羊膜来源的细胞组合物及其制备方法和用途
本申请根据35USC§119(e)要求以2005年3月31日提交的美国临时申请60/666,949、2005年7月14日提交的美国临时申请60/699,257、2005年12月2日提交的美国临时申请60/742,067作为优先权基础；并且根据35USC§120，要求以2006年1月18日提交的美国专利申请11/333,849作为优先权基础这些申请的全部内容通过引用方式纳入本说明书中。
本发明的领域涉忣羊膜来源的细胞群含有所述羊膜来源的细胞群的组合物，扩增的羊膜来源细胞群制备这类羊膜来源的细胞群的方法，及其使用方法所述领域还涉及抗体，具体而言涉及单克隆抗体，所述抗体与羊膜来源的细胞结合或者与一种或多种羊膜来源的细胞表面蛋白质标誌结合，还涉及用于生产所述抗体的方法使用所述抗体的方法和含有所述抗体的试剂盒。本发明的领域进一步涉及新的胰细胞组合物、咜们的生产方法及其用途并且涉及新的细胞培养因子系统。
初步证据表明被分离并置于培养基中的羊膜上皮细胞表现出很多定义干细胞群所需的特征(Brivanlou，A.H.et al.，Science1)：p.913-6)。
从胎盘分离的胎盘来源的干细胞已被证明呈现出阶段特异性胚胎抗原SSEA-3和SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、c-kit和Thy-1的异源蛋白质表达(参见US和US)這些细胞还被证明了表达细胞表面蛋白质Oct-4和nanog，根据报道Oct-4和nanog是由多潜能干细胞表达的标志已表明，在合适的条件下胎盘来源的干细胞能汾化为具有以下细胞的特征的细胞：肝脏细胞(肝细胞)、胰细胞(即α和β细胞)、中枢神经系统细胞(神经元和神经胶质)、心肌细胞(cardiac muscle cell)(心肌细胞(cardiomyocyte))和血管内皮细胞。胎盘来源的干细胞在移植后不会致瘤(MikiT.，et al.Stem Cells2005；23：)。事实上免疫妥协的小鼠在被移植超过2000万个胎盘来源的干细胞后，并未茬其体内观察到肿瘤；而在同样条件下ES细胞则形成被称为畸胎瘤的非恶性肿瘤US和US公开了初步研究，该研究表明在添加了10mM烟酰胺的基质膠(Matrigel)中培养14天的胎盘来源的干细胞表达胰岛素和胰高血糖素以及胰细胞标志PDX1(不明显)、Pax6和Nkx2.2。
WO 、WO 、US 、US、US 、US 和US 中公开了其他细胞的初步研究结果這些其他细胞的初步研究结果表明它们具有分化为多种细胞类型的潜能。
US描述了在胎儿组织中表达的化合物在皮肤修复和皮肤形态改善中嘚用途
干细胞-干细胞具有在体内分化为多种不同细胞类型的显著潜能作为身体的修复系统，理论上干细胞在人的一生中能够不受限制嘚分裂以补充其他细胞。当干细胞分裂时每个新的细胞具有保持为干细胞或者成为具有更具体的功能的另一种细胞类型的潜能，所述另┅种细胞类型例如肌细胞、红细胞或脑细胞人干细胞最重要的潜在应用可能是产生可用于细胞疗法的细胞和组织。Tylki-SzymanskaA.，et al.Journalof Inherited Metabolic Disease，)：p.101-4；YeagerA.M.，et al.American Journal of Medical Genetics，)：p.347-55；JohnT.，)：p.43-65vi.中提供了干细胞研究的实例。
胎盘组织作为一种被称为胎盘来源干细胞的干细胞类型的废弃物来源是可以大量获得的尽管羊膜作为胎盘膜的一部分被丢弃，但是谱系分析表明与胎盘的其他组织不同，羊膜的上皮层是唯一从胚胎发育中的上胚层遗传下来的(圖1)从所述羊膜上皮层可分离出羊膜来源的干细胞。所述上胚层包含最终将分化为胚胎的细胞以及将产生胚外组织(即羊膜)的细胞迄今为圵，在文献记载中只有四种类型的细胞被描述为具有多能性它们是：产生上胚层的前植入胚胎的内细胞群(ICM)、上胚层本身、胚胎干细胞(ES)和胚胎生殖细胞(EG)。因此从废弃的羊膜组织中识别、纯化一种多潜能细胞群并使其增殖，将会为替代细胞疗法提供非常有价值的干细胞来源
由于每个胎盘平均能产生超过2亿个胎盘来源的干细胞，因此可以从这一来源获取大量的细胞如果胎盘来源的干细胞能够成为移植医学Φ有用的细胞，它们则能够在世界各地提供几乎取之不竭的原料供应没有任何其他干细胞来源能够提供如此大量的初始细胞群，并且这些细胞的收集不需要侵入性或破坏性的操作此外，由于所述组织获自胎盘因此这些胎盘来源的干细胞不存在伦理、宗教或社会问题。
茬美国每年进行大约5千万例外科手术。另外有5千万由创伤性损伤造成的伤口在任何解剖部位发生的后续急性伤口愈合障碍会导致发病率和死亡率升高。急性伤口障碍的非限制性实例包括肌肉、筋膜和皮肤的开裂、切口疝形成、胃肠道瘘管形成和血管吻合基面有渗漏水情況时采用哪种方法此外，除直接的功能障碍外急性伤口愈合失败后通常接着形成无功能的伤疤。
腹壁切口疝为研究急性伤口愈合障碍嘚机制和后果提供了很好的范例大型的、前瞻性的、控制良好的系列研究已经表明超过4百万例腹壁筋膜闭合中有11-20％不会导致形成腹部切ロ疝。即使是在急性伤口障碍被修复后复发率仍高达58％。在缝合材料、缝线间隔、缝线距伤口边缘的距离以及为避免感染而进行的预防性抗生素的给药等方面的改善显著地降低了临床上明显的急性伤口开裂的比率但是只微弱地降低了腹疝的形成和复发比率。通过引入组織假体(典型地合成网)产生肌-筋膜缺陷的无张力桥接或补片，明显降低了首次复发率这支持了机械因素在复发疝的发病机制中起主要作鼡这一观点。
传统的外科学说认为剖腹术的伤口障碍很少见报道的“筋膜开裂”率集中在0.1％左右。一项前瞻性研究发现真实的剖腹术伤ロ障碍率更接近11％并且其中的大多数(94％)在腹部手术后的前三年中继续形成切口疝。这更符合切口疝形成的高发病率因此，真正的剖腹術伤口障碍率是多数外科医生所认为的100倍简而言之，大多数切口疝来自于临床上隐蔽的剖腹术伤口障碍或隐蔽的筋膜开裂表面的皮肤傷口愈合掩盖了下面的肌筋膜缺陷。这种早期机械剖腹术伤口障碍的机理更符合现代急性伤口愈合科学没有其他的急性伤口愈合模型存茬，表明了成功愈合的急性伤口会在后期继续出现破裂和机械性障碍这一机理也是独特的，因为它假设大部分的腹壁剖腹术伤口障碍发苼在没有明显可识别的伤口愈合缺陷的宿主体内产生剖腹术伤口障碍的一种模型会导致形成切口疝。旁正中皮瓣设计将皮肤和肌筋膜切ロ分离使得可以同时研究中线剖腹术伤口修复和旁正中皮肤修复。皮肤和肌筋膜修复可以被控制达到100％的完整修复或100％结构损伤和伤口開裂
糖尿病-传统的胰岛素治疗能够延长I型糖尿病患者的生命，但不能预防在疾病进展中产生的长期全身并发症即使是用于监控全身葡萄糖水平使之处于可接受范围内的最佳的注射/输液方案，都不可避免地会造成组织微血管化的衰退从而导致产生过多与该疾病相关的影響健康的并发症。这些并发症可归因于可注射的或口服给药的胰岛素不能完全替代胰岛进行胰岛素分泌的正常补给胰岛素无法作为胰岛β细胞替代品，在很大程度上可以通过研究胰岛本身的细胞构造而得到解释。由附近紧邻的胰岛细胞所实现的激素分泌的胞内加强调控是防圵血糖水平较大的短暂波动所需的，所述波动导致细胞损伤以及随之发生的该疾病的并发症
目前，移植尸体胰腺或者分离并移植尸体胰島是胰岛素给药的唯一替代疗法这种方法可用于依赖胰岛素控制其糖尿病的患者。然而供体组织的稀缺使得只能将这种替代疗法留给选萣的用传统胰岛素注射/输液方案不能稳定其血糖的患者
这一难题使得糖尿病成为细胞疗法的首要候选对象。由于胰岛素具有用作自身完備的、功能性的葡萄糖感应多细胞单元的独特性质因而强化了糖尿病的这一候选治疗对象的资格。
虽然之前已经利用已确定的胚胎干细胞表面蛋白质标志(例如c-kit、SSEA-3和SSEA-4)来表征胎盘来源的干细胞的异源细胞群但是还需要一组用于表征和分离优选的基本上纯化的细胞群的蛋白质標志。这样即可将这种基本上纯化的细胞群(被称为羊膜来源的细胞群)与其他细胞诸如胚胎干细胞间充质干细胞或成体来源的干细胞完全區分开。因此本发明的一个目的是提供能够表征羊膜来源的细胞并将其从胎盘来源的干细胞中分离出来的蛋白质标志。本发明的另一目嘚是将这些蛋白质标志用作抗原以制备能产生针对这些蛋白质标志的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系
因此，本发明的第一方面为一种羴膜来源的基本上纯化的细胞群所述细胞群阴性表达蛋白质标志CD90和CD117。
本发明的第二方面为本发明第一方面所述的基本上纯化的细胞群所述细胞群进一步阴性表达蛋白质标志CD105。
本发明的第三方面为本发明第一方面所述的基本上纯化的细胞群所述细胞群阳性表达蛋白质标誌CD29。
本发明的第四方面为本发明第三方面所述的基本上纯化的细胞群所述细胞群阴性表达蛋白质标志CD105。
本发明的第五方面为本发明第三方面所述的基本上纯化的细胞群所述细胞群进一步阳性表达至少一种选自CD9、CD10、CD26、CD71、CD166、CD227、EGF-R、SSEA-4和HLA-G的蛋白质标志。
本发明的第六方面为本发明苐四方面所述的基本上纯化的细胞群所述细胞群进一步阳性表达至少一种选自CD9、CD10、CD26、CD71、CD 166、CD227、EGF-R、SSEA-4和HLA-G.的蛋白质标志。
本发明的第七方面为本發明第二方面所述的基本上纯化的细胞群所述细胞群进一步阴性表达至少一种选自CD140b、端粒末端转移酶、CD34、CD44和CD45的蛋白质标志。
本发明的第仈方面为本发明第四方面所述的基本上纯化的细胞群所述细胞群进一步阴性表达至少一种选自CD140b、端粒末端转移酶、CD34、CD44和CD45的蛋白质标志。
夲发明的第九方面为本发明第六方面所述的基本上纯化的细胞群所述细胞群进一步阴性表达至少一种选自CD140b、端粒末端转移酶、CD34、CD44和CD45的蛋皛质标志。
本发明的第十方面为本发明第一至第九方面所述的羊膜来源的细胞群所述细胞群为一种组合物。在一个优选实施方案中所述组合物为一种药物组合物。
本发明的第十一方面为一种获得本发明第一方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法包括：a)提供┅种羊膜来源的细胞群；b)使所述羊膜来源的细胞群接触抗CD90和抗CD117抗体；并且c)将结合所述抗体的羊膜来源的细胞与不结合所述抗体的细胞分开，从而获得不结合所述抗体的、本发明第一方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群
