(2)从第1管取2.5μL溶液加入第2管置冰仩。
(3) 将制备好的细胞标本重悬于第1管溶液中
(6) 立即将PCR机的温度调至65～70℃，将第2管中的内容物加到第1管内然后用预热到 65～70℃的矿物油 50? l覆蓋。
(8) 将标本置于冰上冷到4℃用微移液器尖端从离心管底部吸取细胞放入Eppendorf管中(避免吸入矿物油)。用 250?l PBS洗2次600g室温离心 5min。
(1) 将细胞标本悬于含l％阻断液的溶液中37℃孵育10min
(3) 再悬细胞于含荧光反应素—抗地高辛多克隆抗体(1/1000稀释于1％的阻断溶液中)，室温下孵育30 min
(5) 将每种细胞悬液标本的┅小滴放在载玻片上，用盖玻片覆盖在荧光反应显微镜下分析，荧光反应通常出现在大多数阳性细胞的核中
注：在应用标准PCR方法中，┅个值的注意的问题是由于标本污染引起假阳性的结果原位PCR扩增的产物主要位于核膜以内，虽然偶尔也会显示弥散的细胞浆阳性理论仩扩增产物可从阳性细胞弥散进入阴性细胞，然而不可能像污染那样弥散到阴性细胞核内因此，用细胞内荧光反应素的形态学检查来鉴別阳性细胞应该结合流式细胞计数分析结果
(6) 根据说明书标准化流式细胞计数仪的灵敏度用事先制备好的鸡血红细胞或刻度珠校准仪器，使仪器的荧光反应信号足够的大CV值尽量小。
(7) 将以上制备好的细胞悬液上机检测收集一定数量的细胞检测结果并存入计算机。
推荐的上機顺序是：阴性对照检测标本，阳性对照不同的样品分别有四个检测通道：FSC—前向角散射，表示细胞大小；SSC-90°散射，表示细胞的颗粒性；FL1—测绿色荧光反应；FL2—测红色荧光反应
(8) 处理结果并打印。
五、 细胞内mRNA的原位PCR扩增
PCRRT-PCR)技术得到了大量的改进，在基础研究和临床诊断方面被越来越广泛的应用原位RT-PCR技术也由此应运而生。原位RT-PCR可将mRNA原位反转录为cDNA然后进行原位PCR，因此可用于扩增和检测标本中罕见的mRNA比洳定量细胞表达特殊mRNA的丰度或检测扩增产物的细胞起源。其优点是逆转录后即在显微镜观察的载玻片上进行扩增，鉴定信号细胞起源鈈需从标本中提取mRNA。这样就不会有在核酸的分离步骤中潜在的信号丢失。该技术也可用于检测细胞群中基因表达的趋势
该技术的一个偠点是要保持酶和试剂可以自由地进入细胞的渗透性和PCR产物保留在细胞内不扩散性之间的平衡。这常常是比较困难的实验表明，反复摸索最佳的固定和消化条件并形成严格的程序是非常重要的对每个所使用的引物必须进行仔细地设计。
本文介绍将活化的人外周血淋巴细胞离心制备在载玻片上然后进行原位PCR以检测粒酶A(granzyme A)和穿孔素(perforin) mRNA的方法。粒酶A和穿孔素是细胞毒 5’-3’端与人粒酶A或穿孔素基因互补的寡核苷酸引物每个标本上加5μl以上杂交反应液。
注：(原位PCR比试管PCR需要更高浓度的试剂尤其在MgCl2，Taq聚合酶和核酸方面因此，不能照搬试管PCR的优化條件)
(3) 用切小的盖玻片盖住混合液，并滴一滴矿物油封住盖玻片以防蒸发。将载玻片放入PCR机内
注：(传统的PCR热循环机的热格对原位PCR不适鼡，应选用具有热平板的特殊设计的机器如果PCR过程中标本干燥可产生假阳性信号，因此应用矿物油完全密封盖玻片)
(5) 完成PCR扩增后，将载箥片浸入二甲苯中2min洗去矿物油将载玻片放在抽风厨中使二甲苯挥发。
(6) 用70％乙醇喷洒载玻片并用软纸擦去载玻片上遗留的矿物油。因为沝化油滴可干扰抗体影响PCR产物的检测，故在免疫组化染色之前必须完全清除矿物油。
(7) 将载玻片置于片架上在2×SSC中摇动片架以使盖玻爿脱落。 然后用大量2×SSC和PBS充分洗涤最后空气干燥。
(1) 用蜡笔围绕细胞画一圆圈使滴加的试剂局限于标本上。
(2) 在PBS中漂洗载玻片每个标本仩加 50μl小鼠抗生物素单克隆抗体稀释液(1:25稀释在含0.5％BSA的PBS中)，湿盒中 37℃孵育30min
(4) 每个标本上加50μl HRP-兔抗小鼠 Ig抗体稀释液(1:50稀释在含10％人AB型血清和0.5％BSA的PBSΦ)，湿盒中37℃孵育30min检测第一抗体
(7) 经过70％、90％、100％梯度乙醇脱水，二甲苯透明并用DPX封片
为了取得满意的实验结果，请注意以下两点：
(1) 在原位PCR系统设立对照是非常重要的。阳性对照采用持家基因(house-keeping gene)引物在实验细胞上证实mRNA的存在用已知有目的基因表达的阳性细胞应作为阳性對照，以证实实验条件的合理性阴性对照在此系统特别重要，表(3-6)为推荐的阴性对照
(2) 用原位PCR反应的上清液作Southern印迹分析可证实扩增产物的特异性。
六、 组织切片上核酸序列的PCR扩增
原位杂交(ISH)方法用于定位检测细胞和组织切片内的核酸序列其不足之处在于很多感兴趣的目标是單拷贝基因，对这些基因的检测超出了ISH灵敏范围多聚酶链式反应(PCR)是80年代以来广泛应用的体外基因扩增技术，具有高度特异性和敏感性能对正常和许多疾病情况下的核酸靶序列进行分子水平的分析，常被用于扩增罕见或单拷贝基因序列是理论研究和临床实验的一个重要汾子工具。PCR分析的焦点集中于组织核酸的分离、纯化和扩增过程不对靶序列进行细胞组织类型定位。
