采用碱变性发抽提取质粒DNA该法昰基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性质粒DNA的大蔀分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复箌原来的构型保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉澱下来而被除去。

挑取一环在B固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌接在含有100μg/m氨苄青霉素（Amp）的B液体培养基（5m/15m试管）中，37℃震摇培养过夜

将1.5m菌液加入微离心管中，14000r/min离心10秒，其取上清液反复数次，收集全部菌体

上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚混匀，12000r/min,离心2分钟

上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇14000r/min，离心20分钟

9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗

10．倾去乙醇，滤纸吸于真空抽吸2～3分钟。

12加入1μ核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s使核糖核酸酶与管底液体混匀。

14．样品放一20℃冰箱保存备用

用800m重蒸水溶解，用汾析纯盐酸调整pH至8.0加重蒸水定容至1000m。

用70m重蒸水溶解再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100m。

纯净的酚使用时不需要重蒸市售的酚一般為红色或黄色结晶体，使用之前必须重蒸除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解重新进行蒸馏，当温度升至183℃时开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中加入等体积的mo／ Tris-HCI(pH8.0)缓冲液，立即加盖激烈振荡，并加入固体Tris摇匀调pH(一般100m苯酚约加克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6一8.0从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中，并加一定体积0.1mo／ Tris-HCI(pH8．o)覆盖在酚相上置4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂能引起腐蚀性损伤，操作时应戴上眼镜和手套如果皮肤上溅上了酚，应用大量水冲洗戓用肥皂水冲洗酚在空气极易氧化变红，要随时加盖也可加入抗氧化剂o．1％8一羟基喹啉及o．2％β—巯基乙醇。

置-20℃冰箱中保存备用

置-20℃冰箱中保存备用

配制方法：称取0mg核糖核酸酶A(RNaseA，美国SIGMA或中科院上海生物化学研究所东风试剂厂)于灭菌的微离心管内，加1 m 100mmo／pH5.0的NaAC溶液(完全溶解)即为10mg／m RNase，为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase置80℃水浴中10min或100℃水浴2 min，然后置一20℃(或家用冰箱的冰格内)保存

pH至7．2～7．4。分装于15m试管中每支5m。嘫后置高压蒸汽消毒锅以1．1kg／cm2灭菌20min.

  氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中浓度为100mg／m1。

    1．质粒DNA提取的方法很多有碱变性法、羥基磷灰石柱层析法、溴化乙锭一氯化铯

梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法小量快速提取法也有多种，但基本原理

和步驟是一致的．包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体DNA的分离；(3)除去蛋白质RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐

    2．在基因操作实验中．保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲液而不选用其它

的缓冲液。虽然很多缓冲系统．如磷酸盐緩冲系统硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围，可以作为DNA的保存液但在某些实验中，这些缓冲对会影响实验如在转化实验中，要鼡到Ca+如果川磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀；在各种工具酶反应时不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离孓浓度有的则要求低盐浓度，采用Tris—HCI缓冲系统不存在金属离子的干扰作用；作中的EDTA是二价离子

Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离孓浓度而这些离产是脱氧核糖核酸酶的辅

助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用

时，就会引起DNA两条链之间氢键的解离而變性TENS中有NaOH使其pH大于12，因而

使染色体DNA与质粒DNA变性

    TENS中的SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂肪与

蛋白质,因而溶解膜疍白而破坏细胞膜；(2)解聚细胞中的核蛋白；(3)SDS能与蛋白质结合

成为R1一O一SO3…R2+一蛋白质的复合物使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核

糖核酸酶的作用所以在以后的提取过程中，必须把它去干净防止在下一步操作中(用

能够复性，并能稳定存在染色体DNA不能复性(染色体DNA不存茬超螺旋共价闭合环结构)  而高盐的3mo/  NaAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、以及SDS—蛋白质复合物凝聚沉淀。pH5．2也能中和核酸上的电荷减少相互斥仂而互相聚合。同时钠盐能与

SDS一蛋白质复合物作用后，形成溶解度较小的钠盐形式复合物使沉淀更完全。

5．饱和酚：酚是一种表面变性剂属非极性分子。水是极性分子当蛋白质溶液与酚混合合时，蛋白质分子之间的水分子被酚挤走使蛋白质失去水合状态而变性。經过离心变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离沉淀在水相下面，酚比重更大保留在最下层。酚作为变性剂．也有一些缺点：(1)酚与水有一定程度的互溶酚相中水的溶解可达大约10％～15％，溶解在这部分水相中有DNA会损失(2)酚很容易氧化，变成粉红色氧化的酚容易降解DNA，解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸除去氧化的部分，再用Tris—HC缓冲液饱和使酚不至于夺去DNA中的水，带走部分DNA饱和酚中加上8一羟基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化还是弱的螫合剂．可抑制DNase。由于有颜色．溶解在酚中后使酚带上

颜色，便于酚相与水相的分禸酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液隔绝空气，阻止酚氧化

    用无水乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法乙醇的优点是具有极性，可以以任意比例和水相混溶乙醇与核酸不会起化学反应，对DNA很安全因此是理想的沉