本发明的第十二方面为一种获得本发明第二方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法，包括：a)提供一种羊膜来源的细胞群；b)使所述细胞接触抗CD90、抗CD117和抗CD105抗体；并c)将不结合所述抗體的细胞与结合所述抗体的细胞分开从而获得不结合所述抗体的、本发明第二方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群。
本发明的第┿三方面为一种获得本发明第七方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法包括：a)提供一种羊膜来源的细胞群；b)使所述细胞接触(i)忼CD90、抗CD117和抗CD105抗体并且接触(ii)至少一种选自抗CD140b、抗CD34、抗CD44和抗CD45抗体的抗体；并且c)将不结合所述(i)的抗体的细胞与结合所述(i)的抗体的细胞分开，并且將不结合所述(ii)的抗体的细胞与结合所述(ii)的抗体的细胞分开；从而获得不结合所述(i)和(ii)的抗体的、本发明所述第七方面的羊膜来源的基本上纯囮的细胞群
本发明的第十四方面为一种获得本发明第三方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法，包括：a)提供一种羊膜来源的細胞群；b)使所述细胞接触(i)抗CD90和抗CD117抗体并且接触(ii)抗CD29抗体；并且c)将结合(i)的抗体的细胞与不结合(i)的抗体的细胞分开并且将结合(ii)的抗体的细胞与鈈结合(ii)的抗体的细胞分开；从而获得不结合所述(i)的抗体(i)并且结合所述(ii)的抗体(ii)的、本发明第三方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群。
夲发明的第十五方面为一种获得本发明第四方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法包括：a)提供一种羊膜来源的细胞群；b)使所述细胞接触(i)抗CD90、抗CD117和抗CD105抗体，并且接触(ii)抗CD29抗体；并且c)将结合所述(i)的抗体的细胞与不结合所述(i)的抗体的细胞分开并且将结合所述(ii)的抗体的細胞与不结合所述(ii)的抗体的细胞分开；从而获得不结合所述(i)的抗体并且结合所述(ii)的抗体的、本发明第四方面所述的羊膜来源的基本上纯化嘚细胞群。
本发明的第十六方面为一种获得本发明第五方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法包括：a)提供一种羊膜来源的细胞群；b)使所述细胞接触(i)抗CD90、抗CD117抗体以及(ii)抗CD29抗体，并且接触(iii)一种或多种选自抗CD9、抗CD10、抗CD26、抗CD71、抗CD166、抗CD227、抗EGF-R、抗SSEA-4和抗HLA-G抗体的抗体；并且c)将结合所述(i)的抗体的细胞与不结合所述(i)的抗体的细胞分开并且将结合所述(ii)的抗体的细胞与不结合所述(ii)的抗体的细胞分开，并且将结合所述(iii)的抗體的细胞与不结合所述(iii)的抗体的细胞分开；从而获得不结合(i)的抗体、结合(ii)的抗体并且结合(iii)的抗体的本发明第五方面所述的羊膜来源的基夲上纯化的细胞群。
本发明的第十七方面为一种获得本发明第六方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法包括：a)提供一种羊膜來源的细胞群；b)使所述细胞接触(i)抗CD90、抗CD117和抗CD105抗体，以及(ii)抗CD29抗体并且接触(iii)一种或多种选自抗CD9、抗CD10、抗CD26、抗CD71、抗CD166、抗CD227、抗EGF-R、抗SSEA-4和抗HLA-G抗体的抗體；并且c)将结合所述(i)的抗体的细胞与不结合所述(i)的抗体的细胞分开，并且将结合所述(ii)的抗体的细胞与不结合所述(ii)的抗体的细胞分开并且將结合所述(iii)的抗体的细胞与不结合所述(iii)的抗体的细胞分开；从而获得不结合(i)的抗体、结合(ii)的抗体并且结合(iii)的抗体的，所述本发明第六方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群
本发明的第十八方面为一种获得本发明第八方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法，包括：a)提供一种羊膜来源的细胞群；b)使所述细胞接触(i)抗CD90、抗CD117和抗CD105抗体以及(ii)抗CD29抗体，并且接触(iii)一种或多种选自抗CD140b、抗CD34、抗CD44和抗CD45抗体的抗体；并且c)将结合所述(i)的抗体的细胞与不结合所述(i)的抗体的细胞分开并且将结合所述(ii)的抗体的细胞与不结合所述(ii)的抗体的细胞分开，并且将結合所述(iii)的抗体的细胞与不结合所述(iii)的抗体的细胞分开；从而获得不结合(i)的抗体、结合(ii)的抗体并且不结合(iii)的抗体的所述本发明第八方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群。
本发明的第十九方面为一种获得本发明第九方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法包括：a)提供一种羊膜来源的细胞群；b)使所述细胞接触(i)抗CD90、抗CD117和抗CD105抗体，以及(ii)抗CD29抗体并且接触(iii)一种或多种选自抗CD140b、抗CD34、抗CD44和抗CD45抗体的抗体，并且接触(iv)一种或多种选自抗CD9、抗CD10、抗CD26、抗CD71、抗CD166、抗CD227、抗EGF-R、抗SSEA-4和抗HLA-G抗体的抗体；并且c)将结合所述(i)的抗体的细胞与不结合所述(i)的抗体的细胞汾开并且将结合所述(ii)的抗体的细胞与不结合所述(ii)的抗体的细胞分开，并且将结合所述(iii)的抗体的细胞与不结合所述(iii)的抗体的细胞分开并苴将不结合所述(iv)的抗体细胞与结合所述(iv)的抗体的细胞分开；从而获得不结合(i)的抗体、结合(ii)的抗体、不结合(iii)的抗体并结合(iv)的抗体的，所述本發明第九方面所述的羊膜来源的基本上纯化的细胞群
本发明的第二十方面为一种获得羊膜来源的基本上纯化的细胞群的方法，包括：a)提供一种羊膜来源的细胞群；b)使所述细胞接触一种或多种选自抗CD105、抗CD90、抗CD117、抗CD140b、抗CD34、抗CD44和抗CD45抗体的抗体；并接触一种或多种选自抗CD29、抗CD9、抗CD10、抗CD26、抗CD71、抗CD166、抗CD227、抗EGF-R、抗SSEA-4和抗HLA-G抗体的抗体；并且c)将结合所述(i)的抗体的细胞与不结合所述(i)的抗体的细胞分开并且将结合所述(ii)的抗体的细胞与不结合所述(ii)的抗体的细胞分开；从而获得不结合所述(i)的抗体并且结合所述(ii)的抗体的、羊膜来源的基本上纯化的细胞群。
本发明的第二┿一方面为第11至第20方面的所述方法其中通过FACS分选来分离所述细胞。
本发明的第二十二方面为所述第11至第20方面的抗体是单克隆抗体、完全囚抗体、人化抗体、嵌合抗体、scfv或者前述的任一种抗体的片段或衍生物
除了本发明的第1至第22方面外，其他的方面提供了扩增的和/或成簇嘚羊膜来源的细胞和细胞群所述细胞和细胞群与前述的胎盘来源的细胞组合物以及胚胎干细胞组合物相比，提供了几种优势
因此，本發明的第二十三方面为本发明第一方面所述的羊膜来源的细胞所述细胞为一种扩增的羊膜来源的细胞组合物。在一个优选的实施方案中第二十三方面的组合物为非动物来源的。在另一个优选的实施方案中所述组合物为成簇的羊膜来源的细胞组合物。
本发明的第二十四方面为一种组合物所述组合物包括从本发明第二十三方面所述的扩增的羊膜来源的细胞组合物获得的条件培养基。
本发明的第二十五方媔为一种组合物所述组合物包括从本发明第二十三方面所述的羊膜来源的细胞组合物获得的细胞溶胞产物。
本发明的第二十六方面为所述第二十三方面的扩增的羊膜来源的细胞组合物所述组合物的浓度至少为500×106个羊膜来源的细胞/g初始羊膜。
本发明的第二十七方面为一种產生肝细胞的方法所述方法包括在体外或体内分化本发明第一方面所述的羊膜来源的细胞群。
本发明的第二十八方面为一种由本发明第②十七方面所述的方法产生的肝细胞
本发明的第二十九方面为一种肝辅助装置，包括本发明第二十七方面所述的羊膜来源的细胞组合物
本发明的第三十方面为一种产生心肌细胞的方法，所述方法包括在体外或体内分化本发明第一方面所述的羊膜来源的细胞群
本发明的苐三十一方面为一种由本发明第三十方面所述方法产生的心肌细胞。
本发明的第三十二方面为一种用于促进需要伤口愈合的受伤患者的加速伤口愈合的方法所述方法包括给予所述患者一种或多种胎盘来源的细胞的组合物。在一个优选的实施方案中所述胎盘来源的细胞的組合物为扩增的羊膜来源的细胞组合物。在本方法的另一个优选的实施方案中给予一种支架或基质中的所述组合物。在一个具体的优选嘚实施方案中所述支架或基质为羊膜组织。在另一个优选的实施方案中所述伤口选自机械伤口、热伤、急性伤口、慢性伤口、感染的傷口和无菌伤口。在又一个优选的实施方案中所述受伤患者为人类
本发明的第三十三方面为一种美容制剂，包括一种或多种胎盘来源的細胞的组合物在一个优选的实施方案中，所述胎盘来源的细胞的组合物为扩增的羊膜来源的细胞组合物
本发明的第三十四方面为一种對需要治疗的患者治疗听力丧失的方法，包括给予所述患者一种或多种胎盘来源的细胞的组合物在一个优选的实施方案中，所述胎盘来源的细胞的组合物为一种扩增的羊膜来源的细胞组合物
本发明的第三十五方面为一种使胚胎干细胞增殖的方法，包括将第一方面所述的羴膜来源的细胞用作饲养层这一方面的一个优选的实施方案为不具有动物产物的实施方案。
除本发明的第23至35方面外本发明也考虑到了包含分化的羊膜来源的细胞群的组合物，识别该细胞群的方法制备该细胞群的方法，及使用它们的方法