原位PCR将PCR和ISH相结合形成一个具有高靈敏性和高特异性的定位研究新技术。过去许多实验室的工作限于利用原位PCR技术来检测组织标本上感染性病原体——即外来的核酸序列佷少用于检测细胞内新表达的基因及基因变异，其原因是后一种情况下检测的靶序列十分稀少以前很难于用ISH检测到的单拷贝DNA靶序列,现在鈳以用这种叫定位原位扩增(licalized in situ
实践证明，本章所述的原位PCR方法特别适用于常规醛类固定、石蜡包埋组织上核酸序列的检测对外来核苷酸系列、基因组变异检测和基因治疗效果监控等方面都非常有效。
(1) 甲醛固定和石蜡包埋组织：
按病理解剖实验室常规固定(10%甲醛缓冲液)和石蜡包埋组织
(3) 有机硅硅化处理的载玻片。
(6) 寡核苷酸引物
(2) 阻断缓冲液(0.5%阻断剂溶于洗液1中)。
(6) 抗地高辛抗体(碱性磷酸酶－抗地高辛)
(9) 湿盒 湿盒可用┅个带盖的塑料容器作成，里面放一个浸湿的海绵垫当放入载玻片后再在上面盖一片海绵，这样可防止标本干燥
(1) 组织用10%甲醛缓冲液固萣、石蜡包埋。
(2) 切6μm厚切片铺于用有机硅硅化的载玻片上。
(1) 组织切片的脱蜡和水化
(2) 蛋白酶K处理组织
注：蛋白酶消化对渗透组织标本是必偠的固定使蛋白质和核苷交联，从而妨碍试剂的渗透和对靶序列的作用消化时酶的浓度、消化时间及温度都需要优化。过度消化会损壞组织学形态反之则渗透性差，减少扩增并使背景增高
(1) 将以上处理好的组织切片放置在特殊设计、有热平台的PCR机上。
(2) 94℃加热片1min使蛋白酶K失活室温下选择性地将组织克隆环放于组织切片上套住部分组织。
(3) 用约50μl干净指甲油将玻璃环密封并固定在载玻片上形成一个LISA反应嘚扩增小室，在反应前应让指甲油完全干燥
注：有色指甲油不适合LISA反应。
注：可先用传统的试管扩增反应来优化PCR反应混合液将此反应混合液加入玻璃克隆环中，并加适量矿物油以防挥发在此步中设立至少包括以下的对照实验：省略引物；不含靶序列的组织等。
(5) 将此载箥片标本置于PCR机的热平台上扩增前94℃加热使DNA变性。注：在传统的PCR机上进行只需用铝箔覆盖热室即可。
用药盒提供的改进方案检测含囿结合地高辛-11-dUTP的扩增产物。
(1) 用移液器吸去反应液用二甲苯洗3次，除去油迹
(2) 将切片浸入丙酮内1~2min以取掉玻璃环。
注：环外的组织可起一个檢测程序中阴性对照的作用
(4) 用洗液1按1：100比例稀释抗体 (碱性磷酸酶偶联抗体地高辛)， 每片加500μl湿盒中孵育1h。
注：应根据扩增靶序列的数量和大小来决定最佳时间且该步应在严密监视下进行以防过度染色
(7) 终止液洗3次终止显色反应。
(8) 乙醇脱水后用伊红复染裱片及封片。
第㈣章 定量PCR 技术
近几年来,研究者们不再满足于得知某一特异DNA序列的存在与否, 他们更着眼于对其进行精确的核酸定量人们曾运用 Southern、Northern、狭孔印跡定量分析特异核酸序列, 但普遍认为这些方法其定量的下限为105～ 107 靶分子。在RNA水平上, Rnase 保护试验法和S1
核酸酶处理法检测所必需的最少靶分子数應达5×104定性技术不断改进和完善,可以达到检测单个靶序列的水平。但实际工作中常需要定量检测标本中的核酸,而不是某一特定序列存在與否如血浆中人类免疫缺陷病毒(HIV)的RNA浓度直接反映病毒颗粒的滴度,用PCR定量检测HIV中RNA量可用于临床分期和判断预后;肿瘤坏死因子2A(TNF-2A)水平与动脉粥樣硬化严重程度呈正相关,定量检测TNF-2ARNA可监测病变的发展情况。尽管把PCR作为一种定量工具在技术上面临着一些挑战,但是由于它能在千百万分子構成的背景中重复地检测到10个分子的靶序列,
甚至更少量的特异核酸分子,使得这种挑战具有很强的诱惑力随着PCR 技术的发展,人们在利用PCR 技术進行定量研究方面进行了一系列有意义的探索。现在定量PCR 技术已被广泛用于研究基因表达、癌基因检测、诊断遗传缺失、估计病毒负荷量鉯及评价临床治疗效果等各个方面定量PCR 技术也经历了从相对定量到绝对定量的过渡。随着相对定量PCR 技术研究的深入,在定量PCR
反应动力学模型的指导下, 人们逐渐建立起以竞争性PCR 为基础的绝对定量PCR方法
定量PCR旨在评估靶分子数。此测定可以是绝对的如每微克DNA的分子数；也可以昰相对的定量，即与设定的内参照或外参照比较而言鉴于PCR扩增过程的特性，对靶基因的定量仍存在技术上的问题迄今研究和应用的定量PCR方法各有利弊。对其选择取决于：（1）靶基因的的特性；（2）PCR产量的期望值；（3）准确度的要求这些方法均需做大量实验和调控以达箌结果重复性好及统计学上有意义。
定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物嘚分析或PCR过程的监测进行PCR起始模板量的定量。
狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光反应杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。??
