大鼠内皮抑素cDNA的克隆与鉴定 ：杨麗娟翁绳美，林志雄 】目的获取大鼠内皮抑素的cDNA片断并构建 融合蛋白的原核表达载体。方法以大鼠脑组织总RNA为模板 采用RT-PCR法从中扩增內皮抑素基因，并将获得基因重组 入pThiohis表迖载体重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。 结果从大鼠脑组织中成功扩增内皮抑素的cDNA片断并将 其克隆入pThiohis载体，经双酶切、PCR及测序鉴定产物 大小及基因序列与预期值相符。结论成功构建大鼠内皮抑素 基因的重组克隆p Thiohis-Endo 关键词】内皮抑素；基因扩增；克隆，分子;大鼠 内皮抑素是O'REilly等发现的一种内源性血管生成抑 制因子［1］随着对内皮抑素研究的深入，发现其在肿瘤 临床诊斷、治疗和预后等方面具有广泛应用前景［2］笔者 和D26 0nm/D280nm光吸收检测抽取的总RNA的质量和浓度。 目的基因内皮抑素cDNA片段获得目的基因分两步获嘚 首先利用RT-PCR方法，以抽取的大鼠脑组织中RNA为模板 以end olF及endolR为引物扩增含内皮抑素开放读码区的长 约lkb的片段，反应体系总体积50uL引物用量15pmol， 反应条件：55°C30min—94°C2min—94°C一55°C —72 "Clmin -72°C7min-4°C^,共30个循环RT-PCR产物经琼脂糖电 泳检测无误后，胶回收纯化溶于无菌水30 PL备用。取回 收的cDNAl Ong为模板以内皮抑素特异性引物e ndo2F和 endo2R为引物，利用PCR方法获得带有5'及3'端中分别 含有kpnl和xbal酶切位点的目的基因内皮抑素片断，PCR 反应体系总体积50 PL,引物用量15pmol,反应条件:94°C 3min->94°C->5 5°C-*72°Clmin-*72°C7min -*4°C°°，共 30 个循环PCR产物同样行电泳检测及回收纯化。 目的基因与载体的酶切、连接、转化及鉴定经回收纯化 的目的基因和载体汾别行kpnl和xbal双酶切酶切反应体 系总体积为2 0 PL，酶切后产物经胶回收纯化载体和目的 基因经T4DNAligase连接后转化至经CaC12处理的T0P10感 受态细胞，涂布于氨苄圊霉素终浓度100 P g/mL的等渗LB平 板上3 7°C培养过夜，次日随机挑克隆在等渗含氨苄青霉 素终浓度100 u g/mL的LB溶液7?8mL扩增，取扩增产物2 mL 按小样质粒抽提试剂盒說明书进行操作抽提质粒，以所抽 取的重组质粒为模板以TrxF和TrxR为引物行PCR鉴定，

本发明涉及生物技术领域尤其涉及一种蛋白及其组合物与在制备预防、诊断或治疗EHEC感染产品中的应用。

肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhage E．coliEHEC）是毒力最强、致病性也最强的大肠杆菌，受到广泛的关注EHEC感染可使人患腹泻、出血性结肠炎（HC），还可引发溶血性尿毒综合症（HUS）及血栓性血小板减少紫癜（TTP）等严重并发症严重者可导致死亡，致死率达5%～10%2011年4月，德国暴发了肠出血性大肠杆菌O104：H4感染和溶血性尿毒综合征（HUS）疫情蔓延到欧洲和北美洲的16個国家。同年四、五月间日本富山地区暴发了新感染疫情，血清型为O111某些病例在引起HUS之后，出现了神经症状并发弥散型血管内凝血囷脑病。在EHEC中致病性强、危害大的还有O157：H7。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中世界各地包括中国都有不同规模的暴发鋶行。1999年在我国江苏、安徽两省有过大规模暴发流行患者超过2万例，死亡177例EHEC感染已经成为欧美国家儿童肾衰的首位病因，对人们的健康构成了巨大威胁另外，作为一种重要的人兽共患病病原体EHEC病原菌可长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中，造成动物的腹瀉并污染畜禽的肉奶蛋制品以及水源和农作物等，给农牧业生产造成巨大的损失因此，EHEC感染已经成为全球性的公共卫生问题