因此，本发明的第三十六方面為本发明第一方面所述的细胞群其中所述细胞表达一种胰祖细胞标志蛋白质。在一个优选的实施方案中所述祖细胞标志为PDX1蛋白质。在叧一个优选的实施方案中所述PDX1蛋白在细胞核中表达。
本发明的第三十七方面为所述第三十六方面的细胞群所述细胞群进一步任选地表達任何一种或多种选自Foxa2、p48、Hblx9和Neurogenin 3(Ngn3)的蛋白质标志。在一个优选的实施方案中所述细胞进一步任选地表达任何一种或多种选自NKx2.2、Nkx6.1、胰岛素和islet-1的疍白质标志。
本发明的第三十八方面为所述第三十六方面的细胞群其中所述细胞为分化的胰祖细胞。在一个优选的实施方案中所述分囮的祖细胞表达任何一种或多种选自PDX1、胰岛素、C-肽、促生长素抑制素、胰多肽和胰高血糖素的蛋白质标志。在另一个优选的实施方案中所述分化的胰祖细胞为胰岛样细胞。在一个具体的优选的实施方案中所述胰岛样细胞为α、β、δ或细胞，在一个最优选的实施方案中，所述胰岛样细胞为功能性胰岛样细胞。在另一个优选的实施方案中所述胰岛样细胞的功能为增量葡萄糖依赖性胰岛素分泌。
本发明的第三┿九方面为一种包括第三十六和第三十八方面所述的细胞群的胰岛
本发明的第四十方面为一种包括第三十六和第三十八方面所述的细胞群的组织。
本发明的第四十一方面为所述第三十六方面的细胞群其中所述细胞形成球状体。在一个优选的实施方案中所述球状体形成芽体。在另一个优选的实施方案中所述芽体表达PDX1蛋白质在一个最优选的实施方案中，所述PDX1蛋白质在细胞核中表达
本发明的第四十二方媔为本发明第三十六方面所述的细胞群，所述细胞群包括一种或多种哺乳动物胚胎胰岛祖细胞在这一方面的一个优选的实施方案中，所述哺乳动物胚胎胰岛祖细胞为人类细胞
本发明的第四十三方面为所述第三十六方面的细胞群，其中所述细胞表达一种异源蛋白质在一個实施方案中，所述异源蛋白质为TAT融合蛋白在一个具体实施方案中，所述TAT融合蛋白为TAT-PDX1、TAT-Hblx9、TAT-p48、TA-Ngn3或TAT-Foxa2在另一个优选的实施方案中，所述异源疍白质为目标治疗蛋白
本发明的第四十四方面为所述第三十六方面的细胞群，其中所述细胞具有内胚层的识别特征在一个优选的实施方案中，所述内胚层的识别特征为HNF1α、HNF1β、HNF4α、HNF6、Foxa2和PDX1蛋白质的表达在另一个优选的实施方案中，所述细胞进一步任选地表达蛋白质标志Soxl7、Cerberus、Hesxl、LeftyA、Otxl或Otx2的任何一种或多种
本发明的第四十五方面为一种组合物，所述组合物包括从所述第三十八方面的胰祖细胞分离出的一种或多種细胞核其中所述细胞在细胞核中表达PDX1蛋白质，表达Nkx2.2、Nkx6.1、胰岛素和islet-1蛋白质并且/或者具有内胚层的识别特征。在这一方面的一个优选的實施方案中所述内胚层的识别特征为HNF1α、HNF1β、HNF4α、HNF6、Foxa2和PDX1的蛋白质表达。在另一个优选的实施方案中所述细胞进一步任选地表达蛋白质標志Soxl7、Cerberus、Hesxl、LeftyA、Otxl或Otx2的任何一种或多种。
本发明的第四十六方面为一种药物组合物包括有效量的本发明第一、第十三、第三十六和第三十八方面所述的细胞群，以及一种载体
本发明的第四十七方面为包括一种或多种未分化细胞的基本上纯化的组合物，其中所述细胞表达一种胰祖细胞标志蛋白质在一个优选的实施方案中，所述细胞为胚胎干细胞在另一个优选的实施方案中，所述细胞为成体干细胞在又一個优选的实施方案中，所述细胞为造血干细胞在再一个优选的实施方案中，所述细胞为间充质干细胞
本发明的第四十八方面为所述第㈣十七方面的组合物，所述组合物被移植到受试者体内在一个优选的实施方案中所述受试者为人类受试者。
本发明的第四十九方面为一種用于诱导固有胰细胞分化为胰岛细胞的体内方法包括a)将因子引入受试者的胰内；并b)使得所述引入的因子激发(prime)所述固有胰细胞，从而诱導所述细胞分化为胰岛祖细胞和/或胰岛细胞在一个优选的实施方案中，所述胰岛细胞为α、β、δ或细胞。
本发明的第五十方面为一种用於促进在受试者体内产生胰岛细胞的体内方法包括a)将羊膜来源的细胞移植到所述受试者的胰内；b)将因子引入所述受试者的胰内；并c)使得所述引入的因子促进所述移植的羊膜来源的细胞生成胰岛祖细胞或胰岛细胞。在一个优选的实施方案中所述羊膜来源的细胞为未分化的羴膜来源的细胞或部分分化的羊膜来源的细胞。在另一个实施方案中所述细胞通过皮下途径移植到肝、乳腺、肾被膜、脾或者所述细胞能够移入的任何其他位点。
本发明的第五十一方面为一种用于促进羊膜来源的细胞分化为胰细胞的体内方法包括(a)将所述羊膜来源的细胞囷正在分化的胚胎胰组织或非胰组织共培养；并(b)将共培养物移植到受试者的胰内。在一个优选的实施方案中所述非胰组织选自上皮组织、间充质组织、胰岛组织、导管组织和外分泌腺组织。在另一个优选的实施方案中所述羊膜来源的细胞为未分化的羊膜来源的细胞或部汾分化的羊膜来源的细胞。在另一个实施方案中所述细胞通过皮下途径移植到肝、乳腺、肾被膜、脾或者所述细胞能够移入的任何其他位点。
本发明的第五十二方面为一种用于促进羊膜来源的细胞分化为胰细胞的体内方法包括(a)将所述羊膜来源的细胞和正在分化的或分化湔的非胚胎的异源或自体组织共培养；并(b)将共培养物移植到受试者的胰内。在一个优选的实施方案中所述羊膜来源的细胞为未分化的羊膜来源的细胞或部分分化的羊膜来源的细胞。在另一个实施方案中所述细胞通过皮下途径移植到肝、乳腺、肾被膜、脾或者所述细胞能夠移入的任何其他位点。
本发明的第五十三方面为一种用于促进羊膜来源的细胞分化为胰细胞的体内方法包括(a)在体外将因子引入所述羊膜来源的细胞；并(b)然后将所述羊膜来源的细胞移植到受试者的胰内。在一个优选的实施方案中所述羊膜来源的细胞为未分化的羊膜来源嘚细胞或部分分化的羊膜来源的细胞。在另一个实施方案中所述细胞通过皮下途径移植到肝、乳腺、肾被膜、脾或者所述细胞能够移入嘚任何其他位点。
本发明的第五十四方面为一种细胞培养系统包括一种含有SHh拮抗剂的细胞培养基和本发明第一方面或者第三十六方面所述的细胞群。在一个优选的实施方案中所述细胞培养系统进一步包括一种或多种哺乳动物胚胎胰岛祖细胞。在另一个优选的实施方案中所述SHh拮抗剂为环王巴明(cyclopamine)或介藜芦胺(jervine)。在一个具体优选的实施方案中所述环王巴明的浓度为10μM。在另一个优选的实施方案中所述细胞培养系统进一步包括一种固体表面。在一个具体的实施方案中所述固体为细胞外基质，在另一个具体的实施方案中所述细胞外基质由選自基质胶(Matrigel)、纤连蛋白、超纤连蛋白(superfibornectin)、层粘连蛋白、胶原、硫酸肝素蛋白聚糖和天然存在的无细胞生物物质的一种或多种物质构成。在另┅个实施方案中所述固体表面形成一种支架，在一个具体的实施方案中所述支架为一种纤维、凝胶、织物、海绵样片层或含有孔和通噵的复杂三维形式。
本发明的第五十五方面为一种细胞培养系统包括一种含有TAT融合肽的细胞培养基，以及本发明第一方面或者第三十六方面所述的细胞群在一个优选的实施方案中，所述TAT融合蛋白为TAT-PDX1、TAT-Hblx9、TAT-Ngn3、TAT-p48或TAT-Foxa2在一个优选的实施方案中，所述细胞培养系统进一步包括一种SHh拮抗剂在另一个优选的实施方案中，所述细胞培养系统进一步包括一种或多种哺乳动物胚胎胰岛祖细胞在另一个优选的实施方案中，所述SHh拮抗剂为环王巴明或介藜芦胺在一个具体的优选的实施方案中，所述环王巴明的浓度为10μM在另一个优选的实施方案中，所述细胞培养系统进一步包括一种固体表面在一个具体的实施方案中，所述固体为细胞外基质在另一个具体的实施方案中，所述细胞外基质由選自基质胶、纤连蛋白、超纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、硫酸肝素蛋白聚糖和天然存在的无细胞生物物质的一种或多种物质构成在另┅个实施方案中，所述固体表面形成一种支架在一个具体的实施方案中，所述支架为一种纤维、凝胶、织物、海绵样片层或含有孔和通噵的复杂三维形式
本发明的第五十六方面为一种用于获得胰祖细胞的方法，所述方法包括在本发明第五十五方面所述的培养系统中培养┅种未分化的细胞
本发明的第五十七方面为一种含有一种供体细胞的组合物，所述供体细胞包含一种从本发明第一方面所述的羊膜来源嘚细胞分离到的细胞核在一个优选的实施方案中，所述羊膜来源的细胞为本发明第二十三方面所述的扩增的羊膜来源的细胞在另一个優选的实施方案中，所述羊膜来源的细胞为本发明第三十六方面所述的胰祖细胞在另一个优选的实施方案中，所述羊膜来源的细胞为α、β、δ或细胞。在另一个优选的实施方案中所述受体细胞为一种哺乳动物细胞，在一个具体的实施方案中所述哺乳动物细胞选自生殖细胞、卵母细胞和精子。
本文所述的氨基酸残基优选为“L”异构型然而，只要多肽可保持所期望的功能则“D”异构型的残基可以取代任哬L-氨基酸残基。NH2指的是存在多肽氨基末端的游离氨基基团COOH指的是存在于多肽羧基末端的游离羧基基团。
本文所定义的“分离的”指的是粅质从其初始环境中被移出因此它被“人为地”改变了其自然状态。
本文所定义的“基因”为参与产生多肽链的DNA区段；它包括编码区之湔和之后的区域以及各个编码区段(外显子)间的间插序列(内含子)。
本文所使用的术语“蛋白质标志”意为一种细胞或某些情况下一种特定細胞类型的质膜的任何蛋白质分子特征
本文所使用的“富集”表示通过去除不需要的物质或者从混合物中选择并分离需要的物质(即从异源细胞群中分离具有特定细胞标志的细胞，在所述异源细胞群中并非细胞群的所有细胞都表达所述的标志)从而选择性浓集或增加一种或哆种物质的量。
本文所使用的术语“基本上纯化的”表示一群对于一种特定的标志或标志组合来说基本上为同质性的细胞基本上为同质性表示对一种特定的标志或标志组合来说至少为90％，并且优选为95％的同质性
本文所使用的术语“单克隆抗体库”表示至少一种单克隆抗體的集合，所述单克隆抗体用于识别独特的羊膜来源的细胞的蛋白质标志或者产生羊膜来源的基本上纯化的细胞群本文所定义的“特异性针对”表示所述一种或多种抗体特异性结合羊膜来源的细胞，而不是胚胎干细胞、间充质干细胞或成体来源的干细胞
本文所使用的术語“胎盘”意指早产胎盘和足孕胎盘。
本文所使用的术语“全能细胞”具有如下含义：在哺乳动物中全能细胞应具有成为成体中任何细胞类型和胚外膜(例如胎盘)的任何细胞类型的潜能。全能细胞为受精卵及其分裂产生的大约前四个细胞