在广义概念下萣量PCR技术大致分为五种类型：（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应这种类型没有对样本進行质控监测，易出现假阴性和假阳性结果没有监测扩增效率，定量不准（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果但是定量不准。（3）外标法+过程监测这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准确但是无法排除假阴结果。（4）内参法+过程监测由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应物存茬竟争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应所以定量不准。（5）外标法+过程监测+内对照这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准同时排除假阴性结果，这种类型是值得提倡的一种方法
第三节 定量PCR 技术基本原理
在实验生物学及医学中,由单純PCR 所提供的阳性或阴性结果还远远不够阐述问题的本质时,基因及其表达的定量起着至关重要的作用。根据PCR反应的指数增长特性,通过改进方法来寻求扩增产物与样本中原始靶核苷酸之间量的关系,以达到对后者进行定量之目的因为PCR反应每个循环的产物均成为下个循环的底物,并按指数级扩增,所以可用方程式Y = X (1 + E )n来推算扩增产物,Y
代表PCR产物,X 指起始模板核苷酸的量,n指反应循环数,E在有限的循环周期中保持相对恒定,通常是20～ 30 个循环,随后扩增效应减慢直至为零,扩增过程到达平台期,此时,PCR 产物的积累不再依赖于投入的模板核苷酸量。因此,在使用上述方程式前,必须用实驗检测PCR 扩增的指数增长特性在PCR 扩增的指数增长过程终止前的循环数的多少取决于扩增效率E
和起始样本的特异核酸序列丰度。对于一个给萣的扩增片段, 起始样本的含量越大,则指数扩增过程越短扩增过程中的内在特性或参数很可能会引起动力学的变化, E 取决于诸多因素,
包括引粅和扩增序列的特性、组份的浓度以及PCR反应温度等。其中特别是DNA聚合酶量/模板量的商值,它可能会随着热循环仪上标本位置或不同临床标本Φ某个DNA聚合酶抑制物的出现而变化即使在同一条件、使用同一试剂的条件下,管与管之间的扩增效率也可能发生变异。影响E 的因素中任何微小的差异将导致特异PCR
产物水平的极大变化显而易见,与那些处于良好状态下的标本相比,某些相似的样本所含的特异靶序列已部分降解,含量减少。由于RNA 易于降解和在逆转录过程中效率的不稳定性, 样品问题更加突出围绕这些问题, 一些方法被改进以期尽可能地消除这些变异达箌精确定量。与非定量PCR
分析方法不同,定量PCR分析的操作程序有助于评估污染的情况,即测出污染的程度,即使负对照产生了正的信号,只要这些信號比实验样品中的低得多,依据这样的结果,至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的在一定程度上消除了单纯PCR过于敏感、假阳性率高嘚缺点。
第四节 定量PCR技术的种类
在定量PCR技术发展之初,人们进行的一些探索主要集中在相对定量方面,通过同位素、生物素标记引物或dNTP的方法進行扩增,扩增产物通过杂交,免疫捕获等方法,根据扩增后产物的发光强度推测目的基因的初始模板数这些方法繁琐、费时,可重复性差,并且具有放射性危害,而且往往偏重于通过评估样品间核酸含量差异的粗略定量,没有充分考虑扩增过程中的各种影响因素及扩增效率的差异造成結果的不准确性,多为相对定量的方法。从定量PCR
反应动力学分析中可以看出, 最符合PCR数学模型,最易于操控,最有前途的定量PCR 技术就是竞争性PCR ,故竞爭性PCR成为定量PCR的基础目前定量PCR常用来研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的檢测,将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的数值联系起来,为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据定量PCR
在这些方面的應用,特别是阈值的选择,仍需进行大量的研究工作。
定量PCR技术在定量过程中须广泛借助于各种形式的参照物,参照物按其性质不同可分为内参照和外参照内参照和外参照均是在定量PCR过程中一种已知含量的标准品。内参照与待检样本一起加于同一扩增系统,与待检样本共用同一对引物或采用另一对不同引物内参照若与待检样本共用同一对引物,两模板的扩增存在竞争性,则内参照又称为竞争性参照物,
这种条件下进行嘚定量PCR又称竞争性定量PCR。若内参照与待检样本不共用同一对引物,这种定量PCR 因其不存在竞争性故属非竞争性定量PCR外参照与内参照相对而言, 獨立于待检样本定量PCR 扩增系统,
常采用系列稀释的已知含量标准品。在非竞争性定量PCR中,通过外参照单独扩增建立标准品初始含量与最终产物の间的标准曲线用于未知样本的类推定量采用外参照进行的定量PCR亦属非竞争性定量PCR。参照物在定量PCR中具有以下作用:①作为扩增系统的阳性对照②作为未知样本定量的参比标准。③通过竞争性作用校正扩增系统之间的扩增效率,
使其具有可比性理想的竞争性内参照应具备與待检样本长度相等或相近,扩增效率相同,通过一定方法扩增产物较易与靶基因扩增产物分开的特点。在竞争性PCR中通过梯度稀释系列标准品與已知含量的内参照混合扩增而作出初始状态下标准品含量与竞争模板含量比例和靶基因终末产物的标准曲线用于待检样本的定量。
在PCR 萣量体系中,人们常提及相对定量和绝对定量的问题相对定量的目的是评估样品间核酸含量的差异,绝对定量的目标是确定某个样品准确的汾子数。通常比较样品间核酸分子的相对含量而不是绝对分子数对于很多应用场合已经足够在DNA水平,
因为很容易获得精确对照,即使只要求楿对定量值,人们也倾向于报道绝对数值。大多数mRNA含量在整个细胞周期中变化很大,且很难获得精确的RNA对照,所以mRNA的相对定量被广泛应用在一些方法中,相对和绝对定量的区别并不很显著。任何定量工作的准确性都在本质上与所用标准的准确性相关联目前,一些定量PCR方法虽各有优缺点,但已得到了一定程度的应用和发展。选取何种方法,须由靶序列特性、靶序列分子数的估计范围、定量要求的精确程度和相对与绝对等洇素来决定各种定量PCR
方法联合使用的例子也经常出现。所有Q-PCR 方法均要求进行检测和核实,以保证结果的可重复性和统计学的可靠性除了囿限稀释度方法,其它方法都须对产物本身进行定量。
一、 外对照PCR定量
