用高细胞密度发酵增加LovD的有效浓度和最优囮发酵条件；2)通过蛋白质工程增加LovD对非天然前体的催化效率本申请全文中引用了各种出版物。这些出版物的公开内容以其整体在此引入鉯供参考实施例下面的实施例提供了可用于实施本文公开的本发明的各种实施方案的举例性的方法和材料。实施例l:举例性的LOVD酰基转移酶嘚克隆表达和纯化土曲霉LovD的三个外显子可从土曲霉基因组DNA逐个扩增并通过重叠延伸PCR使用剪接法产生连续的阅读框。分别在5和3，外侧引粅上引入限制性位点AWeI和历mfln将该基因盒连接进pET28(Novagen)以产生表达构建体pAW31。用pAW31转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌抹在LB培养基中在37°C下生长到OD,为0.5此时向培养基中加叺1mMIPTG且在18。C下进行表达24小时离心收集细胞，重悬于緩冲液A(50mMTris,pH.8.02mMDTT,2mMEDTA)中并通过超声裂解。离心去掉细胞碎片和不溶性蛋白(17,000g,4C，l小时)为了清除裂解粅，加入2mL的Ni-NTA树脂(Qiagen)使用咪唑浓度增加的缓冲液A的梯度纯化LovD。纯化的(>95%)LovD蛋白质在含250mM咪唑的緩冲液A中洗脱将緩冲液更换成不含咪唑的緩冲液A，濃缩分成等分试样并迅速冷冻。冷冻的LovD等分试样仅单次使用我们观察到在重复冷冻-解冻循环后酶活性明显降低。实施例2:举例性的发酵條件发酵条件500mL培养物中含带有30mg/L卡那霉素的LB培养基在OD纖为1.0时，将细胞浓缩至最终OD6oo为5.0并用1mMIPTG诱导加入底物莫那可林J和a-二曱基丁酰-SNAC至终浓度为1mM囷4mM。在不同时间点收集培养基样品，离心过滤并注射到HPLC(20nL)上。提取条件当达到最大转化时酸化培养液至pH为2.0,用乙酸乙酯提取，干燥并重溶于曱苯中莫那可林J的内酯形式使用以前所述的soxhlet装置通过回流获得(参见，例如J.L.So扁en，K.等Og.肠膨/.C77泄2003,/，50-59)诸如LB，Fl或TB发酵培养基的各种发酵培養基是本领域熟知的它们可用于或改良用于本文公开的本发明的实施方案，包括LBTB和F1培养基。改良用于培养诸如土曲霉和丛毛红曲霉的苼物体的其它培养基也是本领i或熟知的(参见例如，Miyake等Biosci.Biotechnol.Biochem.,70(5):06)和Hajjaj等，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,67:01),引入其内容以供参考)典型的LuriaBertani培养基(LB)配方如下10g胰蛋白胨5g酵母提取物10gNaCl1L蒸馏水pH臸~7.3-7.5。典型的TB配方如下3gPipes(10mM)2.2gCaCl2H20(15mM)18.6KC1(250mM)10.9gMnCl2(55mM)1L蒸馏水用KOH调pH至6.7-6.8典型的Fl培养基可参见美国专利号5,064,856,其内容在此引入以供参38考。一般地所述培养基在配制后通过诸如过濾或高压灭菌的方法灭菌。实施例3:通过缺失5/(W/在大肠杆菌中提高辛伐他汀的生物转化本实施例进一步鉴定了洛伐他汀基因簇中编码的LovD多肽(也參见Xie等(2006)ChemBiol13:)。LovD催化洛伐他汀生物合成的最后一步并负责将大合成酶LovF的2-曱基丁酸酯侧链转移到直接生物合成前体即莫那可林J(MJ)酸上(参见，例如Kennedy等，(1999)Science284:)我们证实了LovD对十氢化萘核心，硫酯酰基单元和硫酯酰基载体表现出宽广的底物特异性使用过表达LovD的大肠杆菌菌林和可穿透细胞膜的硫酯二曱基丁酰-S-曱基巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)(图13A)，我们开发了在一步法中以高产率将MJ酸转化为辛伐他汀酸的全细胞生物催化方法(参见例如，Xie等(2007)ApplEnvironMicrobiol73:)。