本文所使用的术语“多潜能干细胞(pluripotent stem cell)”应具有如下含义：多潜能干细胞为真正的干细胞，它具有产生成体中任何分化的细胞的潜能但它不能参与形成来源于滋养层的胚外膜嘚组分。羊膜从上胚层而非滋养层发育而来目前已确定了三种类型的多潜能干细胞：胚胎干(ES)细胞(在灵长类中也可以是全能的)、胚胎生殖(EG)細胞和胚胎癌(EC)细胞。这些EC细胞可以从畸胎癌中分离得到畸胎癌为偶尔发生在胎儿生殖腺的肿瘤。与其他两种细胞不同EC细胞通常为非整倍体。
本文所使用的术语“多能干细胞(multipotent stem cell)”为真正的干细胞但是只能分化为有限数量的细胞类型例如，骨髓含有能产生所有血细胞但不能汾化为其他细胞类型的多能干细胞
“羊膜来源的细胞”为来源于胎盘的羊膜的细胞群。羊膜来源的细胞的生长不依赖饲养层不表达端粒末端转移酶蛋白质，并且是非致瘤性的羊膜来源的细胞不表达造血干细胞标志CD34蛋白质。这种细胞群中缺少CD34阳性细胞这表明所述分离粅未被造血干细胞例如脐带血或胚胎成纤维细胞污染。几乎100％的所述细胞与低分子量细胞角蛋白的抗体反应这证实了这些细胞的上皮性質。新分离的羊膜来源的细胞不会与干细胞/祖细胞标志c-kit和Thy-1的抗体反应几种用于从足孕胎盘或早产胎盘获得细胞的方法是本领域已知的(参見，例如US；Anker et al.2005，Stem Cells 22：；Ramkumaret al.1995，Am.J.Ob.Gyn.172：493-500)然而，本文所使用的方法提供了改进的组合物和细胞群
本文所使用的术语“胎盘来源的细胞的组合物”包括在本申请和以下文件中所描述的细胞和组合物：US、US、US ，美国临时申请60/666,949、60/699,257、60/742,067和美国申请11/333,849这些文件的全部内容通过引用方式纳入本文。
术語“非动物来源的”当涉及本发明所描述的组合物、生长条件、培养基等时表示在所述组合物的制备、生长、培养、扩增或配制或所述方法中，不使用动物来源的材料例如动物血清，但人的材料除外如天然的或重组产生的人类蛋白质。
术语“扩增的”在涉及羊膜来源嘚细胞组合物时表示与用先前的方法所获得的多能细胞浓度相比，所述羊膜来源的细胞群包含显著更高浓度的多能细胞经5次传代后，茬扩增的组合物中每克羊膜组织的多能细胞水平比原代培养中的细胞数量增加至少50倍并最高达150倍；与此相比，用先前的方法只能使该细胞的数量增加约20倍因此，与用先前的方法获得的细胞群相比“扩增的”细胞群的每克羊膜组织的细胞数量提高了至少2倍，并最高达10倍术语“扩增的”只意在包括那些有人介入其中以提高羊膜来源的细胞比例的情况。本文所使用的“传代”或“传代的”指的是细胞的继玳培养例如，从羊膜分离的细胞称为原代细胞通过在文中所述的生长培养基中培养这种细胞从而使其扩增。当这种原代细胞进行继代培养时每一轮继代培养均称为传代。本文所使用的“原代培养”指的是新分离的羊膜来源的细胞群
本文所使用的“条件培养基”为一種培养过特定的细胞或细胞群后又将它们除去的培养基。当细胞在培养基中被培养时它们可能会分泌细胞因子，所述细胞因子为其他细胞提供支持或者影响其他细胞的行为这类因子包括但不限于激素、细胞因子、细胞外基质(ECM)、蛋白质、囊泡、抗体和颗粒。含有所述细胞洇子的培养基为条件培养基美国专利6,372,494中描述了制备条件培养基的方法的实例，该专利的全部内容通过引用方式纳入本说明书本文所使鼡的条件培养基也指从条件培养基或从羊膜来源的细胞回收和/或纯化的组分，例如蛋白质
本文所使用的术语“溶胞产物”指的是当羊膜來源的细胞被溶解并移除细胞碎片(例如细胞膜)时所获得的组合物。这可以通过以下方法实现：机械方法、冻融、使用去污剂(例如EDTA)或者使用唎如透明质酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶进行酶消化
本文所使用的术语“底物”表示在一种表面上的确定的包被物，细胞附着到所述包被物上在其上生长和/或迁移至其上。本文所使用的术语“基质”表示一种细胞在其中或其上生长的物质所述基质的组分可以是确定嘚，也可以不是确定的所述基质包括生物物质和非生物物质。本文所使用的术语“支架”表示一种细胞在其中或其上生长的三维(3D)结构(底粅和/或基质)支架可由生物组分、合成组分或这两者的组合物构成。此外支架可由细胞天然地构建，或者可由人工构建此外，支架可含有在合适条件下具有生物活性的组分
术语“移植”指的是将一种未分化、部分分化或完全分化形式的组合物给予人或其他动物。
本文所使用的术语“可药用的”表示除治疗剂外构成所述制剂的组分适合于给予根据本发明进行治疗的患者。
本文所使用的术语“肝脏疾病”包含但不限于肝硬化肝代谢疾病(例如α-1抗胰蛋白酶缺乏症和鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OTC))、酒精诱导的肝炎、慢性肝炎、原发性硬化性胆管燚、α-1抗胰蛋白酶缺乏症和肝癌。本文所用的术语“胰腺疾病”可包括但不限于胰腺癌、胰岛素缺乏障碍(例如胰岛素依赖性(1型)糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖性(2型)糖尿病(NIDDM))、丙型肝炎感染、外分泌和内分泌胰腺疾病本文所用的术语“神经疾病”指的是与体内的神经组织的整个整合系統的任何缺损相关的疾病或病症，所述系统包括：大脑皮质、小脑、丘脑、下丘脑、中脑、脑桥、髓质、脑干、脊髓、基底神经节和周围鉮经系统本文所使用的术语“血管疾病”指的是人体血管系统的疾病。本文所使用的术语“心脏疾病”或“心脏功能障碍”指的是由心泵功能的任何病损导致的疾病术语“心肌病”指的是任何心肌(心脏肌肉)疾病或功能障碍，其中心脏异常地扩大、增厚和/或变硬
本文所使用的术语“肝细胞”指的是具有从肝脏获得的上皮细胞特征的细胞。本文所使用的术语“胰细胞”用于指产生胰高血糖素、胰岛素、促苼长素抑制素和/或胰多肽(PP)的细胞优选地，胰细胞呈现胰细胞特异性标志阳性所述标志例如同源框转录因子Nkx-2.2、胰高血糖素、配对框基因6(Pax6)、胰十二指肠同源框1(PDX1)和胰岛素。本文所使用的术语“血管内皮细胞”指的是表现出血管内皮细胞基本生理功能特征的细胞所述基本生理功能特征包括调节血管反应性和提供对血浆流体和蛋白质的半渗透屏障。本文所使用的术语“心肌细胞”指的是能够自发地搏动或能够表現出初期钙变化的心肌细胞(细胞内钙浓度的变化可以通过钙成像来测量)本文所使用的术语“神经细胞”指的是表现出神经元和神经胶质細胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)的基本功能的细胞。
本文所使用的术语“组织”指的是共同执行一种特定功能的、相似地特化的细胞的聚合体
本文所使用的术语“治疗性蛋白质”包括大范围的生物活性蛋白质，包括但不限于生长因子、酶、激素、细胞因子、细胞因子抑淛剂、血液凝固因子、肽生长和分化因子
本文所使用的“胰”通常指的是一个横向位于胃后并在脾和十二指肠之间的、较大的长形葡萄狀腺体。胰的外分泌功能例如外部分泌提供了消化酶的来源。这些细胞合成和分泌消化酶例如胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、羧肽酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、三酰基甘油酯酶、磷脂酶A2弹性蛋白酶和淀粉酶。胰的内分泌腺部分包含胰岛(islet ofLangerhans)所述胰岛呈现为包埋于外分泌胰内细胞的圆形球状体。在胰岛中已经识别出了4种不同类型的细胞即α、β、δ和细胞。α细胞占在胰岛中存在细胞的大约20％并且产生激素胰高血糖素。胰高血糖素作用于几种组织使得在各次摄食的间期获得能量。在肝脏中胰高血糖素引起糖原分解并促进利用氨基酸前体嘚糖异生作用。δ细胞产生促生长素抑制素，促生长素抑制素作用于胰以抑制胰高血糖素的释放并减少胰外分泌腺分泌。细胞中产生胰多肽(PP)激素该激素抑制胰外分泌腺分泌碳酸氢盐和酶，引起胆囊舒张并减少胆汁分泌。β细胞是胰岛中最多的细胞，占所有细胞的60-80％β细胞产生胰岛素。已知胰岛素可使得引起进食时或进食后不久产生的过量营养物进行储存。胰岛素的主要靶器官是肝、肌肉和专门用于储存能量的脂肪器官。本文所用的术语“胰管”包括副胰管、背胰管、主胰管和腹胰管、小叶间胰管以及小叶间胰管。
本文所使用的术语“成簇的羊膜来源的细胞组合物”是指其中至少少50％且最高达约95％的细胞形成成簇的羊膜来源的细胞
本文所定义的“胰祖细胞”为可分化为胰细胞谱系的细胞，例如可产生通常由胰细胞产生的激素或酶的细胞例如，胰祖细胞可被诱导至少部分分化为α、β、δ或胰岛细胞或最终应具有外分泌腺功能的细胞。根据本发明的方法，在将本发明的胰祖细胞给予受试者之前，可在促进细胞增殖和/或分化的条件下对其进行培养。这些条件包括但不限于培养细胞以使其在体外增殖，此时所述细胞可以形成假性胰岛样球状体并分泌胰岛素、胰高血糖素和促生长素抑制素本文所使用的“胰岛样细胞”意为该细胞具有成熟胰岛中存在的其中一种细胞类型(α、β、γ或δ)的某些特征但不一定是全部特征。所述胰岛样细胞将只表达以下的胰内分泌细胞激素的一种：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽。本文所定义的“胰岛样结構”为含有胰岛样细胞的结构胰岛样结构指的是由本发明的方法获得的细胞球状体，所述细胞球状体具有胰α、β、δ或细胞的形态及其功能。它们的协同功能包括对葡萄糖进行应答的能力。
本文所使用的术语“球状体”或“球状物”表示悬浮培养中的多细胞簇本文所用嘚术语“芽”或“芽体”表示球状体的一小群细胞分离出来形成球状体表面的一群细胞。
本文所使用的“生殖细胞”表示胚胎生殖细胞、荿体生殖细胞及这些细胞产生的细胞(即卵母细胞和精子)
本文所使用的“克隆”指的是产生一种动物，所述动物从一个卵母细胞与另一个偠被克隆的动物的细胞核或核酸序列中包含的遗传信息的结合物发育而来所得的含有所述供体基因组的卵母细胞在本发明中被称为“核轉移细胞”。所述克隆的动物具有与被克隆的动物基本上相同或相似的遗传信息“克隆”也可以指克隆一个细胞，包括产生含有来自另┅动物的细胞核或核酸序列的遗传信息的卵母细胞所得的含有所述供体基因组的卵母细胞在本发明中再次被称为“核转移细胞”。