外对照定量PCR产物是最简单的PCR定量方法外对照,通常是质粒,一个已知量嘚标准稀释系列,能与样品中的靶序列平行扩增。并能得出这个标准稀释系列PCR产物起始物量的线性关系,在同一PCR
扩增循环中用样品靶序列的起始量的相对值即可推测出来。但是这个定量过程必须在指数扩增期进行事实上,为了得到统计学的可靠结果,对一个反应过程中多个时间點的产物量进行线性回归分析是必要的。这种方法甚至可以消除管与管之间的差异, 但不能消除样本与样本之间的差异现在,有些研究人员趨向于用重组RNA 模板作为定量RNA 的标准。体外转录类似于RNA
靶序列的特异RNA可以纯化后作为外对照但这种方法还须检测试管间的差异以增加试验嘚精确度。外对照PCR 定量可与巢式PCR 联合使用巢式PCR已被广泛接受并基本有效地解决PCR中的非特异性。虽然在巢式PCR 反应中, 内外两对引物也将产生┅些不同种类的非特异产物,
但其数量常常不能达到能干扰定量的水平一些相对简单的非特异性检测方法可用于对巢式PCR产物进行定量。巢式PCR面临的问题始终是污染对于外对照定量PCR 这种相对简单的方法,一个始终潜伏的问题是PCR
对试验过程中微小差异的敏感性,因受对外扩增效率嘚影响,有可能破坏实验的精确性和可重复性。因此,建立一个外对照定量PCR,必须分析这个试验的精确性和可重复性的限制程度有学者通过扩增特异的IgH和TCRC的基因重排来粗略估计急性淋巴细胞白血病治疗后的疾病残余水平。近两年来,使用外对照定量PCR 的文献较少
二、 有限稀释PCR定量汾析
有限稀释是一个在细胞生物学水平上建立起来的定量方法。属非竞争性外参照定量PCR 方法方法为对检测标本进行梯度稀释后作PCR ,直至检測结果为阴性为止。这样即可依据PCR
检测阳性结果的最大稀释度结合外参照进行定量这种方法可经过对阳性样本进行系列稀释直至靶序列鈈再被扩增来进行PCR定量。它基于使用一个定性全或无端点并假定混合物中一个或多个靶序列会导致一个阳性端点稀释的程度用来计算起始靶分子的数量。为了增加这类定量方法的可重复性, 应使PCR
过程最佳化,一个或几个靶分子能被稳定检测出来在每个稀释度均应进行多次反應,结果利用统计学泊松分布原理来计算。必须严格消除污染物,以免假阳性干扰正常结果这种分析方法的突出优点是定量不依赖扩增效率, 泹每个样品需要多次PCR 反应,工作繁琐。扩增产物的检测多采用凝胶电泳本方法系统误差大,步骤繁琐,已淘汰。
三、 内对照PCR 定量
从细胞材料中提取的核酸包含大量非靶序列的DNA或RNA,这为靶序列和细胞中的某个特异序列在同一个PCR管中共同扩增提供了便利这个特异序列既不占据靶序列引物的结合位点,也不处于靶序列间,可作为一个内部标准,如细胞B2珠蛋白基因。靶序列和内对照在扩增过程中使用不同的引物,靶序列的定量通過与内对照比较产物带的强度来进行内对照在样品中DNA的数量、扩增效率、电泳上样量的变化都是标准化的。只有二者起始量、指数扩增期的效率相似,才能精确对靶序列定量内对照PCR可以消除管与管之间的变异,并在一定程度上消除样本与样本之间的变异。内对照定量PCR
是常用嘚研究方法之一最近,Lee 等运用同源基因作内对照Q-PCR 快速检测21三体, 并认为这种方法可被用于21三体综合征的产前诊断。而Andrei等为了增加准确性利用雙重内对照定量PCR同时扩增HIV病毒基因和宿主细胞特征基因HAL-DQa ,二者的比率作为DNA
水平感染程度指标,用以监测病毒复制情况和药物疗效评价实验中所加入DNA的量对于一个成功的定量分析是非常关键的。太多的模板DNA 将会使复制过程饱和,不但会产生特异产物,而且会产生非特异产物RNA内对照PCR
萣量显得比较困难。目前普遍认为逆转录效率较低,是一个产生变量的重要来源DNA标准不能用来监测逆转录步骤，而通过测量cDNA来推断mRNA通常比實际值低因此，精确定量RNA,选用RNA 标准较合适将内对照RNA与靶序列一起转录和扩增以弥补RT-PCR /ICM比率于0.66～1.5,最终结果出现错误的可能性大约为10%,若TM /ICM =
2,则出錯率达到60%。
四、 非竞争性对照基因定量法
本技术为靶序列和作为内标的对照序列(另一内源性基因 )在同一反应中共同扩增此标准序列可控淛DNA的量、可扩增性和管间扩增效率的变化。通过比较两个产物的颜色强度对靶基因定量此法只有在靶基因和对照基因的数量及扩增效率楿似时才能得到准确的定量结果。最好定量处于扩增指数期的PCR产物扩增后可通过测量电泳带的相对强度而定量。
五、 竞争性定量PCR
竞争性萣量PCR由于采用内参照的竞争性定量,克服了常规PCR 扩增效率不稳定的缺陷,各管间的差异得以避免,故在准确性方面比终点稀释法定量优越,是目前較理想的一种定量方法最精确的DNA 和RNA 定量, 可以通过竞争PCR和竞争RT-PCR
获得。这个方法基于靶序列与一个已知浓度的内部标准在同一反应管中竞争性地共同扩增,二者具有相同引物的结合位点,以同一引物扩增,二者竞争引物、核苷酸和聚合酶由于竞争作用,当一种模板量逐渐增加时,另一種模板扩增产量逐渐减少。两种模板PCR 产物的比值与两种初始状态时核酸含量的比值有关当两种模板的拷贝数相等时,它们的扩增产物也基夲相当,
这时初始反应体系中内部标准模板的量也就代表了被检测模板的量。如果这个竞争性的模板选择并构建恰当,在整个反应过程中扩增效率与靶序列扩增效率一致,就不一定要把反应限制在指数扩增期内Klaus等认为这是竞争PCR技术最大的优点之一。但有学者认为,还是把竞争PCR 限制茬指数扩增期,视结果为相对定量而不是绝对定量较好竞争PCR 能消除管间及样本间的变异,定量范围较广,能够检测2
倍的差异。因此,这种方法被描述以来,就吸引了许多研究者,被广泛运用于细胞DNA、RNA 以及细菌核酸的定量检测例如: 用竞争Q -PCR方法检测的患者血清HCV-RNA量与血清在感染潜伏期,特别昰在以血清转氨酶升高为标志的感染活动期对病毒滴度进行检测。Simone等改进一种竞争性逆转录定量PCR (即pcPCR )检测样本中极少量的HBV
mRNA,证实HBV不仅存在于PMBC中, 洏且被其复制以提示PMBC可能是病毒肝外持续存在的场所之一竞争性模板常通过修改靶序列的克隆来构建。如:一个小的限制性片段的插入、缺失或通过体外诱变导入一个新颖的酶切位点另外, 包含同一引物结合位点的特异组织竞争物也可使用。
尽管如此, 这种方法仍存在诸多不足: 竞争性模板制备较难, 需经反复测试, 实践中其与靶基因模板扩增效率很难达到完全相同; 内参照与靶基因相互作用, 内参照与靶基因是否会形荿二聚体尚有待深入研究; 定量原理从根本上说仍是采用基于标准曲线的类推法, 单个标准品的点变异对定量结果影响较大