该发酵方法相对于目前的合成途径在经济上是有竟争力的选择硫酯DMB-S-MMP是辛伐他汀生物转化的整合成份。它是检查的酰基转移反应中催化效率最高的酰基供体之一而其合成成本最低。与该化合物相关的一个明显的缺点是DMB-S-MMP中曱酯键的水解产生二甲基丁酰5克基丙酉吏(dimethylbutyrylmercaptopropionicacid,DMB-S-MPA)(图13)该水解反应是酶促反应，因为在不存在大肠杆菌时没有观察到降解且该反应在高细胞密度发酵期间显著提高。鉴于如下三个原因该副反应是鈈希望发生的l)该底物的水解消耗了LovD-催化的转酰基化中可利用的DMB-S-MMP,需要以高摩尔过量地加入碌L酯且在发酵期间需频繁补充；2)由于DMB-S-MPA与DMB-S-MMP相比作为二曱基丁酸供体的效率更低(慢大约10倍)(参见例如，Xie等(2007)ApplEnvironMicrobiol73:)，更可溶的DMB-S-MPA积聚可用作LovD的竟争性酰基底物这有效降低了反应速度且被体外使用純化嘚LovD证实。因此生物转化的总时间被不必要地延长；和3)DMB-S-MPA的羧酸部分干扰了生物转化完成时培养基中辛伐他汀酸的纯化。酸化培养基时两种囮合物都从培养液中沉淀出来且在辛伐他汀结晶前需要其它分离步骤尽管用过量水洗涤过滤物可去掉DMB-S-MPA，但在洗涤步骤期间损失了相当量嘚辛伐他汀导致总回收率降低。39因此消除不需要的水解副反应可提高全细胞生物催化过程和下游纯化步骤的经济效率因此最直接的目標是查明负责该不需要的副反应的酶。在此我们教导了将BioH鉴定为大肠杆菌羧酸酯酶它将DMB-S-MMP水解成DMB-S-MPA。通过构建LovD过表达菌抹的AbioH衍生物我们完铨消除了该竟争性反应且进一步提高了辛伐他汀酸全细胞生物催化合成的稳健性(robustness)。材料菌林和质粒莫那可林J和DMB-S-MMP按以前所述制备(参见，例洳Xie等，(2007)ApplEnvironMicrobiol73:)所有试剂从标准来源购买。BL21(0￡3)菌林|17-omphsdSB(rB-mB-)galdcmX(DE3)]从Novagen获得Keio集合物(collection)从日本国家遗传研究所获得(参见，例如Baba等，(2006)MolSystBiol2:)单基因敲除突变体衍生自BW25113菌抹[rrnB3DElacZ4787hsdR514DE(araBAD)567DE(rhaBAD)568rph-l]。WA837(rB-mB+,galmet),即限制性-减型和改良性-力口型大肠杆菌B菌抹从TheColiGeneticStockCenter(CGSC)获得(参见，例如Wood,W.B.(1966).JMolBiol16:118-133)。质粒pAW31(kanr)和pXK8(kanr)从pET28a获得且含有分别来自土曲霉的lovD基因和来自大肠杆菌的bioH基洇基于全细胞的水解试验来自Keio集合物的选定57个突变体与BW25113,BL21(DE3)和BL21(DE3)/pAW31在96-孔深孔培养板上在1mLLB培养基中37°C下生长至饱和。向各培养物中加入纯净的DMB-S-MMP(5iuL)至终濃度为20mM摇动10小时(20。C300rpm)后，各培养物用等体积的乙S吏乙酯(EA)/1/0乙酸(AcOH)提取。干燥有机相重溶于20)iL乙腈(CH3CN)中，取l|uL点样到TLC板(硅胶60F254)上TLC板用含20%EA的己烷走樣并用碘显色。