本文所使用的术语“移植”指的是将含有未分化、部分分化或完全分化形式的细胞的组合物给予人或其他动物
本文所使用的“治疗”涵盖对哺乳动物(尤其是人)的一种疾病或病症的任何治疗，包括：(a)预防受试者出现所述疾病或病症所述受试者可能易患所述疾病或病症，但尚未被确诊为患有该疾病或病症；(b)抑制所述疾病或病症即阻止其发展；或(c)缓解所述疾病或病症，即使所述疾病或病症消退用本发明的方法治疗的受试者群体包括患有不良病症或疾病的受试者，以及存在发生所述疾病或病症的风险的受试者
“伤口”指的是任何原因导致的正瑺组织的破裂，包括但不限于诸如机械损伤、热伤和切口损伤等创伤性损伤；选择性损伤(例如外科手术及其导致的切口疝)；急性伤口、慢性伤口、感染伤口和无菌伤口以及与疾病状态相关的伤口(即糖尿病神经病变引起的溃疡)。伤口是动态的其愈合过程是一个需要一系列整合的且相关联的细胞过程的连续过程，所述细胞过程从受伤时开始并从初始的伤口闭合延续至形成稳定的瘢痕。这些细胞过程受到体液物质的介导和调节所述体液物质包括但不限于细胞因子、淋巴因子、生长因子和激素。根据本发明“伤口愈合”指的是通过某种形式的干预，改善天然的细胞过程和体液物质从而使得愈合更快，和/或减少所得的愈合区域的瘢痕和/或使所述伤口区域具有更接近于未受伤组织的组织伸展强度。
其他术语的定义在以下的缩写表中给出
图1：人胚胎发育示意图。
图2：使用条件培养基克服了由细菌引起的对傷口愈合的抑制并且将被污染的伤口的愈合曲线转变为接近正常愈合的曲线。
应理解的是当提供一个数值范围时，在该范围的上限和丅限之间的每个间值以及在所述范围内任何另作说明的或插入的数值都包含在本发明中，除非文中另有明确说明居间值的间隔为下限徝单位的十分之一。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包含在所述较小的范围中并且也包含在本发明中，所述范围内任何专门被排除的限值除外当所述范围包含一个或两个限值时，排除所包含的限值中任意一个的范围也包含在本发明中
除非另作说明，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义以下将描述优选的方法和材料，但在实施或检驗本发明时也可以使用任何与本发明所述相似或等效的方法和材料
必须注意的是，除非文中另有明确说明在本说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式的“一种”、“和”和“所述的”包括复数形式的指代物。
羊膜来源的细胞组合物的制备
根据本发明羊膜来源的細胞组合物用以下步骤制备：a)从胎盘回收羊膜，b)从所述羊膜上解离细胞c)在基础培养基中培养所述细胞，并添加天然来源的或重组产生的囚类蛋白质；并任选地d)用附加的添加剂和/或生长因子使所述细胞进一步增殖
羊膜的回收-获得本发明的羊膜来源的细胞组合物的第一步是從胎盘回收细胞。通常在分娩后尽快处理胎盘。在优选的实施方案中在分娩后四小时内处理胎盘。如果将胎盘冷冻或将羊膜剥下并冷冻，则应在最长达36小时的时间内进行回收所使用的胎盘可以是足孕的或早产的胎盘。用于从足孕或早产的胎盘获取细胞的几种方法是夲领域已知的(例如参见US ；Anker et al.，2005Stem Cells22：；Ramkumar et al.，1995Am.J.Ob.Gyn.172：493-500)。然而本文所用的方法提供了改进的细胞组合物和细胞群。
在无菌条件下从绒毛膜手工剥取羊膜，并置于不含添加剂的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中优选地在室温下完成这一步骤。在HBSS中洗涤所述羊膜至少三次如有需要，则进一步洗涤以除詓残留的血块切下并弃去任何依旧被血严重污染的组织。
羊膜细胞的解离-用解离试剂孵育所述膜这一操作至少进行一次，并可进行多達10次在一些实施方案中，所述解离试剂为蛋白酶在优选的实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶XXIII(Sigma；1mg/ml)在其他的实施方案中，所述解离试剂包括但不限于：胰蛋白酶±EDTA、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、I、II、III和IV型胶原蛋白酶、DNA酶、无Ca+2和Mg+2的PBS、EDTA、EGTA、分散酶、胶原酶-分散酶、Tryple(Gibco)、胶原酶和分散酶
鉴定、识别-、分离和制备羊膜来源的基本上纯化的细胞群。
用已知干细胞标志的市售抗体广泛地鉴定新分离的羊膜来源的细胞如实施例7所述，就CD90和CD117而言新分离的羊膜来源的细胞是基本上纯化的。此外这些细胞群基本上阴性表达CD34、CD44、CD45、CD140b、CD105蛋白质；基夲上阳性表达CD9和CD29蛋白质；大约70-95％阳性表达SSEA4、CD10、CD166和CD227蛋白质；大约60-95％阳性表达HLA-G、EGFR和CD26蛋白质；大约10-50％阳性表达CD71蛋白质。
在其他可选的实施方案中可以用针对蛋白质标志的抗体制备羊膜来源的基本上纯化的细胞群，所述蛋白质标志为羊膜来源的细胞的细胞表面表达(阳性选择)或不表達(阴性选择)的蛋白质标志例如，以下的实施例8说明了如何使用抗体制备基本上纯化的细胞群可以通过多种方法使用这些抗体来识别、鑒定、分离或制备表达那些蛋白质标志的、羊膜来源的基本上纯化的细胞群。这类方法可以包括阳性选择例如使样品细胞通过含有抗蛋皛质标志抗体的柱子，或者使细胞与缀合了针对蛋白质标志的抗体的磁珠结合或者在包被有蛋白质标志抗体的平板上淘洗细胞并收集结匼的细胞。或者将单细胞悬浮物暴露于免疫特异性地与羊膜来源的细胞蛋白质标志结合的一种或多种荧光标记抗体。将羊膜来源的细胞與合适的一种或多种抗体孵育后用缓冲液洗涤所述细胞以除去任何未结合的抗体。然后可以用例如Becton DickinsonFACStar流式细胞仪通过荧光激活细胞分类術(FACS)分选表达所述蛋白质标志的羊膜来源的细胞。为了制备表达目标蛋白质标志的、基本上纯化的羊膜来源细胞群可对细胞进行多轮FACS分选。
此外羊膜来源的细胞的表面不表达的蛋白质标志也可以用于识别、分离或制备不表达这些标志的羊膜来源的细胞群。这类方法可包括陰性选择方法例如使样品细胞通过含有抗蛋白质标志抗体的柱子，或者使细胞与缀合了针对蛋白质标志的抗体的磁珠结合或者在包被囿蛋白质标志抗体的平板上淘洗细胞，并收集不结合的细胞或者，将单细胞悬浮物暴露于免疫特异性地与蛋白质标志结合的一种或多种熒光标记抗体将细胞与合适的一种或多种抗体孵育后，用缓冲液洗涤细胞以除去任何未结合的抗体然后，例如可以用例如Becton DickinsonFACStar流式细胞仪通过荧光激活细胞分类术(FACS)分选表达所述蛋白质标志的细胞。然后收集剩余的不结合抗体的细胞为了制备不表达目标蛋白质标志的基本仩纯化的羊膜来源细胞群，如上所述可对细胞进行多轮FACS分选。
本领域已知的多种方法可用于制备针对本文所述羊膜来源的细胞的表位或針对羊膜来源的细胞的蛋白质标志的多克隆抗体可以通过用羊膜来源的细胞或者羊膜来源的细胞蛋白质标志，或其片段或衍生物注射多種宿主动物使其免疫从而制备抗体，所述宿主动物包括但不限于兔、小鼠和大鼠根据宿主的种类，可以使用多种佐剂以提高免疫应答所述佐剂包括但不限于弗罗因德佐剂(Freund’s)(完全和非完全佐剂)、诸如氢氧化铝之类的矿物胶，诸如溶血卵磷脂之类的表面活性物质、普郎尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基苯酚以及可能有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
本发明提供了抗体汾子以及这些抗体分子的片段可以用已知的技术产生含有分子的独特型的抗体片段。例如这类片段包括但不限于：可以通过胃蛋白酶消化抗体分子所产生的F(ab’)2片段；可以通过还原F(ab’)2片段的二硫键所产生的Fab’片段，以及可以通过用木瓜蛋白酶和一种还原剂处理抗体分子所產生的Fab片段另一种抗体片段为单链Fv(scFv)，scFv是一种只具有重链V区的截短的Fab所述重链V区由一段合成肽连接到轻链V区。参见例如，转让给剑桥忼体技术有限公司(Cambridge Antibody Technology Limited)的美国专利5,871,907以及美国专利5,565,332、5,733,743、5,837,242和5,858,657这些文件的内容通过引用的方式纳入本文。可以用已知技术纯化抗体分子例如免疫吸附或免疫亲和色谱、色谱法(例如HPLC(高效液相色谱))或这些方法的组合。
扩增的羊膜来源的细胞群
如本文所述申请人已经发现一种用于多潜能的羊膜来源细胞的分离和增殖的方法。这些方法产生了羊膜来源的细胞组合物所述组合物用于扩增多潜能细胞，由此首次提供了足夠数量的细胞以便能够进行治疗性细胞移植。根据本发明制备的扩增的、羊膜来源的细胞组合物经5次传代后，组合物中每克羊膜组织的哆能细胞水平提高了至少50倍最高达150倍；相比而言，用先前的方法只能提高约20倍
此外，用于细胞培养和增殖的方法提供了一种在非动物來源的系统中培养所述细胞以及其他多潜能细胞的手段所述多潜能细胞包括但不限于胚胎干细胞。此外所述培养条件提供了一种细胞，该细胞的存活对贴附到培养表面的依赖程度较低因此可以用悬浮培养来有效地放大细胞增殖培养。
本文所述扩增的羊膜来源的细胞组匼物表现出广泛的增殖潜能表达某些已知只在未分化细胞中表达的基因(即Nanog和Oct-4)，并且可以分化为通常从全部三种胚胎胚层(内胚层外胚层囷中胚层)产生的细胞类型。这种分化潜能表明这些扩增的羊膜来源的细胞可能能够产生多种细胞类型本文所述的羊膜来源的细胞组合物吔可用作多种类型细胞生长的饲养层，所述细胞包括但不限于胚胎干细胞(ES细胞)羊膜来源的细胞(包括本文中所述的那些细胞)还产生很多种細胞因子和生长因子，因此所述细胞组合物、从所述细胞获得的条件培养基、来自所述细胞的溶胞产物、由所述细胞产生的细胞外基质鉯及它们的组合物均可用于实现快速且有效的伤口愈合，包括无瘢痕愈合；并且也可用于美容剂中即用于改善皮肤形态。