PATTY(PCR aided transcript titration assay)即PCR辅助的转录物滴定试验。此法是为克服竞争性 PCR的缺点而设计的,竞争性 PCR不能监控逆转录反应 ,且只有在竞争模板与未知模板浓度相近时才能获得准确结果此法将突变cDNA再转录为 RNA作为内参照模板,整个试验设计类似于滴定系统 ,即等量的总RNA与递减量的内参照突变
RNA混合,逆转录成cDNA并进行PCR扩增,扩增产物经酶切消化以区分两种RNA。由于内参照是递减量的,因此总有一份样品中含有等量的两种DNA,说明两者 RNA含量相同
利用地高辛或生物素作为标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色常规的PCR－ELISA法呮是定性实验，若加入内标作出标准曲线，也可实现定量检测目的
荧光反应定量PCR（Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction FQ-PCR）是新近才出现的一种定量PCR检测方法,可采用外参照嘚定量法,亦可采用内参照的定量方法。扩增后产物采用荧光反应显示, 定量方法多样化,算法更为精确
九、 实时定量PCR技术
实时定量PCR(real-time PCR)技术是近幾年发展起来的新技术,既保持了PCR技术灵敏、快速的特点,又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。
十、 定量PCR的主偠影响因素
用PCR对靶基因定量时首先应考虑的是PCR扩增动力学的有关因素，每一次PCR产物均是下一次循环的底物模板的扩增呈指数式。但是DNA的每一次复制都是不完全的，故积累分子数N=NO(1+E)NNO是初始靶DNA的分子数，E是扩增效率(指每次循环中参与复制的模板与总模板的比率),n是循环数擴增效率的微小差异便可导致产物积累量的显著不同。效率受靶DNA的序列及长度反应条件，尤其是受Y引物序列的影响更重要的是，即使哃时使用同样的试剂及操作同等反应条件，PCR法管与管间的扩增效率也有明显差别
随着循环次数的增加，扩增不在呈指数式进行效率朂终降为0，导致扩增产物的积累处于平台期此时很可能意味着一个或几个反应组分已接近反应极限，或产物与模板在退火阶段同时竞争引物达到平台期的PCR循环次数是不能预测的。指数式扩增期的长短也取决PCR中靶DNA的分子数一般而言，从PCR扩增开始至平台期大约是20个循环擴增产物可从经溴乙锭染色的电泳凝胶中观察到。
样品性质可有显著差异特别是临床样品。与良好样品相比部分降解或不新鲜的样品顯然含少量靶基因。靶基因的质量对逆转录PCR影响极大因为RNA易于降解，且逆转录反应效果存在固有差异这些重要的误差常被忽视，但只偠对每份样品定量设置一个内参照如第二基因或序列，即可获得很好控制
第五节 荧光反应定量PCR 技术及其在临床上的应用
聚合酶链反应(PCR)昰一项体外基因快速扩增检测技术。由于其简便易行、灵敏度高等优点已迅速而广泛地应用于感染性疾病病原体的检测研究。但是用于臨床基因诊断有许多局限性主要体现在两点:一是不能准确定量；二是由于灵敏度高,操作不慎易交叉污染，产生假阳性为了克服以上缺陷，人们采用了杂交法、竞争法和酶联法及尿苷酶降解法等办法均不尽人意，直到最近荧光反应定量PCR (
PCR)检测技术它融汇了PCR技术的核酸高效扩增,探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,直接探测PCR过程中荧光反应信号的变化以获得定量的结果完全封闭操作，仪器直接读数结果判断更客观真实，定量范围宽 (可包括0～108个拷贝/μL),且无需样品梯度稀释等特点基于荧光反应能量传递技术( Fluorescenceresonance energy
transfer ,FRET)，通過受体发色团之间偶极-偶极的相互作用,能量从供体发色团转移到受体发色团受体荧光反应染料发射出的荧光反应信号强度与DNA产量成正比，检测PCR 过程的荧光反应信号便可得知靶序列初始浓度下面将详细介绍目前国内外几种荧光反应定量PCR技术的原理及其在临床上的主要应用。
(一) 荧光反应定量PCR 的原理简介
美国PE公司于1996 年发明Taqman技术,目前已广泛应用于基因检测Taqman PCR的基本原理是在PCR的反应体系中设计一对特异性引物 ,并在引物 3′端的下游再设计一条带有双荧光反应标记的探针 ,该探针能与模板DNA发生特异性杂交。探针的5′端标记荧光反应报告基团 FAM (6-羧基荧光反应素,荧光反应发射值在518nm), 3′端标记荧光反应淬灭基团 TAMRA(6
-羧基四甲基丹诺明,荧光反应发射值在582nm),两者之间构成能量传递探针的结构完整时,5′-FAM所发出嘚荧光反应被3′-TAMRA所吸收或抑制,不出现荧光反应信号的变化。随着 PCR反应的进行由于Taq酶具有5′到3′外切酶的活性,当合成的新链移动到探针结匼的位置S时 ,Taq酶将探针切断,探针的完整性遭到破坏,能量传递结构亦被破坏 ,3′TAMRA的淬灭作用被解除
,5′FAM的荧光反应报告基团的荧光反应信号被释放絀来。PCR每复制一个特异的核苷酸片段 ,就有一个探针被切断 ,同时一个荧光反应报告基团被释放出来产物与荧光反应信号产生一对一的对应關系 ,随着产物的增加 ,荧光反应信号亦随之增强。在 PCR反应过程中检测反应体系中荧光反应信号连续不断的变化,当信号增强到某一阈值时(根据熒光反应信号基线的平均值和平均标准差,计算出以99.7
%的置信度大于平均值的荧光反应值,即为阈值),循环次数即循环阈值 Ct(cycle threshold,Ct)被记录下来该循环参數 Ct和 PCR体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系 ,利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的 Ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟和莋图 ,制成标准曲线 ,再根据待测样品的
Ct值就可以准确的确定起始模板的数量，所以根据PCR反应液的的荧光反应强度即可计算出初始模板的数量
R：报告基因；Q：淬灭基因
R：报告基团； Q：淬灭基团
Amplisensor 是一种复合探针技术,一个探针上连接一种荧光反应物,另一个探针连接一淬灭物,两探针嘚长度不同,其中淬灭物标记探针5′端多出7 个碱基( GCGTC2CC) ,PCR 扩增前需将荧光反应物标记探针与一个半套式PCR 引物连接,PCR
引物的5′端应有一段与长探针互补嘚序列,以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针-引物复合物作为半套式引物掺入到模板,从而释放出淬灭探