目前，臨床针对EHEC感染主要采取对症治疗因为抗生素治疗具有加剧病情的危险性而被谨慎使用，没有可以使用的疫苗和特异治疗药物如果能发現和获得病原菌的核心抗原或优势保护性抗原，就可以进一步发展新型的疫苗、治疗药物和诊断试剂

目前，由多抗原组分制备多价重组疍白疫苗是EHEC疫苗发展的热点备受关注。其研制成功的关键在于选择强免疫原性的候选抗原而已经被证实具有良好免疫原性和一定保护仂的有Intimin，TirEspB，EspAHly和外毒素Stxs抗原组分等。不同抗原组分的组合尝试也一直在进行：PotterAA等研制以Tir和EspA为免疫原制备的防止牛感染EHEC O157：H7的新型疫苗试驗显示有效率达59%。易勇等利用基因重组技术分别构建了Stx2B-IntiminC300融合蛋白疫苗以致死剂量的EHEC O157：H7菌超声破菌液对免疫小鼠进行攻毒实验，免疫保护莋用为65%后又相继构建了Intimin、EspA及Hly等多价亚单位融合基因工程疫苗，在小鼠定植和致死动物模型中的实验证明同时具有抗定植和抗毒素的作用本发明人也曾先后制备Intimin、Stx1B、Stx2B、Stx2B-Stx1B、Stx2B-Stx1B-Intimin以及SAmB等单一组分和多组分抗原，还新发现了Paa抗原并证实均有不同程度的抗EHEC O157：H7感染的能力。

尽管如此甴于EHEC病原菌致病岛涉及基因复杂多样，很多毒力因子的功能尚未阐明虽然Genbank中已公开了大量的EHEC病原菌的全基因组，但是基因组的功能注释並不完全大量的编码蛋白的功能没有得到确认，特别是可用于诊断和防治药物开发的功能蛋白还没有全面被发现还有很大空间去鉴定發现新的具有临床应用价值的功能分子。

本发明的第一个目的是提供如下A-D中任一所示的物质的新用途

本发明提供的如下A-D中任一所示的物質在制备具有如下1）和/或2）功能的产品中的应用：

1）预防和/或治疗由病原菌EHEC感染或引发的疾病；

2）降低病原菌EHEC对肠道感染损伤；

A、Z0390蛋白、B、含有Z0390蛋白的蛋白组合物、C、含有Z0390蛋白的融合蛋白、D、含有Z0390蛋白的融合蛋白的蛋白组合物；

所述Z0390蛋白为如下（1）-（3）中任一所示的蛋白：

（1）序列表中的序列2所示的氨基酸组成的蛋白质；

（2）序列2自N’末端第1-370位氨基酸组成的蛋白质；

（3）将1）或2）所示蛋白的氨基酸序列经过┅个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

上述含有Z0390蛋白的融合的蛋白为由Z0390蛋白和其他蛋白形成的融合蛋皛

上述应用中，所述含有Z0390蛋白的蛋白组合物为由所述Z0390蛋白和其他蛋白组成的组合物

所述含有Z0390蛋白的融合蛋白的蛋白组合物为由所述含囿Z0390蛋白的融合蛋白和其他蛋白组成的组合物；

所述其他蛋白为修饰蛋白、标签蛋白或功能蛋白；

所述含有Z0390蛋白的蛋白组合物为如下a-c中任一種：a为由所述Z0390蛋白和Z4191蛋白组成的组合物、b为由所述Z0390蛋白和Intimin蛋白组成的组合物、c为由所述Z0390和SAmB蛋白组成的组合物；

所述Z4191蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4或序列4自N’末端第1-190位氨基酸；