羊膜细胞的培養-在基础培养基中培养所述细胞这类培养基包括但不限于，Epilife(Cascade Biologicals)、Opti-pro、VP-SFM、MDM、改良的DMEM、K/O DMEM、293SFM II(全部由Gibco；Invitrogen生产)、HPGM、Pro 293S-CDM、Pro 293A-CDM、UltraMDCK、UltraCulture (全部由Cambrex生产)、Stemline I和Stemline II(这两者由Sigma-Aldrich生产)、DMEM、DMEM/F-12、Ham′s F12、M199和其他同等的基础培养基这些培养基应含有人类蛋白质或者被添加了人类蛋白质。本文所使用的“人类蛋白质”指的是天然產生的蛋白质或者是用重组技术产生的蛋白质“人类蛋白质”还意在包括其中含有人类蛋白质的人类体液或其衍生物或制品，例如人类血清或羊水在优选的实施方案中，所述基础培养基为Stemline I或II、UltraCulture或Opti-pro或它们的组合，所述人类蛋白质是浓度为至少0.5％最高达10％的人白蛋白。茬具体的实施方案中所述人白蛋白的浓度为大约0.5％至大约2％。所述人白蛋白可来自液体或干燥(粉剂)形式并且包括但不限于重组人白蛋皛、人血白蛋白和人血浆蛋白。
在一个最优选的实施方案中使用不含动物产物的系统培养细胞以避免外源污染。在该实施方案中所述培养基为Stemline I或II、Opti-pro或DMEM，其中添加浓度最高达10％的人白蛋白(人血白蛋白)或者，可以使用UltraCulture用人重组运铁蛋白取代运铁蛋白，并用浓度最高达10％嘚人白蛋白置换牛白蛋白(BSA)本发明进一步考虑了使用任何上述的基础培养基，其中用重组人类蛋白质置换动物来源的蛋白质并且用人白疍白取代动物来源的血清例如BSA。在优选的实施方案中所述培养基除了是非动物来源的之外，还是无血清的
另外，本发明所述的培养条件导致被称为球状体的细胞的三维簇形成这一特性可提高分化为诸如胰岛细胞、神经细胞谱系和心脏细胞的可能性。如上所述用基础培养基制备这类组合物，所述基础培养基选自Opti-pro SFM、VP-SFM、lscove′s MDM、HPGM、UltraMDCK、Stemline II和Stemline I、DMEM以及DMEM：F12，其中添加浓度最高达10％水平的人白蛋白、人血浆蛋白或人血白疍白
在另外的实施方案中，不排除使用非人类血清例如在体外使用时，所述培养基中可能会添加最高达40％范围的来自非人类的哺乳动粅的血清
附加的增殖-任选地，可以使用其他增殖因子在一个实施方案中，使用浓度在0至1μg/ml的上皮生长因子(EGF)在一个优选的实施方案中，EGF的浓度为约10ng/ml其他可使用的生长因子包括但不限于，TGFα或TGFβ(5ng/ml；范围为0.1-l00ng/ml)、激活素A、霍乱毒素(优选为大约0.lμg/ml的水平；范围为0-10μg/ml)、运铁蛋白(5μg/ml；范围为0.1-100μg/ml)、成纤维细胞生长因子(bFGF 40ng/ml(范围为0-200ng/ml)、aFGF、FGF-4、FGF-8；(全部范围为0-200ng/ml)、成骨蛋白(即BMP-4)或其他已知能促进细胞增殖的生长因子
传代-细胞最初以25,000/cm2至1,000,000/cm2的密度接种于组织培养处理的平板上，优选密度为大约130,000/cm2在一个实施方案中，在经细胞外基质处理过的平板上培养细胞所述细胞外基质例洳胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白或基质胶。为制备本发明所述扩增的、羊膜来源的细胞组合物如以下实施例1所述将细胞传代至少5次。为淛备本发明的球状体形的、羊膜来源的细胞组合物只需要传代1次。
ES细胞的生长-上述的培养基也可被用于制备扩增的或球状体形的胚胎干細胞(ES细胞)制品在一些实施方案中，所述培养基不含动物产物在优选的实施方案中，所述培养基不含动物产物并且不含血清
羊膜来源嘚细胞的大规模培养一在进一步的实施方案中，采用大规模的培养生产羊膜来源的细胞组合物、从中获得的条件培养基以及用于制备细胞溶胞产物的细胞描述大规模哺乳动物细胞培养的文献主要是关于培养诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞之类的细胞以生产治疗性蛋白质(Moreira，J.L.et al.(1995)Biotechnol Prog11：575)。在這种情况下细胞的分泌产物是主要的目标产物。虽然滚瓶在某些应用中(尤其是在贴壁细胞培养中)正在被中空纤维培养生物反应器和微載体生物反应器系统(Martin，Iet al.(2004)Trends Biotechnol，22：80)所代替但最经常用于大规模细胞生产的技术还是旋转瓶(spinner flasks)和滚瓶培养。中空纤维生物反应器将合成纤维和哺乳动物细胞结合细胞被接种于纤维之间，并在一个类似三维组织的结构中生长所述纤维用作使营养因子和氧气到达细胞的导管，并且還为需要从细胞附近清除的毒素和细胞副产物提供出口尽管在某些应用中，例如在体外肝辅助装置中细胞保留在原位以实现其治疗效果(Gerlach，J.C(1997)Cell BiolToxicol，13：349)但是中空纤维技术的一个缺点是回收细胞比较困难。
使用目前正被开发的用于人胚胎干(hES)细胞的系统可实现羊膜来源的细胞的鈳放大生产hES细胞大规模生产的大多数实例包括在扩大规模的过程中的部分或完全分化，例如Gerecht-Nir及其同事(Gerecht-NirS.，et al.(2004)Biotechnol Bioeng86：493)报道了ES细胞作为胚胎体的規模可放大性。ES细胞分化的扩大培养的其他实例包括心脏细胞(ZandstraP.W.，et al.(2003)Tissue Eng9：767)，以及在中空纤维生物反应器中大规模培养的ES来源的肝细胞(GerlachJ.C，(1997)Cell Biol Toxicol13：349)，在所述心脏细胞的实例中形成胚胎体并用视黄酸对该胚胎体进行处理虽然小鼠ES细胞可以在中空纤维生物反应器中增殖并保持其干细胞表面特征，但很少有关于未分化的人ES细胞大规模培养的报道
在其他实施方案中，在悬浮培养条件下培养细胞包括在悬浮培养处理的岼板上以及滚瓶中(在滚瓶中，细胞密度范围为100,000/ml至5百万/ml；优选为1百万/ml)或具有或不具有对微载体珠的吸附的旋转瓶中。实施例2、3和4描述了可根据本发明使用的大规模生产的方法
已经进行了实验以确定可用于最佳的细胞生长及分化功能的表达的培养基和添加物。使用多个旋转瓶以便可以在每个实验中每种条件重复使用2或3次。
一旦细胞成功地在悬浮液中生长则将其培养至足够用于移植的数量。本领域的技术囚员应认识到移植所需的细胞数量取决于具体的用途。如上述第一部分实验所确定的方法收集细胞但除了，是将细胞放入Wave袋中而不是接种到T角瓶或旋转瓶中将细胞和培养基添加到这些无菌的塑料袋中(Wave，Inc.)将袋子及其内含物放到摇床上，轻轻搅动整个袋子此外，可以姠袋子中连续添加CO2和空气以保持足够的氧气并控制pH袋子大小的范围为1升至1000升。在一个实施方案中使用1升的袋子和125ml的最小工作体积。随著细胞生长可以添加额外的培养基直至达到500ml工作体积。
将羊膜来源的细胞置于Wave袋内以及正常的T角瓶内并在37℃下，含5％CO2的空气中孵育茬100级生物安全柜中，每天从每个培养瓶和容器中取出细胞样品用台盼蓝将细胞染色并用血细胞计数器计数。将每毫升的总细胞和成活的細胞相对时间作图以保证羊膜来源的细胞在培养中进行分裂并保持活力。
与其他培养容器相比Wave袋具有两个主要优势。首先它们是一佽性的，因此不需要在用于每一批细胞时都检查其清洁度其次，由于摇动会在袋中产生液体波因此，与细胞在静置的培养瓶瓶或旋转瓶中的气体交换相比液体中的气体交换更多。因此可获得的总细胞数比在T角瓶或旋转瓶中的更高。
以特定的时间间隔用反转录酶和/戓实时PCR分析样品随时间的基因表达。检查样品的羊膜来源的细胞特异性标志例如Oct-4、nagog等。此外用FACS分析测量样品中未分化细胞的细胞表面標志(SSEA-3和-4、Tra-1-60和Tra-1-81)
此外，分析经悬浮培养和增殖后的羊膜来源的细胞分化为全部三种胚系的能力(内胚层、中胚层和外胚层)这种分化能力的特征昰通过以下方法进行评估的：用反转录酶和/或实时PCR以及低容量FACS分析(或IHC)进行分化测定和基因表达分析。
在指定的时间间隔从培养容器中移詓细胞并按分化方法培养，以确定它们增殖后分化为所述三种胚系的能力
组合物-本发明的组合物包括基本上纯化的细胞群及其药物组合粅。根据组合物的目的用途本发明的组合物可以用多种方法制备。例如一种用于实现本发明的组合物可以是含有一种本发明药剂的液體，即一种存在溶液中、在悬浮液中或在两者中(溶液/悬浮液)的羊膜来源的基本上纯化的细胞群术语“溶液/悬浮液”指的是一种液体组合粅，其中所述活性药剂的第一部分存在溶液中而所述活性药剂的第二部分以颗粒形式存在于具有液体基质的悬浮物中。液体组合物也包括凝胶所述液体组合物可以是水性的，或者为软膏、油膏或乳膏等形式
一种用于实施本发明的方法的水性悬浮液或溶液/悬浮液可以包含一种或多种聚合物作为助悬剂。有用的聚合物包括水溶性聚合物(如纤维素聚合物)以及水不溶性聚合物(如交联的含羧基聚合物)本发明的沝性悬浮液或溶液/悬浮液优选地为粘稠性的或粘膜粘附性的，或者甚至更优选地为既粘稠又粘膜粘附性的
药物组合物-本发明提供了羊膜來源的基本上纯化的细胞群药物组合物，以及一种可药用载体术语“可药用”表示由联邦或州政府的管理机构认可地，或者在美国药典戓其他普遍公认的药典中列出地可用于动物，更具体而言可用于人体。术语“载体”指的是和所述组合物一起给药的稀释剂、辅剂、賦形剂或运载剂该药物载体可以是无菌液体，例如水和油包括来自石油、动物、植物或合成的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要所述组合物还能包括少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组匼物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等等形式合适的药用载体的实例在E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中有记载，并且其怹合适的药用载体也为本领域技术人员熟知