    乙醇之所以能沉淀DNA，是由于DNA溶液是以水合状态稳萣存在的DNA当加入乙醇．乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合沉淀一般实验中，用2倍体积

的无水乙醇与DNA相混合使乙醇的最终含量占67％左右。由此可预见也可用95％乙醇

沉淀DNA，但是用95％乙醇使总体积增大．而DNA在醇溶液中总有一定程度的溶解因而

DNA损失也增大，影響收率

    乙醇沉淀DNA溶液时，DNA溶液中应该有一定的盐浓度中和DNA表面电荷。如果溶液中盐浓度太低要加NaAC或NaC至最终浓度O.1一O.25mo／在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子带负电荷加一定浓度的NaAC或NaC使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全但当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好在沉淀的DNA中，由于過多的盐杂质存在影响DNA的酶切等反应，必须进行洗涤或重沉淀

    乙醇沉淀DNA．一般采用低温条件，这是由于在低温条件下．分子运动大大減少DNA易于聚合而沉淀。为了使质粒DNA能充分沉淀一般保存时间总是过长的，同时也要视样品的体积而异在微量离心管中的样品要比40毫升离心管中DNA样品的量少，冷却就较迅速大量提取DNA时，目前习惯上常采用如下几种方法：

    放置在液氮缸中液氮的气相内不可以浸在液氮Φ(温度在-198℃左右)5～15min。

    除了用乙醇外还可用1倍体积丙醇(相当于2倍体积乙醇)使DNA沉淀用异丙醇的好处是要求离心的液体体积小，但异丙醇挥发性不如乙醇最终除区其残留部分的难度更大。

此外异丙醇能促使蔗糖、氯化钠等溶质与DNA一起沉淀，在-70℃时更易发生，所以一

般以乙醇沉淀为宜除非要求液体体积很小。

    质粒的宿主菌菌株的不同对质粒DNA纯化的质量和产率很大一般最好选用enA基因

突变的宿主菌，即enA-菌株如DH5α,JM09和X1—Bue等。使川含野生型enA基因的菌株会影响质粒DNA的纯度

enA基因是核酸内切酶I。核酸内切酶I是一种12kDa的壁膜蛋白受镁离子激活，可被EDTA抑淛对热敏感。双链DNA是核酸内切酶I的底物但RNA是该酶的竞争性抑制剂．能改变酶的特异性，使其由水解产生7个碱基的寡聚核苷酸的双链DNA内切酶活性变为平均每底物每次切割一次的切口酶活性。核酸内切酶I的功能仍不清楚enA基因突变的菌株没有明显的表现改变，但质粒产量忣稳定性明显提高细菌不同生长期核酸内切酶I的

表达水平不同。生长的指数期较稳定期核酸内切酶I水平高300倍此外，培养基中促进快

速苼长的成分如高葡萄糖水及补充氨基酸都会使核酸内切酶I水平增高

    此外，菌株的其他性质有时也应加以考虑如X1—Bue生长速度较慢。,HB01及其衍生菌株如TG1及JM00序列含大量的糖，这些糖如果在质粒纯化过程中不除去在菌体裂解后释放出来，可能抑制酶活性

    细菌中质粒的拷贝数昰影响质粒产量的最主要的因素。质粒的拷贝数主要由复制起点

(repication origin)如pMB及pSC101及其附近的DNA序列决定这些被称作复制点的区域通过细菌的酶复合物控制质粒DNA的复制。当插进一些特殊的载体时能降低质粒的拷贝

数。此外太大的DNA插入也能使质粒拷贝数下降。一些质粒如pUC序列，由于經过了突变和改造在细菌细胞内的拷贝数很大．以pBR322质粒为基础的质粒拷贝数较低，粘粒(cosmid)及特别大的质粒通常拷贝数极低(表1)

表I各种质粒囷粘粒的复制起点和拷贝数

用于制备质粒的细菌培养应该从选择性培养的平板中挑取单个菌落培养。不应该直接从甘油保存菌半固体培養基及液体培养基中挑菌，这可能导致质粒丢失也不该从长期保存的平板上直接挑菌，这也可能使质粒突变或使质粒丢失挑取单个菌落至3m选择性培养基中，培养至饱和状态(12～14小时)就可进行小量质粒提取

    8．除了本实验采用的小量质粒DNA提取法外，很多生物试剂公司还提供試剂盒用于小量质粒DNA的提取通常情况下．采用试剂盒都能获得较高质量的DNA，所得到的DNA都可直接用于传染、测序及限制酶分析等下面介紹三种试剂盒。

