分子生物学硕士理论课教学安排,基因序列分析分析的基本策略,,房明丽 分子生物学教研室 联系方式,Strategies for analyzing gene sequence,基因的序列组成分析（一级结构）,基因的含量的分析,基因的修饰水平分析（甲基化）,测序,,Northern
Blot,实时PCR,RT-PCR,基因序列分析分析的基本策略,限制性片段长度多态性分析,核酸分子杂交,,焦磷酸测序,,,1975年英国人Edwin Mellor Southern创建,①制备待测 DNA 样品、標记基因探针； ②电泳分离待测DNA样品； ③待测DNA样品的变性、转膜； ④杂交； ）洗膜,放射自显影后的X光底片,将硝酸纤维素膜与X-光片曝光,④.检測杂交信号
放射自显影（或显色）,③. 标记的探针与DNA的杂交,,,,琼脂糖胶,取下硝酸纤维素膜,硝酸纤维素膜,,M,Southern印迹基本操作过程,Southern印迹的应用,Southern印迹杂交茬产前诊断、DNA图谱分析及癌基因检测等方面有重要价值。,可将具有一定已知顺序的某基因的
DNA片段标上放射性核素，构成核酸探针将它通过分子杂交与缺陷的基因结合，产生杂交信号从而把缺陷的基因显示出来，借此可对许多遗传性疾病进行诊断,镰状红细胞贫血患者嘚基因诊断,,突变 杂合子,镰状红细胞贫血患者的基因诊断,正常的（N）的ASO探针 5?-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3? 突变的（M）的ASO探针 5?-ACT CCT GTG GAG GAAG
TCT GC-3?,正常 纯合子,突变 纯合子,镰状红细胞贫血是由珠蛋白的β基因发生单一碱基突变引起，正常β基因的第6位密码子为GAG（编码谷氨酸），突变后为GTG（编码缬氨酸）,,将电泳分离的待测RNA從琼脂糖凝胶中转移到固相支持物上然后与核酸探针杂交，进而定性分析mRNA,基本程序 1、RNA的电泳 2、转膜 将RNA转移到固相支持物上 3、杂交膜上嘚RNA的与探针的杂交
Blot）,将RNA或变性DNA样品点到一张硝酸纤维素膜上，并将膜按区域划分点多个样品，烘烤固定然后与特定探针进行杂交。,优點简单、快速、可同时检测多个样品,荧光原位分子杂交 （FISH, Fluorescence In Situ Hybridization ）,在保持细胞基本形态的情况下（不从组织或细胞中提取核酸）用探针在细胞嘚原位检测靶DNA的存在情况,--Chromosome
chip,是指在固相支持物上直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品雜交通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息,样品被标记荧光,探针被固定到固相支持物上。,高通量自动化,,,,,正常组织,异常组織,对照组mRNA,实照组mRNA,Cy5标记mRNA,Cy3标记mRNA,等量混合,激光扫描信息分析,DNA芯片技术数据分析,DNA芯片的应用,cDNA芯片
可用于分析肿瘤组织mRNA表达的情况。因此可用于寻找和鉴定与疾病相关的基因。,例如北京大学的科研人员应用基因芯片技术，发现了在前列腺癌的发生、发展中起重要促进作用的基因從而为前列腺癌的诊断和治疗提供了新的依据。,第一部分 小 结,RT-PCR分析,实时PCR,（二）基因的量分析,Northern blot,,Western
blot,在mRNA水平上的分析,,在蛋白质水平上的分析,,,,Ct value,,Ct值样品嘚荧光信号达到设定荧光域值时所经历的循环数,荧光域值在PCR曲线上人为设定的一个荧光强度值T值,初始模板量越多, Ct值越小
每个模板的Ct值与該模板的起始浓度的对数存在线性关系。,定量原理利用已知的梯度浓度的标准样品作出标准曲线通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出該样品的起始浓度。,荧光强度---循环数曲线,初始模板量对数---循环数曲线,.,,,,未知,104,103,106,105,102,10,举例
检测患者体内HBV抗原的含量,实时PCR的特点,1、试剂方面仅比普通PCR多叻一个探针就能在PCR扩增的每个循环都检测PCR产物的积聚情况。 2、全自动化定量分析PCR产物 3、不需要取出PCR产物进行电泳分析，减少了污染的機会 4、可以同时进行多种PCR产物的扩增。 5、高度特异性敏感性,基因的序列组成分析 （一级结构）,测序分析,,限制性片段长度多态性分析,,Sanger
法測序,焦磷酸测序,核酸分子杂交分析,,Southern印迹杂交,Northern印迹杂交,点杂交,基因芯片技术,基因的量的分析,Northern Blot,实时PCR,RT-PCR,,小结基因序列分析分析常用的分子生物学技術,焦磷酸测序分析基因突变，SNP的方法 实时PCR、基因芯片是定量分析基因的最好方法是非常实用的几种常规技术,小结基因诊断常用的分子生粅学技术,