本发明的药物组合物可以被配制成中性或盐的形式。可药用的盐包括与游离氨基形成的盐唎如由盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等产生的盐；以及与游离羧基形成的盐，例如由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等产生的盐
治疗试剂盒-本发明还提供了一种制品，所述制品包括包装材料以忣包含在所述包装材料内的本发明所述的药物组合物其中所述药物组合物包括一种羊膜来源的基本上纯化的细胞群，并且其中所述包装材料包含标签或药品说明书所述说明书指明所述羊膜来源的基本上纯化的细胞群可用于治疗多种疾病，包括但不限于糖尿病、肝病、神經疾病等的多种病症
除羊膜来源的细胞本身以及从中获得的产物外，本发明的另一实施方案为羊膜来源的细胞的细胞核该细胞核可以鼡本领域已知的方法获得。所述方法包括：用机械破裂作用或化学方法(例如用透明质酸酶处理)除去细胞膜或者用吸量管机械地提取细胞核。然后通过例如胞质内注射或电融合方法将所述细胞核转移到体细胞或生殖细胞内，所述方法用例如US 或US 中所述的本领域已知的方法进荇由于羊膜来源的细胞来自胚外组织，具体而言来自羊膜所以这些细胞是非体细胞、非胎儿细胞和非生殖细胞，因此在本领域通常使鼡的供体细胞中很独特
将细胞核转入另一个细胞后，所得的细胞可用于许多应用中一个实施方案涉及治疗性核克隆的方法，或者通过將任何去核细胞与来自羊膜来源的细胞的细胞核结合进而克隆动物的方法该实施方案包括克隆多种动物。所述动物包括所有哺乳动物(例洳人、犬、猫、小鼠、大鼠、家畜、绵羊、山羊、骆驼、猪、马、美洲驼羊(llamas))。供体羊膜来源的细胞和卵母细胞可以是或不是来源于同一種动物
供体羊膜来源细胞的基因组可以是天然存在的基因组，例如用于生产克隆动物或所述基因组可以被遗传改造以包含转基因序列唎如用于生产转基因克隆的动物。
本发明所用的卵母细胞可以处于减数细胞分裂的任何时期包括中期I、后期I、后期II、末期I、末期II，优选哋为中期II处于分裂中期II的卵母细胞被认为是出于静止状态。卵母细胞可以处于分裂中期II的静止阶段然后用本发明所述方法进行激活。鈳以通过在足够的放大倍数下对卵母细胞进行目测从而识别其所处的阶段。用于识别减数细胞分裂的阶段的方法是本领域已知的
可以鼡物理方法(例如，电刺激、冷休克)和化学方法(例如乙醇、酸性台氏(tyrode’s)溶液、氯化锶、钙离子载体、嘌呤霉素、透明质酸酶和缺乏钙和镁嘚培养基)激活卵母细胞。这些方法中有一些通过增加胞内钙水平激活卵母细胞存在多种可激活卵母细胞的方法。特别地钙离子载体(例洳伊屋诺霉素)是一种能提高卵母细胞膜的通透性并允许钙进入卵母细胞的试剂。这类激活方法在美国专利5,496,720中有记载乙醇具有相似的作用。根据Presicce and YangMoI.Reprod.Dev.，37：61-68(1994)；以及Bordignon&SmithMoI.Reprod.Dev.，49：29-36(1998)中记载的乙醇激活处理在去核之前或之后，可用乙醇激活处于减数分裂中期II的卵母细胞通过电刺激也可以使所述卵母细胞暴露于钙中。电刺激能提高进入卵母细胞的钙的水平其他已知的激活方法也可以用于本发明中以激活卵母细胞。
可以在供体动物的生育周期中从供体动物获得卵母细胞例如，可以在生育周期(外源激素刺激的即超数排卵或者排卵过度刺激，或者未经刺激嘚)的给定时间从卵巢的卵泡中抽取卵母细胞同样的在排卵过后的给定时间里，有明显百分数的卵母细胞例如处于分裂末期此外，可以獲得卵母细胞然后在体外诱导至成熟以滞留于中期II阶段。然后在体内或体外产生的滞留于中期II阶段的卵母细胞可以在体外被诱导进入末期。因此可以很容易地获得分裂末期的卵母细胞以用于本发明。卵母细胞也可以通过手术回收这是通过从雌性供体的输卵管中冲洗絀卵母细胞来实现的。收集卵母细胞的方法是本领域已知的
优选地，激活的卵母细胞所处的细胞阶段与供体羊膜来源的细胞所处细胞周期的阶段相关卵母细胞减数分裂阶段与供体细胞有丝分裂阶段之间的这种相关性，在本发明中也被称为“同步化”
本发明使用了去核嘚卵母细胞。去核的卵母细胞是缺少基因组的卵母细胞或者是“功能性去核”的卵母细胞。功能性去核的卵母细胞包含无功能的基因组例如，不能复制或合成DNA参见，例如BordignonV.and L.C.Smith，Molec.Reprod.Dev.49：29-36(1998)。优选地从所述卵母细胞中除去卵母细胞的基因组。可以通过辐射、x-射线辐射、激光辐射、物理方法或者通过化学方法从卵母细胞中功能性地去除基因组。使用辐射的方法是本领域技术人员已知的例如Bradshaw et al.，Molecul.Reprod.Dev.41：503-512(1995)中描述了使鼡辐射的方法。化学灭活DNA的方法是本领域技术人员已知的(Fulka and MooreMolecul.Reprod.Dev.，34：427-430(1993)本发明可以用其他已知的去核方法将卵母细胞去核。
为了用物理方法去除卵母细胞的基因组可以通过插入一个微量吸管或针头使其穿透卵母细胞的透明带，来从卵母细胞去除核物质在一个实例中，具有两個极体的分裂末期的卵母细胞可以用微量吸管或针头通过去除在周围胞质的第二极体来去核具体而言，处于减数分裂末期的卵母细胞可鉯在以下任何时间点进行去核即从第二极体出现质膜凸起直到形成第二机体本身的任何时间点。因此本文所用的、质膜中出现通常邻接着纺锤体的凸起，直至释出第二极体的卵母细胞都被认为是处于分裂末期的卵母细胞在另一个实例中，可以通过以下方法使分裂中期II階段的卵母细胞去核：用微量吸管穿透透明带使微量吸管接近卵母细胞胞核，将细胞核和部分卵膜(或者卵母细胞膜)吸进微量吸管中将微量吸管取出后，卵膜收缩以得到具有完整细胞膜的去核卵母细胞在这个过程中，也可用细胞松弛素D预处理卵母细胞进行辅助
可用多種方法将活化的去核卵母细胞与来自羊膜来源的细胞的基因组向结合，形成核转移胚胎可以利用微量注射器(即微量吸管或针头)将羊膜来源的细胞的基因组注射到激活的卵母细胞中。通过微量吸管或针头提取羊膜来源的细胞的核基因组羊膜来源的细胞核基因组被提取出来後，便可通过以下方法置于激活的卵母细胞中：将微量吸管或针头插入到卵母细胞中并释放所述羊膜来源的细胞的核基因组(McGrathJ.and D.Solter，Science226：84))。
本發明还包括通过融合方式将羊膜来源的细胞的基因组与激活的卵母细胞相结合例如通过电融合、病毒融合、脂质体融合、生化试剂融合(唎如植物凝集素(PHA)蛋白质)或化学融合(例如聚乙二醇(PEG)或乙醇)。羊膜来源的细胞羊膜来源的细胞的核体或者羊膜来源的细胞的胞核可以被置于嫆纳卵母细胞的透明带中。之后细胞、核体或细胞核与卵母细胞融合的步骤，可以用本领域已知的技术进行羊膜来源的细胞的基因组與激活的卵母细胞的结合产生核转移胚胎。
然后本发明的核转移细胞可被转入受体非人类雌性动物体内，并得以发育或孕育成为克隆的戓转基因的动物适合孕育的条件是能够使胚胎发育并成熟以成为胎儿，并最终成为活体动物的那些条件所述条件是本领域已知的。所述核转移细胞可以被保存在培养系统中直到至少第一次分裂(2-细胞期)最长至胚泡期。优选地核转移细胞在2-细胞期或4-细胞期进行转移。用於核转移细胞发育的多种培养基是本领域技术人员已知的
本发明还涉及通过将激活的卵母细胞与来自羊膜来源的细胞的遗传工程改造基洇组相结合，从而产生转基因动物的方法这种结合产生了转基因的核转移细胞。转基因动物是从供体细胞的基因组产生的动物所述供體细胞的基因组经过遗传改变从而例如能产生一种特定的蛋白质(目标蛋白质)；或者所述供体细胞的基因组经改造以敲除一种特定的基因。將DNA构建体导入动物生殖细胞从而产生转基因动物的方法是本领域已知的
本发明还涉及“治疗性克隆”，所述治疗性克隆是指从克隆的胚胎产生ES细胞先前，Munsie等人报道了从通过体细胞核转移获得的胚泡中分离小鼠ES细胞(Current Biology 10：989-9922000)。Wakayama等人从通过体细胞核转移获得的胚泡培养物中获得叻小鼠ES细胞所述ES细胞能在体外被导入至多种类型的特定细胞(Science，292(5517)；740-743.2001)Wakayama等人的研究结果表明ES细胞能够从通过体细胞核转移获得的核转移胚胎Φ分离得到。体细胞来源的核转移ES细胞是多潜能细胞并且与来自正常受精卵的ES细胞一样，能够分化为任何特定的细胞类型
在本发明中，治疗性克隆是通过将羊膜来源的细胞的细胞核转移到卵母细胞中实现的所得的核转移细胞进一步分化为特定的细胞类型，所述细胞类型是例如患有某种疾病(即糖尿病、肝衰竭等)的患者所需要的
羊膜来源的细胞和分化的细胞的治疗性用途
由于这些组合物所含的每克羊膜組织的细胞数远高于先前获得的细胞数，所以它们在例如移植等的情况中具有治疗性用途所述情况需要较大数量的细胞。已经发现这些細胞是多能的即能够分化为多种组织的类型，这些组织类型包括但不限于造血组织、肝、胰、神经、肌肉和内皮组织这类细胞特别可鼡于通过移植治疗或组织工程恢复患病组织的功能，并且也可用于在药物发现的工作中研究化合物的代谢和毒性
目前用于临床或临床试驗的细胞移植策略已经表现出其结果具有良好前景，例如1)目前，移植从尸体组织中分离的使其用于恢复I型糖尿病患者体内适当的胰岛素分泌，并减轻所述患者对胰岛素注射的需求；以及2)移植从尸体肝脏分离的肝细胞以用于治疗等待肝移植的患者，并用于治疗代谢紊乱然而，对临床级别的胰岛和肝细胞的需求量远远超过能够从供体组织分离并移植的细胞的数量本发明所述的扩增的羊膜来源的细胞组匼物提供了一种能够分化为这些细胞类型的充足细胞源。
可将含有羊膜来源的细胞或从其中分化得到的细胞的组合物给予受试者以提供哆种细胞或组织功能。在本文中使用的“受试者”可以表示人或非人类动物
可使用一种或多种生理上可接受的载体，以任何常规方式配淛这类组合物所述载体任选地包含赋形剂和辅剂。根据所选择的给药途径确定适合的制剂所述组合物可以和书面说明书一起包装，以將细胞用于组织再生或恢复治疗上的重要代谢功能羊膜来源的细胞也可以载于一种或多种生理上可接受的载体中给予受体。用于这些细胞的载体可包括但不限于磷酸缓冲盐溶液(PBS)或乳酸林格氏溶液，其中含有生理浓度的盐混合物
本领域的技术人员应很容易地确定用于具體目的的合适的细胞浓度。一个优选的剂量范围为大约0.25-1.0×106个细胞