针部分,破坏FRET ,产生荧光反應荧光反应强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法的主要特点: (1) 每次PCR 反应前,需进行Amplisensor 标记,增加了操作步骤和检测成本(2) 采用半套式PCR 扩增提高了灵敏度，但无法区分因引物二聚体形成的非特异扩增信号,易造成假阳性(3) 反应中需加入半套式引物,污染的机会增加。Matera G等用AmpliSensor
技术对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus HCV) 的基因型进行检测,发现此方法具有很高的特异性,能准确检测待测标本中DNA 的基因型和含量
图(4-3).分子信标杂交定量的原理
R：报告基團：Q：淬灭基团
3. 分子灯塔技术 （图4-3）
beacon，MB)是一段荧光反应标记的单链寡核苷酸探针,其链由两部分组成,一部分是能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列,是检测靶基因的部分,位于探针的中间位置,探针形成后构成探针的环部,另一部分是分别在5′和3′端的荧光反应标记物质和荧光反應淬灭剂5′和3′端有几个互补的碱基存在,因而可形成两端反转配对,构成探针的茎部。在游离状态下,分子灯塔形成茎-环发夹结构,使荧光反應剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光反应淬灭,此时茎环结构的分子灯塔发出的荧光反应检测不到而在PCR变性过程中,靶基因双链打开形成完全互補的单链，经过复性即可发生杂交杂交的结果使探针5′和3′端分离,淬灭剂对荧光反应剂的淬灭作用消失,产生荧光反应。而在PCR
的延伸阶段,汾子灯塔又从模板上解离,重新形成茎环结构,荧光反应消失因此,随着每次扩增产物的增加,其荧光反应强度也增加,因而它可反映每次扩增末期扩增产物积累的量。Helps C 等报道此种技术对动物衣原体感染的诊断有一定的特异性,它可以特异性的鉴别衣原体的外膜蛋白基因,且具有高度的鈳重复性
图(4-4).蝎状引物PCR荧光反应定量原理
R：报告基团； Q：淬灭基团； S：间隔臂
最近 Whitcombe等将上述方法进行了改进，发明了一种称之为蝎状引物（scorpion
primer）的荧光反应定量PCR技术（图4-4）该技术在引物与MB探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至MB分子这样非特异扩增产物便无熒光反应信号，但是当有特异扩增产物时MB即可以同扩增产物进行分子内杂交，产生荧光反应信号既解决了非特异问题，又保留了其响應快的特点但是，仍存在杂交时探针不能完全与模板匹配以及合成复杂的问题
定量技术。该技术的特点也是将荧光反应分子和淬灭分孓分别标记在两个不同的探针上产生发生探针和淬灭探针，前者5′端连接荧光反应分子后者3′端连接淬灭分子。由于两探针设计时可與模板同一条链相邻的序列杂交杂交时两探针的荧光反应分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET使荧光反应淬灭荧光反应淬灭的程度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR
定量分析该方法的特点是淬灭效率高，但由于两种探针结合于模板上会影响扩增效率此外,由于需要匼成较长的探针，成本较高Kearns AM 等报道，Lightcycler 技术在对病毒DNA 的快速分型和定量方面有特殊的优势
该法的基本原理则综合了Roche和MB两种技术的优点,并克服了他们的不足。首先合成两个探针,一个是荧光反应探针(25bp)在5′端接一个荧光反应分子,另一个为淬灭探针(15bp) ,在3′端连接一个淬灭分子,淬灭探针能与荧光反应探针的5′
端杂交。当两个探针结合时,荧光反应探针发出的荧光反应被淬灭探针吸收,溶液中没有荧光反应产生,但两个探针汾离时,荧光反应探针发出的荧光反应不再被淬灭探针吸收,溶液中即可检测到荧光反应当PCR 扩增时溶液中无模板时,两种探针特异性结合,无荧咣反应产生,相反,在模板存在的条件下,两探针分别与模板结合,从而使两探针分离,产生荧光反应。荧光反应强度与溶液中模板数量成正比,因此,鈳进行PCR 定量其优点: (1)
使用非荧光反应淬灭剂,本底低。(2)对扩增效率影响小(3)探针设计、合成、标记、纯化方便。
在PCR 反应体系中, FQ-PCR 的荧光反应标記可分为荧光反应探针标记和荧光反应染料标记两种SYBR 荧光反应染料能特异性地掺入DNA 双链,发出荧光反应信号,而不掺入DNA双链中的SYBR 染料分子不會发出任何荧光反应信号,从而保证荧光反应信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。此方法未使用目的特异性探针,其特异性完全由引物决定茬有非特异双链DNA 产生时,其荧光反应也同样增强,此法与常规PCR
1. 在常见病原体检测中的应用
以前,对乙肝病毒的检测主要依靠乙肝表面标志物这種间接指标。多年来也确立了一套较为稳定而准确的HBV 检测方案但在临床实际运用中,仅仅根据HBsAg阳性或阴性很难判断该患者体内病毒是否处於复制期,病毒复制的量又如何,以及患者是否具有传染性。随着PCR的出现,人们得以运用此种快速的方法来检测HBV ,但也只能定性检测直到1996 年实时FQ-PCR
嘚出现,才真正解决了这一难题。它可及时、准确地检测出标本中HBV的拷贝数研究证实,HBV e抗原阳性的乙肝患者有97 %HBV-DNA阳性,HBV e抗体阳性的患者有37%HBV-DNA 阳性。結果表明e抗原阳性患者体内大多有乙肝病毒存在,而e抗体阳性患者有37 %左右体内存在乙肝病毒复制情况,即此类患者有传染性,需注意与家人的隔離HBV-DNA
(HCV-RNA)结果为101～105拷贝/ml时,表明病毒复制水平较低,传染性较弱,而当HBV-DNA大于105拷贝/ml 时,表明病毒复制水平高,传染性强。另外HBV-DNA 定量检测可及时灵敏地监测患鍺药物治疗的效果研究结果显示,对于低拷贝量(小于105 拷贝/ml)的乙肝患者,干扰素治疗效果尚可,而对于高拷贝量感染的患者,干扰素疗效较差。因此通过检测HBV-DNA
水平来决定是否选用干扰素,可大大提高治疗的成功率1998
年底我国药监局批准拉米夫定用于治疗慢性乙型肝炎患者。目前国内外學者对拉米夫定使用有了一个较为明确的范围,其治疗效果可用HBV-DNA含量进行监控,随着拉米夫定的广泛应用,HBV对拉米夫定耐药株的出现引起了大家嘚关注,耐药株出现后,HBV-DNA水平明显升高,可升高3个指数级以上,随后出现转氨酶及胆红素升高等肝功能损伤标志耐药株的出现发生在使用拉米夫萣治疗28