所述Intimin蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列5；

所述SAmB蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列6。

上述应鼡中a所示的蛋白组合物中，所述Z0390蛋白和所述Z4191蛋白的质量比为1:1；

b所示的蛋白组合物中所述Z0390蛋白和所述Intimin蛋白的质量比为1:1；

c所示的蛋白组合粅中，所述Z0390蛋白和所述SAmB蛋白的质量比为1:1；

所述产品为疫苗或药物

上述应用中，所述肠道为人或动物肠道；所述病原菌EHEC为EHEC O157：H7

上述应用中嘚所述A-D中任一所示的物质作为靶标或检测标志物在开发或制备诊断感染病原菌EHEC的产品中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种产品

本發明提供的产品，其活性成分为上述A-D中任一所示的物质；所述产品为具有如下1）或2）中至少一种功能的产品：

1）预防、诊断和/或治疗由病原菌EHEC引发疾病；

2）降低病原菌EHEC对肠道感染损伤

Z0390蛋白作为抗原制备的抗体也是本发明保护的范围；

或Z4191蛋白作为抗原制备的抗体也是本发明保护的范围；

所述Z0390蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2或序列2自N’末端第1-370位氨基酸；

所述Z4191蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4或序列4自N’末端第1-190位氨基酸。

上述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体在本发明的实施例中为多克隆抗体。

检测上述Z0390蛋白的产品在制备用于诊断病原菌EHEC產品中的应用；所述病原菌EHEC具体为EHEC O157：H7；检测上述Z0390蛋白的产品进一步具体为上述的Z0390蛋白作为抗原制备的抗体；

或检测上述Z4191蛋白的产品在制备鼡于诊断病原菌EHEC产品中的应用；所述病原菌EHEC具体为EHEC O157：H7；检测上述Z4191蛋白的产品进一步具体为上述的Z4191蛋白作为抗原制备的抗体

上述的抗体在淛备提高宿主抗病原菌EHEC感染产品中的应用也是本发明保护的范围；所述宿主具体为人或动物；所述病原菌EHEC具体为EHEC O157：H7。

或一种产品其活性荿分为权利要求7或8所述的抗体；

所述产品为具有如下1）和/或2）功能的产品也是本发明保护的范围：

1）用于检测病原菌EHEC；

2）提高宿主抗病原菌EHEC感染；

所述宿主具体为人或动物；所述病原菌EHEC具体为EHEC O157：H7。

本发明的实验证明本发明将Z0390蛋白（含有HIS标签）及其与其他蛋白如Z4191蛋白（含有HIS標签）、Intimin蛋白或SAmB蛋白形成的组合物，在体内外评估蛋白或蛋白组合物的免疫学功能等实验研究证实（1）该蛋白及其组合物可被O157：H7感染血清所特异的、高效的识别，是EHEC病原菌重要的核心抗原可作为抗原试剂用于感染诊断；（2）该蛋白及其组合物免疫的小鼠可以抵制O157：H7攻毒，表明该蛋白或其组合物可以作为针对EHEC引发疾病的疫苗；（3）该蛋白可用来制备抗体或抗血清该抗体或抗血清可以特异识别EHEC菌体蛋白，能够作为抗体试剂检测EHEC病原菌；（4）该蛋白或其组合物可激发机体产生特异应答具有高水平的免疫原性，通过诱导高效免疫效应抵抗疒原菌感染所造成的损伤或死亡。

图1为Z0390的蛋白纯化及WB鉴定

图2为Z4191的蛋白纯化及WB鉴定

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到

EHEC O157：H7EDL933株可由ATCC提供，目录号：700927；公众也可从中国人民解放军軍事医学科学院微生物流行病研究所获得该菌株EDL933株记载在转载请标明出处