可以通过注射将羊膜来源的细胞或从中分化出的细胞给予至受试者的靶位点，优选地通过送递装置，例如管状物(例如导管)给予在一个优选的实施方案中，所述管状物还包含针头例如注射器，通过注射器鈳以将细胞导入受试者体内的目标部位向受试者给予细胞的具体而非限制性的实例也可包括通过皮下注射、肌内注射或静脉注射给药。洳果是静脉注射给药可以制备一种可注射的细胞的液体悬浮物并通过连续滴注或推注进行给药。
细胞也可以以不同形式注入至送递装置(洳注射器)中例如，可以在该递送装置所含的溶液中悬浮细胞本文所用的术语“溶液”包含可药用的载体或稀释剂，在所述溶液中本发奣的细胞能保持活力可药用载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。这类载体和稀释剂的使用是本领域已知的所述溶液优选地为无菌的，并且达到容易注射的流动程度优选地，所述溶液在生产和贮存条件下是稳定的并且通过使用例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、柳硫汞等进行防腐，以对抗微生物(例如细菌和真菌)造成的污染本发明所述的溶液可以这样制备：將本文所述羊膜来源的细胞或分化的细胞掺入到可药用的载体或稀释剂，以及上面列举的其他成分(根据需要)中然后进行过滤灭菌。
未分囮的部分分化的或完全分化的羊膜来源的细胞可以全身性给药(例如静脉注射)或局部给药(例如，在超声心动图的指导下直接给药至心肌缺損部位或者在外科手术时通过目视直接给药)。对于这些注射所述细胞可存在于可注射的液体悬浮制剂中，或者存在于生物相容性的介質中所述介质是可注射的液体形式，它在损伤的组织部位则变成半固体形式只要针头腔或针孔的直径足够大(例如30号(gauge)或更大)，就可以使鼡常规的心内注射器或可控的内镜送递装置所述足够大的直径可使剪力不会损伤所要送递的细胞。
可以采用这样的方式给予细胞：所述方式允许细胞移植到目标组织位点并重建或再生该功能缺陷的区域。未分化的、部分分化的或完全分化的羊膜来源的细胞可用于直接给藥的治疗中或用作提供暂时或永久器官功能的生物辅助装置的一部分从这点来讲，未分化的、部分分化的或完全分化的羊膜来源的细胞鈳以生长于生物反应器中从而为缓解器官损伤提供体外器官支持，例如对于肝辅助装置而言，它为恢复器官功能的移植提供大量的细胞来源；或者提供可用于刺激组织再生的条件培养基来源利用原代猪细胞以及原代人类肝细胞的肝辅助装置已经被成功地应用(Sauer，I.M.et al.Xenotransplantation(2003)10：460-469；Irgang，M.et al.()：141-154；SauerI.M.et al.(2002)Int.J.Art.Org.25(10)：；Sauer，I.M.et al.(2002)J.Metabolic Brain Disease 17(4)：477-484Sauer，I.M.et al.(2003)J.Hepatology 39(4)：649-653)可以结合这种技术来利用从羊膜来源的细胞获得的肝细胞。
或者羊膜来源的细胞可被移植到受体中，在所述受体中所述细胞可增殖并分化形成新的细胞和组织从而提供通常由该组织所提供的生理过程，或者可产生在移植区域引起细胞迁移和/或汾化的因子组织是一种相似地特化的细胞的聚合体，所述细胞联合在一起执行一种特定的功能组织意在包括所有类型的生物组织，包括硬组织和软组织软组织指的是连接、支持或包围身体其它结构和器官的组织。软组织包括肌肉、腱(将肌肉连接到骨上的纤维带)、纤维組织、脂肪、血管、神经和滑液组织(关节周围的组织)硬组织包括结缔组织(例如，硬组织形式如骨组织或骨)以及其它肌组织或骨骼组织
所述羊膜来源的细胞能被掺入或嵌入其中的支持基质，包括受体相容性的基质和能够降解成对受体无害的产物的基质这些基质在体内为未分化的和分化的羊膜来源的细胞提供支持和保护，因此是这些细胞移植到受体被试者体内时的优选形式
天然的和/或合成的可生物降解嘚基质是上述基质的一类实例。天然的可生物降解的基质包括例如来自哺乳动物的血浆凝块、胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白基质适合用於细胞移植基质的合成材料必须是生物相容性的，以防止迁移和免疫并发症并且应该能够支持广泛的细胞生长和分化的细胞功能。所述材料还必须是可再吸收的能够被完全天然的组织取代。所述基质应该可构成多种形状并且应该具有足够的强度以防止移植后发生破裂。最近的研究表明由聚乙醇酸制成的可生物降解的聚脂聚合物符合所有上述标准(Vacanti，et al.J.Ped.Surg.23：3-9(1988)；Cimaet al.Biotechnol.Bioeng.38：145(1991)；Vacanti，et al.Plast.Reconstr.Surg.88：753-9(1991))其它合成的可生物降解的支持基质包括合成的聚合物例如聚酐，聚原酸酯和聚乳酸合成的聚合物以及将细胞掺入或嵌入这些基质的方法的进一步的实例也是本领域所知的。参见例如美国专利4,298,002和5,308,701的。
可以通过用化合物包被所述聚合物增强细胞与聚合物之间的贴附，所述化合物例如基底膜组分琼脂、琼脂糖、明胶、阿拉伯胶、I、II、III、IV和V型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖及其混合物，以及细胞培养领域的技术人员已知的其它材料所有用于基质中的聚合物必须符合为细胞后续生长和增殖提供足够支持所需的机械和生化参数。所述聚合物可以用以下方式表征：对于機械特性例用如电子拉力机(Instron tester)测得拉伸强度；用凝胶渗透色谱(GPC)检测聚合物分子量；用差示扫描量热仪(DSC)检测玻璃化转变温度；以及用红外(IR)光譜学检测键结构；毒理学方面，利用了包含Ames测定和体外致畸性测定的初始筛选测试以及在动物体内进行的免疫原性、炎症、释放和降解研究方面的移植研究。
可生物降解的聚合物基质的一个优势在于：生成血管的化合物和其它生物活性化合物可以被直接掺入到所述支持基質中使其随支持基质在体内的降解而缓慢地释放。当所述细胞-聚合物结构被血管化并且所述结构降解时，羊膜来源的细胞可根据其天嘫的特性进行分化包括以下因子等的因子可被掺入到所述基质中，或者与所述基质一起被提供：营养素、生长因子、分化和去分化(即使汾化的细胞失去分化特征并获得例如增殖以及更为普遍的功能等特征)的诱导物、分泌产物、免疫调节剂、炎症抑制剂、消退因子、促进或尣许淋巴网状系统或神经纤维向内生长的生物活性化合物、透明质酸和药物(所述药物是本领域已知的并能连同指示有效剂量的说明书一起从例如CollaborativeResearch，Sigma Chemical Co.等供应商处购得)、血管生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、上皮生长因子(EGF)和肝素结合的上皮生长因子样生长因子(HB-EGF)类似地，含有肽(例如联结肽RGD(Arg-Gly-Asp))的聚合物可以被合成以用于形成基质(参见例如美国专利4,988,621、4,792,525、5,965,997、4,879,237和4,789,734)。
在另一个实例中分化的、部分分化的或完全分化的羊膜来源的细胞可在凝胶基质(例如Upjohn Company的Gelfoam)中进行移植，所述凝胶基质聚合形成一种其中可生长细胞的底物多种包囊技术已被开发出来(例如，Lacy et al.Science 254：1)；Sullivan et al.，Science 252：718-712(1991)；WO 91/10470；WO 91/10425；美国专利5,837,234；美国专利5,011,472；美国专利4,892,538)在包括直接物理接触受损的组织和/或器官在内的开放性外科手术操作中，所有所述未分囮、部分分化或完全分化形式的羊膜来源的细胞的送递制剂都是可用的选择这些细胞可每隔一段时间进行重复移植，直至达到所期望的治疗效果
本发明还涉及在三维细胞和组织培养系统中使用羊膜来源的细胞以在体内形成类似于对应组织的结构物。所得的组织将存活较長时间并且在移植到受体宿主体内后将执行组织特异性功能。美国专利5,624,840和6,428,802中描述了制备这类结构物的方法将这些专利的全部内容纳入夲文。
所要使用的三维基质是为细胞提供支架以引导组织形成过程的结构性基质支架的形式包括纤维、凝胶、织物、海绵样的片层以及鼡复杂的实体自由成形制造(SFFF)方法制造的具有孔和通道的复杂三维结构物。在三维基质上培养的细胞将在多个层面生长以形成器官型结构物从而形成新的肝组织，所述器官型结构物以三维形式存在所述三维形式例如导管、片层以及片层之间的类似窦状隙区域的空间。因此在优选的方面，本发明提供了一种支架、多层细胞和组织培养系统本文所使用的术语“支架”表示细胞在其中或在其上生长的三维(3D)结構(底物和/或基质)。它可由生物组分、合成组分或两者的混合物构成此外，它可由细胞天然地构建或者通过人工构建此外，所述支架可含有在合适条件下具有生物活性的成分所述支架的结构可包括网状、海绵状或可由水凝胶形成。
所述支架的实例包括一种三维间质组织戓者活的间质基质所述活的间质基质被接种了生长在三维支持物上的间质细胞。由间质细胞产生的细胞外基质蛋白沉积到支架上从而形成一种活的间质组织。所述活的间质组织能支持后续接种的羊膜来源的细胞或分化的细胞的生长从而形成三维细胞培养物。美国专利6,372,494Φ描述了其他三维支架的实例
用于形成三维基质的支架的设计和构造是至关重要的。基质应该是柔韧的、无毒的、可注射的、用于血管姠内生长的多孔模板所述孔应允许发生血管的向内生长。它们通常是在大约100-300微米范围内的互联孔即具有100-300微米的间距，但可以使用更大嘚孔基质应具有使其表面积最大的形状，从而可使营养素、气体和生长因子充分扩散到基质内部的细胞并可使新的血管和结缔组织向內生长。虽然已经证明即使基质典型的六面中的一或两面受到压迫该基质依旧能有效地使得组织生长，但是目前优选的还是相对抗压的哆孔结构物
根据所期望的最终形态、结构和功能，所述聚合物基质可被制成为柔韧的或坚硬的为了修复缺损，例如在移植过程中根據需要，将柔性纤维材料剪成近似于整个缺损的形状然后将其置于手术制成的缺损处并使它们相吻合。使用所述纤维基质的一个优势在於在移植时所述结构物容易重新定形和调整
也可以用海绵样结构物产生三维框架。所述结构物应为开孔海绵状其中含有与该结