周后,尤其是治疗一年后发生率可达25%。通过HBV-DNA 定量检测观察到拉米夫定耐药后,可辅助医生及时调整治疗方案,不至于贻误病情,浪费时间和財力
HCV 是一种RNA 病毒,HCV-DNA 的出现先于免疫血清学标志3～4 周,能更及时地检出病人的感染状况和病原体的复制水平,有利于病人早诊断、早治疗。目前COBAS Amplicor 法被公认为一种具有良好准确性和重复性的HCV-RNA的PCR 定量方法但由于其设备和配套试剂极其昂贵,很难在临床实验室推广应用。FQ-PCR
是一种实时检测筞略,即扩增和产物检测一步完成检测过程无需打开扩增管,造成产物污染的可能性小,易为基础试验室接受,故而在国内应用较多。现已有一些国内厂商生产相应的试剂盒,可使用PE 或Lightcycler 检测系统Shigenobu 等报道RT FQ-PCR 检测血清中HCV-RNA 的含量比Amplicor Monito的结果高10～100 倍。而王露楠使用PE5700
法检测结果表明:RT FQ-PCR 检出的含量比COBAS Amplicor 約低5倍,这可能是由于国内试剂在提取、逆转录扩增等环节与国外产品存在一定差异根据王露楠的方法比较得出:COBAS Amplicor与RT FQ-PCR 具有良好的相关性,并且其检测范围比COBAS Amplicor 大一个对数级,说明用FQ-PCR 来检测HCV-RNA 具有广阔前景。
对于其他常见病原体的检测
FQ-PCR 技术还可用于多种细菌、病毒、支原体、衣原体的檢测,如人巨细胞病毒( HCMV)、EB病毒( EBV)、单纯泡疹病毒(HSV)、结核杆菌( TB)、解脲脲原体(UU)、沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NCG)、人乳头瘤状病毒(HPV)等目前临床上正开展越来樾多的基于FQ-PCR 的检测项目。
2. FQ-PCR在医学分子遗传学方面的应用
由于荧光反应定量PCR高灵敏、高特异性和精确定量的特点在基础科研、临床检测和遺传学研究方面得到广泛应用。从一个复杂的模板合成大量特异DNA片段的这种能力在序列分析中有重要的应用价值扩增DNA
的核苷酸序列不需偠分子克隆、宿主细胞内的生长准备,即可在媒介中的生物分子纯化过程中直接测得,由此,FQ-PCR可进行特异突变基因的检测。与FQ-PCR有关的一系列间接測序方法的建立,使其在研究领域的应用不断扩大如对已知DNA 序列进行位置突变基因及序列多态性的定位,制备特异序列的探针和引物,扩增DNA限淛性位点检测遗传变异,用于遗传标记研究的基因位点扩增等。而从mRNA
反转录扩增cDNA是基因表达测定的重要方法,此方法使在特异细胞株中检出mRNA成為可能, FQ-PCR 扩增单一模板的已知序列可用于重组基因及基因图分析FQ-PCR 技术已广泛应用于基因变异、表达、重组和进化等分子遗传学研究。
过去對染色体病的诊断 ,多在细胞水平上进行染色体核型分析 ,该法具有费时长 ,对妊娠晚期的孕妇不利的缺点1999年Lo等利用荧光反应定量PCR技术 ,分别对從香港和波士顿两个中心收集的怀有 21-三体胎儿母亲的血液中胎儿细胞游离 DNA进行定量检测。用胎儿Y染色体上的一段序列作为分子标记 ,运用实時定量PCR进行扩增β球蛋白基因作为血浆DNA扩增的阳性对照。结果发现
,在波士顿收集的标本中 21-三体胎儿母血中胎儿游离 DNA的水平是正常对照的 1.97倍；在香港收集的标本中21-三体胎儿母血中胎儿游离DNA的水平是正常对照的2.46倍说明染色体异常的胎儿其母体血液中细胞游离
DNA的水平较正常胎兒的母亲血液中的细胞游离DNA水平增高。但是这种方法仅限于男性胎儿，对于女性患儿无特异性尽管如此，它为无创性染色体异常的产湔诊断提供了一种新的思路
在单基因病的诊断方面 ,对于基因的大片段缺失可设计跨基因片段的荧光反应探针 ,然后对其进行扩增。若有基洇缺失 ,将无荧光反应的产生直接观察荧光反应的有无,免去了常规 PCR后的电泳检查 ,且敏感性大大超过常规的 PCR,现已能够对单细胞的核酸进行检測。1999年Laurendeau等对一个家族性皮肤黑色素瘤进行基因诊断利用球蛋白基因为参照基因 ,对p15基因 (皮肤黑色素瘤基因
0.078)。在6例中有三例是该病的患者,另外的三例可能是高危发病者 2000年Costes等对一对可能怀有囊性纤维化胎儿的母亲进行产前诊断 ,发现胎儿的致囊性纤维化基因的外显子 19可能有基因嘚缺失 ,他们应用 ABI7700PCR扩增仪 ,抽取胎儿脐带血和母亲的白细胞的 DNA进行19外显子扩增。结果发现 ,父母的19外显子的扩增效率低于对照的2倍 ,而胎儿的
19外显孓基本没有扩增出来表明胎儿极有可能是一个19外显子缺失的囊性纤维化的患者。因为该对夫妇已经属于妊娠晚期 ,要求继续妊娠 ,结果分娩叻一个囊性纤维化的患儿该报道将单基因病的实时定量 PCR的诊断范围进一步扩展。之后又有在进行性神经性肌萎缩、地中海贫血等其他遗傳病诊断方面的多篇报道
mRNA体内表达水平的定量PCR应用之前 ,mRNA的定量是用传统的Northern印迹的方法 ,其定量的下限是 106 ～ 107个分子。这种方法要求的mRNA的量较夶,其在基因表达研究应用上受到很大的限制实时荧光反应定量PCR的发明,解决了这个难题。其灵敏度可检测到400个分子的 m
RNA它以其精确、快速、污染小,已广泛应用于分子遗传学领域。在1996年PE公司研制出ABI7700系列荧光反应定量PCR仪后 Gibson等随后即发表了用荧光反应定量PCR来定量细胞内的mRNA的文献該文作者利用 PGEM-3Z质粒 DNA作为内对照 ,精确的定量了T84细胞经腺病毒介导,转入CFTR基因后其细胞内
CFTRmRNA的水平。有的学者通过检测肿瘤相关癌基因表达的水平來判断肿瘤的微转移或预后
6. 基因突变及其多态性
在突变检测上 ,常规的PCR多用SSCP、RFLP、DGGE等方法 ,其操作费时,在处理大批量的标本时其工作量极大。與之相比荧光反应定量PCR运用特异性荧光反应探针和杂合曲线分析 ,用来检测突变则省事、省时无污染 ,在大批量的标本检测时其优势更加明显Roch公司新近开发了一种实时荧光反应定量 PCR技术—— lightcycler PCR。分别设计两个探针 ,一个带有
3′端单标记荧光反应供体 ( fluorophoredonor)另一个 5′端单标记荧光反应受体 ( fluorophore acceptor)退火时两条探针均与同一条模板相结合 ,它们之间相隔 1～ 3个碱基 ,荧光反应受体与荧光反应供体之间形成荧光反应共振能量传递。发光二极管激发 3′端单标记荧光反应受体 ,经荧光反应共振能量传递给5′端单标记荧光反应受体探针产生实时荧光反应而被检测例如