化合物的分析还使用分析型C18柱(AlltechApollo5u,150mmX4.6mm)以HPLC进行；线性梯度在5分钟内从含60%CH3CN的水溶液(0.1%三氟乙酸[TFA])到含95%CH3CN的水溶液(0.1%TFA)含95%CH3CN的水溶液(0.1%TFA)10分钟，流速为1mL/汾钟HPLC滞留时间(tR)如下MJ内酯形式3.40分钟；DMB-S-MPA:3.82分钟；DMB-S-MMP:6.80分钟；辛伐他汀内酯形式8.45分钟。HPLC分析前MJ和辛伐他汀酸都^皮内酯化BIOH的纯化和酶试验使用引物5,-AACATATGAATAACATCTGGTGGCA-3，(SEQIDNO:5)囷5-AAGAATTCTACACCCTCTGCTTCAACG曙3，(SEQIDNO:6)通过含侧翼限制性位点Ndel和EcoRI的PCR从大肠杆菌基因组DNA扩增bioH基因消化基因盒并连接进pET28a以产生表达构建体pXK8。用pXK8转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌林在LB培养基中37°C下生长至OD600为0.5,此时向培养基中加入0.1mMIPTG并在20°C下表达16小时细胞重悬于緩冲液A(50mMTris-HCl,pH8.0，2mMDTT,2mMEDTA)中并用超声裂解BioH的纯化借助于N-末端6xHis标记和Ni-NTA树脂(Qiagen)。几乎纯嘚(〉95/。)BioH在含250mM咪唑的緩冲液A中洗脱该緩冲液更换成缓冲液A，浓缩分成等分试样并迅速冷冻。水解试验在室温下在50mMHEPESpH7.9中进行。加入硫酯底物DMB-S-MMP至终浓度在0.1mM和1.0mM之间为了帮助溶解DMB-S-MMP,对于所有样品加入DMSO至终浓度为10%。加入BioH(0.01ILiM)开始反应且通过加入等体积的EA/l/。AcOH在所需时间点(10,20,30分钟)结束反应分离有机相，干燥并再溶于20的ACN中以HPLC分析。通过整合234nm处的峰值定量DMB-S-MMP向DMB-S-MPA的转化。BioH对三种二曱基丁酰^5克酯的催化效率的比较在1mM底物浓度和10nMBioH濃度下进行PI转导按标准方法(参见例如，Miller,J.H.(1992)细菌遗传学短期教程大肠杆菌和相关细菌的实验室手册ColdSpringHarbor,NY:ColdSpringHarborPress),PI转导用于构建BL21(DE3)的AbioH缺失突变体。由于大肠杆菌K菌林(BW25113)和B菌林(BL21)之间存在不同的限制性系统将B菌抹WA837(rB-,mB+)用作转导的中间宿主。首先将AbioH::FRT-kan-FRT标记从JW3375转导至WA837以产生YT0(WA837AbioH::FRT-kan-FRT)使用BL21(DE3)作受体和YT0作供体，构建菌抹YT1(BL21AbioH::FRT-kan-FRT叺(DE3))YT1菌林用含温度敏感性复制子和热诱导型FLP基因的辅助质粒41pCP20转化(参见，例如Datsenko等，(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:;和Wanner,2000)按公开的方法(参见例如，Datsenko等(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:;和Wanner,2000)去掉kan标记产生YT2((BL21AbioH::FRT人(DE3))。使用PCR证实YT2的遗传改变设计了三个引物。引物Bl:5-TGACGGCTTCGCTATCCCAT-3，(SEQIDNO:7);B2:5-TACACCCTCTGCTTCAACG陽3，(SEQIDNO:8);和B3:5-GCTGGATTGTTTCGCCGATC-3，(SEQIDNO:9)分别退火到上游基因yhgA保留完整的bioH3，端和下游基因gntX上。使用YT2基因组DNA作模板的PCR反应中预期的产物是Bl/B2:602bp;Bl/B3:1002bp使用BL21(DE3)基因组DNA作模板的PCR反应中预期的产物是Bl/B2:1271bp;Bl/B3:1771bp。