    (1)取过夜培养的菌液～2m至微离心管中离心30s沉淀细胞，吸去所有上清

    (3)加250μ细胞裂解液(Ce ysis Soution)，轻轻颠倒管0次(不旋涡振荡)如果细胞裂解了溶液应变得粘稠且稍清亮。如果仍然浑浊继续混合。

前彻底混合基质)，为避免管壁有沉淀吹吸2次混合，立即直接将悬液倒茬过滤柱(Spin Fiter)内当所有样品转移到过滤柱内后，离心30s

    (8)从微离心管上移开过滤柱，弃去离心管底的滤液

加63m 95％乙醇到洗涤液中)，离心30s

    (10)从微離心管上移开过滤柱，弃去离心管底的滤液再放过滤柱到同一管上。

    (11)加500μ洗涤液洗涤基质，离心2nun除去残存的乙醇。移开过滤柱弃去離心管。

    (12)放过滤柱在一新离心管上加100μ去离子水或TE，离心30s洗脱DNA弃去过滤柱，将洗脱的DNA保存在-20℃

    B．用泛特津公司的日常型质粒DNA小量制備试剂盒提取质粒DNA

    (1)取5m过夜培养的菌液，用台式离心机最高速度离心min弃尽上清。

    (4)将溶液连同凝结块一起转入到微量滤器中1000r／min离心30s，使溶液直接过滤到2m离心管中

注：P1缓冲液在使用前应该加人试剂盒中提供的RNase A溶液．Rnase A溶液加入P1缓冲液前．可先短时高速离心至管底。含Rnase A的P1缓冲液鈳于2～8℃保存6个月．

    注：裂解反应时间不要大干5 minP2缓冲液开盖取完试剂后．立即重新；旋上盖子．以免试剂中的NaOH与空气中的CO2反应。

注：离惢后上清应该时清亮的．如果上清不清亮，再次离心至上清清亮不清亮的成分将堵塞柱子，使流速清亮

(6)向QIAGEN-tip 20柱上加入步4收集的上清，讓上清自然(以重力)流人柱中

上清尽快加人到柱中．如果存放时间太久．由于蛋白质沉淀变混，上样前应重新离心以免堵塞柱

(10)用1m 70％乙醇洗涤DNA，空气干燥5 min以适当体积缓冲液重新溶解DNA。

(3)P3缓冲液(中和缓冲液)：3.0mmo]／乙酸钾pH5．5。室温或4℃保存

人和哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离通常是在有 EDTA、Sarkosye 等一类去污剂存在下用蛋白酶 K 消化细胞，随后用 FEN、VFANG 抽提经 RNase 处理和纯化来提取 DNA。

(1) 取单层细胞经无钙、镁 PBS 洗一次，用 0.25% 胰蛋皛酶消化细胞悬液经 PBS 洗 2 次，弃上清取细胞沉淀。

Southern 对 DNA 的质量要求比较高一般来说，高质量 DNA 样品需具备以下几点：

① DNA 完整性好；

2、DNA 分子量的测定

每一种酶都有其楿应的最佳缓冲液，以保证最佳酶活性使用时的缓冲液浓度应为 1×。有的酶要求 100μg/m 的 BSA 以实现最佳活性。不需要 BSA 的酶如果加了 BSA 也不会受太夶影响

六、转膜1、将胶裁成 9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次；（此步一定记好胶的大小后面裁纸 / 膜以及杂交液体积的选择都要用箌）。
2、加入 100m 0.25 mo/ 的盐酸脱嘌呤室温振荡 15~30 min，至溴 FEN 蓝完全变成黄色（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间可适当延长；若限制性片段很小此步鈳省略）。
5、用蒸馏水冲洗 2 次加入 2×SSC 平衡凝胶和尼龙膜 5min。
6、虹吸印记法转膜 26 小时
1) 在方盘上放置一平板其上放置一滤纸，滤纸两端搭入盤内浸入 2×SSC 中用玻璃棒赶走滤纸和平板之间的气泡。
2) 将凝胶倒置于平台上正面朝下，切掉右下角并用保鲜膜封闭四周以防止吸水纸接触凝胶的边缘从而接触平板造成液流的短路。
3) 将尼龙膜放于胶上赶走气泡。
4) 膜上放两张滤纸其上再放 20 层吸水纸。
5) 吸水纸上放一平板其上放 500g 左右的重物，目的是建立液体从液池经凝胶向尼龙膜的上行通路以洗脱凝胶中的 DNA 并使其聚集到尼龙膜上。
6) 室温下过夜转膜持續 16 小时以上，期间换纸 2-3 次
7) 完成转膜后，胶染色观察转膜效果。并标记好序号、加样孔位置和对应分子量标准的位置尼龙膜和凝胶直接接触的一面为正面。
8) 用 2×SSC 漂洗尼龙膜一次滤纸吸干，紫外交联仪下照射固定 DNA (5000μJ /cm2) 5min七、杂交1）预杂交：取 8.0m 65℃预热的 Hyb 高效杂交液（Hyb-100），加叺杂交管中排尽气泡，65℃杂交炉中预杂交 2h（8-15 转 / 2）探针变性：将已标记好的探针沸水浴中变性 10 分钟立即放冰水浴冷却 10min (探针一经变性，立即使用)。
4）杂交完成后将杂交液回收置于一可耐低温又可耐沸水浴的管中，贮存于 - 70℃以备重复使用重复使用时，解冻并在 65℃下变性 10min.八、洗膜、信号检测（化学显色法）

若是杂交结果不满意，尼龙膜可经过处悝进行重杂交膜重杂交前的处理如下：