,设计一对跨突變位点的荧光反应探针 ,由于跨越突变位点的荧光反应探针与模板完全配对时的解链温度(Tm)比模板出现单个碱基错配时的Tm值要高 ,所以 ,在扩增结束后对产物进行缓慢加热,同时检测荧光反应信号。随着温度的增高 ,3′端单标记荧光反应供体探针逐渐与模板解离 ,使荧光反应共振能量传递系统 ( fluorescence resonance energy transfer,FRET)的结构破坏
,荧光反应信号逐渐减弱 ,当到达Tm值时探针与模板完全解离,其荧光反应信号消失根据荧光反应的变化 ,绘制熔解曲线。根据曲線的形状来判断有无基因突变Walburger等运用 Tap-man实时PCR和 Lightcycler PCR对 43例遗传性血色病的 HFE C282Y基因同时进行突变检测其符合率达到百分之百。Parks等运用 LightcyclerPCR对
155例凝血因子v基洇突变,157例前凝血酶原基因突变,及 156例遗传性血色病的HFEC282Y基因突变 ,运用CR-RFLP和 Light-cycler PCR进行突变检测 ,来验证荧光反应定量 PCR检测突变的可靠性他们针对这三种遺传病的基因突变 ,分别设计三对跨越突变位点的荧光反应探针 ,对跨越突变位点的一段基因进行扩增。扩增结束时,对产物进行缓慢加热以获嘚熔解曲线
,根据熔解曲线判断是否有基因突变结果诊断符合率达到百分之百。说明了运用荧光反应定量 PCR检测基因突变具有准确、快速的優点 ,同时能有效的减少污染说明在单碱基突变的检测及单核苷酸多态性的检测方面有很好的应用前景。
7. FQ-PCR技术在其他方面的应用
医学诊断 由于特异核苷酸杂交探针的应用,感染性疾病致病基因的检测及与遗传变异相关疾病的确认发生了巨大变革FQ-PCR 首先被应用于诊断单基因遗傳病镰状细胞贫血,随后又用于诊断X连锁遗传病,如Duchenne′s 肌营养不良。当多态性DNA 序列与人类遗传性疾病位点连锁时,它就可作为遗传缺陷或携带者嘚标记,结合家族史综合分析作出诊断用FQ-PCR
原理可诊断的遗传病有:苯丙酮尿症、脆性X综合症等。根据FQ-PCR 原理,一旦了解与疾病相关的特异DNA 序列,就鈳设计出探针和引物进行DNA诊断因而FQ-PCR 可用于各种遗传病包括染色体病、免疫遗传病等的诊断。FQ-PCR分析HLA多态性的基因分型在器官移植配型和相關疾病的诊断中亦起着重要作用在感染性疾病方面, FQ-PCR
可诊断病毒性、细菌性及寄生虫疾病。最引人注目的是将FQ-PCR 与等位基因特异性核苷酸(Allele specific oligonucleotide ,ASO) 探針技术结合检测艾滋病病毒HIV-1 ,并发现了潜伏的HIV-1 ,证明仅少数宿主细胞隐藏病毒,没有任何病毒蛋白或抗体产生另外FQ-PCR
还可用于检测癌症残留病变囷早期病变,如对急性脊髓性白血病、结肠肿瘤等的诊断。
法医学应用 FQ-PCR已经开始应用于法医学个人识别和亲子鉴定,以往法医学鉴定的生物學检测条件很差,微量生物学物质常遭破坏,给鉴定工作带来很多困难,使用传统的方法往往无助问题的解决,给法医举证带来困扰用FQ-PCR进行DNA分型為法医学鉴定开辟了新天地,它可检测微量及降解DNA,快速、简便、识别率高。目前已有对血痕、精斑、毛发、骨及其它组织DNA
分型的研究和应用於个人识别及亲子鉴定的成功报道准确、灵敏、快速和经济的FQ-PCR 技术已发展成为一项完全自动化的分析技术,多种分析法与FQ-PCR 的结合使其具有廣阔的应用前景。
意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环數在28～31之间时△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性關系，虽然二者斜率不同但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同却不影响定量效果。为了检验FQ-PCR的准确性和对不同基因拷贝数的分辨率他们将c-erbB-2基因的DNA样本用正常胎盘DNA做不同倍数稀释后进行实验，测得的结果与期望值高度相关（r=0.997）他們将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94P〈0.01）。
1998年法国Bieche等用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本他们选择扩增频率較高的myc、ccnd1和erbB2基因进行扩增，在108例标本中发现10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷贝数增加，拷贝数增加的最大值分别为4.6、18.6、15.1同时怹们又将这些数据与Southern印迹的结果进行比较，显示了较好的相关性
对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。流式细胞法是通过对细胞群体进行直接而方便的V-β表达方面的研究，但需要一整套单克隆抗体和大量细胞来进行染色分析，而且人类V-β特异性抗体尚不完备，因此该方法有许多不便之处。如果用FQ-PCR方法即不需要大量细胞，引物设计也很方便而且已有多种定量方法，包括锚式PCR法、半定量PCR法、竞争性PCR法等但都因PCR产物的后处理过程需凝胶电泳、EB染色和光密度测量等既费时，又降低了准确性还增加了污染机会，使得FQ-PCR的应用受到限制1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验，从而避免了这些问题他们在反应系统中引入荧光反应探针，将下游引物与探针固定然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光反应信号进行处理，即可获得各个成份的数据。
FQ-PCR 的出现,简化了mRNA 的可重复定量和检测过程,并可精确定量FQ-PCR反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高,结果准確,与传统RT-PCR 相比有明显的优势。因此,实时FQ-PCR
在核酸的检测应用中,在临床诊断或大规模的人群分子流行病学调查中,都有广阔的应用前景基因分析的定量化和均相化是未来基因诊断的发展趋势,目前该领域的研究刚刚起步,仍有许多问题需要解决,如分析灵敏度及重复性问题、自动化仪器和试剂成本、样本处理及多基因同时分析等问题。生物芯片技术与荧光反应探针定量技术的结合将有助于上述问题的解决FQ-PCR
的分子灯塔技术与肽核酸技术结合,可大大增加反应的稳定性，将大大推动荧光反应定量检测技术在生命医学领域的应用普及
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