观察各菌林预期的PCR产物全细胞的生物催化从MJ酸和DMB-S-MMP完全细胞催化合荿辛伐他汀酸按所述进行(参见，例如Xie等,(2007)ApplEnvironMicrobiol73:)。平行培养大肠杆菌BL21(DE3)/pAW31和YT2/pAW31菌抹用于比较单个克隆的新转化菌株用于接种添加了35mg/L卡那霉素的5mLLB培养基並在37°C下生长过夜。第二天早晨将100pL的过夜培养物接种进含LB培养基，Fl基础培养基和添加0.15mg/L生物素的Fl培养基的50mL培养液中通过定期测量OD600读数监測生长率。当OD600达到~0.5时向培养物中加入100|uMIPTG且在20°C下进行LovD的表达16小时。为了^f莫拟高密度发酵条件在加入底物前将细胞浓缩10倍。一般来说将該培养物的14mL等分试样转移到15mL离心管中并离心收集细胞(4。C,4000g,10分钟)将细胞沉淀轻轻重悬于1316|Lil上清中，随后加入84piMJ酸贮液(250mM的水溶液)(终浓度为15mM)然后将濃缩培养物分成7个200样品并向各样品中加入1.2|iL纯DMB-S-MMP(终浓度为25mM)。然后培养物在室温下以300rpm摇动在各时间点，通过加入10pL20%SDS裂解细胞接着用500^iLEA/l。/AcOH经液-液提取进行总提取。去掉有机相蒸发，并再溶于50]uLACN中用于HPLC分析对于BL21(DE3)样品，在12小时后再加入1.2pL等分试样的DMB-S-MMP以补充水解的底物42BIOH鉴定为DMB-S-MMP酯酶我们艏先打算鉴定负责发酵期间观察到的将DMB-S-MMP水解成DMB-S-MPA的大肠杆菌酶。当诸如二曱基丁酰-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二曱基丁酰-S-曱基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)的不同酰基載体用作硫酯底物时我们在发酵培养基中观察到相应的水解羧酸。这表明负责的酶是酯酶或水解酶它对酯官能团具有松散的底物特异性。我们利用大肠杆菌K-12阅读框内单基因敲除突变体文库(Keio集合物)使用高通量法鉴定了负责的酶(参见例如Baba等，(2006)MolSystBiol2:)我们有理由认为不能水解DMB-S-MMP的任一突变菌株都是直接由于特定的基因缺失。检查大肠杆菌基因组图谱(参见例如，Blattner等(1997)Science277:)揭示了23个酯酶/酯酶样酶，94个水解酶/水解酶样酶囷16个酰基转移酶(133个总候选基因)。在第一轮试验中没有检查证实有活性和底物不可能涉及DMB-S-MMP水解的酶检查的57个BW25113突变体菌林的目录在表2中显示。突变体野生型BW21113和BL21(DE3)在96-孔培养板的LB培养基中生长至饱和。我们向各培养物(lmL)中加入5)LiL纯的DMB-S-MMP并在室温下剧烈摇动培养板又IO个小时酸化培养物，鼡乙酸乙酯提取通过薄层层析(TLC)使用能够分离DMB-S-MMP和DMB-S-MPA的流动相(含20%乙酸乙酯的己烷)分析有机相(图14A)。野生型BW25113(泳道58)和除了AbioH(泳道56,菌抹JW3357)外；险查的所有突变体显示出对DMB-S-MMP的水解活性。这一惊人发现表明涉及生物素(维生素H)生物合成的BioH(参见例如O'Regan等，(1989)NucleicAcidsRes17:8004)可能是负责观察到的体内水解的唯一酶使鼡HPLC的另外检查进一步证实了在△bioH突变体的有机提取物中不能检测到DMB-S-MPA,而在bioH+菌抹中几乎30%水解(图14B)。体外证实BIOH的特性为了证实BioH直接涉及发酵期间水解DMB-S-MMP我们克隆了bioH基因并作为BL21(DE3)中N-his-标记的蛋白质表达它(参见例如，Tomczyk等(2002)FEBSLett513:299-304)。使用Ni-NTA亲和色谱法将该蛋白质纯化至同质得到9mg/L的最终产量测定BioH对DMB-S-MMP的催囮特性且通过HPLC(234nm)测量水解程度。BioH对DMB-S-MMP表现出Michaelis-Menten动力学且测定kcat和Km值分别为260±45秒-1和229±26ILiM(图15A)使用HPLC测定法也检查了BioH对其它二曱基丁酰硫酯的活性且在图15B中顯示。在相同反应条件下(lmM底物10nMBioH),我们观察到BioH显示出对DMB-S-MMP的有效酯酶活性最大。将羧酸骨架长度减少1个碳导致水解率降低2.5倍(DMB-S-MTG),而将酯部分的大小增加成乙基酯(ethylester)明显减小底物水解率(DMB-S-EMP)这些观察结果与体内结果一致，其中在存在细胞时两种底物都水解虽然程度比DMB-S-MMP更低。BioH是大肠杆菌中苼物素生物合成所必需的酶(参见例如Lemoine等，(1996)MolMicrobiol19:645-647)已有建议BioH负责合成庚二酰基-CoA(参见例如，Guillen-Navarro等(2005)FEMSMicrobiolLett246:159-165),但其确切的生化功能尚未证实。令人感兴趣的是大肠杆菌BioH的晶体结构已测定至1.7A的分辨率以致力于从结构特征预测蛋白质的功能(参见例如，Sanishvili等(2003)JBiolChem278:)。高通量结构分析法揭示了BioH中的催化三联體(catalytictriad),它也见于已知的水解酶中这暗示BioH可具有水解活性。使用对硝基酚酯的试验表明BioH显示出对短链脂肪酸酯有偏好的羧酸酯酶活性(参见例如Sanishvili等，(2003)JBiolChem278:)我们进行的体内和体外的研究都进一步解释了BioH的生化特性且显示了该酶对酯基团具有极广阔的底物特异性。相反BioH对本工作中分析的底物中存在的硫酯键没有显示出硫酯酶活性。没有观察到水解的硫酯酸的进一步降解BL21(DE3)ABIOH突变体YT2的构建鉴定和证实BioH是发酵期间负责水解DMB-S-MMP嘚酶后，显然可将BioH缺陷型大肠杆菌用作辛伐他汀酸完全细胞生物合成的宿主我们构建了不需要T7聚合酶的LovD的各种表达载体并将它们转化进JW3357。评估这些菌林中辛伐他汀酸的生物转化率表明LovD的活性明显低于BL21(DE3)/pAW31反应速度减慢主要归因于在这些宿主/载体组合中通过SDS-PAGE测定的LovD表达水平降低。因此我们推断BL21(DE3)的AbioH衍生物是实现最大转化率，同时消除底物水解所必需的每个Keio集合物的单基因敲除突变体都含有代替靶基因的卡那黴素抗性基因(参见例如,Baba等，(2006)MolSystBiol2:)该标记的侧翼为有助于容易地通过FLP酶去掉该标记的FRT位点。我们使用Pl转导从JW3357取出AbioH::FRT-kan-FRT标记移植进BL21(DE3)由于供体K菌林和受体B菌抹之间的限制性差异，我们使用大肠杆菌WA837(限制性-减型改良性-加型)作为Pl转导的中间宿主(参见例如，Dien等(2001)JIndMicrobiolBiotechnol27:259-264)。将该标记移植进BL21(DE3)后产生YT1含有温度敏感性复制子和热诱导型FLP基因的辅助质粒pCP20(参见例如，Datsenko等(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:;和Wanner,2000)用于去掉kan基因以产生YT2(BL21(DE3)AbioH::FRT)。使用与上游和下游区退火的引物进行的PCR分析证實删除了bioH以及去掉了kan标记(数据未显示)。随后在LB培养基中培养YT2且进行了DMB-S-MMP水解试验正如预期，检测