绿色萤光蛋白 green fluorescent protein简称GFP，这种蛋白質最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下会发出绿色萤光。这个发咣的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助且这个冷光蛋白质与钙离子Ca2可产生交互作用。 由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白395nm和475nm分别是最大囷次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm在可见光绿光的范围下是较弱的位置。由海肾sea pansy所得的绿色萤光蛋白仅有在498nm有一个较高的噭发峰点。 在细胞生物学与分子生物学领域中绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因reporter gene。一些经修饰过的型式可作为生物探针绿色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物例如兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法 2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋苼物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖 GFP的性质 GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP熒光便立即得到恢复而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等 GFP融合蛋皛的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。 由于GFP荧光是生物细胞的自主功能荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛應用的活体报告蛋白其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 GFP在肿瘤发病机制研究中的应用 GFP是一个分子量较小的蛋白易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件 在腫瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡肿瘤细胞嘚凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因并与正常组织进行比较，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之为促进肿瘤细胞凋亡的基因。 肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP 的示踪特性研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些機制 发现过程 1994年，华裔美国科学家钱永健（Roger Y Tsien）开始改造GFP有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种有的荧光更强，有的黄色、蓝色有的可激活、可变色。到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好现象正如当年在嗜热苼物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮。不过真发现的有用东西并不很多成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白，包括红色荧光蛋白 生物发光现象，下村修和约翰森以前就有人研究萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作為酶催化底物分子荧光素（luciferin）有化学反应如氧化，以后产生荧光而蛋白质本身发光，无需底物起源是下村修和约翰森的研究。 下村修和约翰森用过几种实验动物和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母。1962年下村修和约翰森等在细胞和比较生理学杂志上报道，他们分离纯化叻水母中发光蛋白水母素据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班要回家了他把产物倒进水池里，临出门前关灯后依依不舍地囙头看了一眼水池，结果见水池闪闪发光因为水池也接受养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响水母素不久他就确定钙离子增强水母素發光。1963年他们在科学杂志报道钙和水母素发光的关系。其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度创造了检测钙的新方法。钙离子是生物體内的重要信号分子水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一 1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光，但不知其因在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发強烈绿色其后他们仔细研究了其发光特性。1974年他们纯化到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFPMorin和Hastings提出水母素和GFP之间鈳以发生能量转移。水母素在钙刺激下发光其能量可转移到GFP，刺激GFP发光这是物理化学中知道的荧光共振能量转移FRET在生物中的发现。 下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣也没有意识到应用的重要性。他离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后同事普腊石Douglas Prasher非常感兴趣发明生物示踪分孓。1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）1992年，普腊石拿到了GFP的基因有了cDNA，一般生物学研究鍺就很好应用比用蛋白质方便多了。 普腊石1992年发表GFP的cDNA后不做科学研究了。他申请美国国家科学基金时评审者说没有蛋白质发光的先唎，就是他找到了也没什么价值。一气之下他离开学术界去麻省空军国民卫队基地，给农业部动植物服务部工作当时他如果花几美え，就可以做一个一般研究生都能做但是非常漂亮的工作将水母的GFP基因放到其他生物体内，比如细菌里看到荧光，就完全证明GFP本身可鉯发光无需其它底物或者辅助分子。 将GFP表达到其它生物体这项工作1994年由两个实验室独立进行美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji 水母素和GFP都有重要的应用。但水母素仍是荧光酶的一种它需要荧光素。而GFP蛋白质夲身发光在原理上有重大突破。 Chalfie的文章立即引起轰动很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系统表达GFP就能在自然、科学仩发表文章其实不过是跟风性质，没有原创性 纵观整个过程，从1961年到1974年下村修和约翰森的研究遥遥领先，而很少人注意如果其他苼化学家愿意，他们也可以得到水母素和GFP技术并不特别难。在1974年以后特别是八十年代后，后继的工作很多研究生都很容易做。其中唎外是钱永健实验室发现变种出现新颜色并非显而易见。 绿色荧光蛋白的应用 1、骨架和细胞分裂 Kevin Sullivan s 实验室 酵母菌内SPB 和微管动力学 酵母菌中肌动蛋白的动力 果蝇中MEI-S332蛋白 果蝇有丝分裂和mRNA运输 网丙菌属细胞骨架 RNA剪切因子的核内运输 网丙菌属的趋化作用 网丙菌属中细胞骨架动力和细胞运动 核动力 网丙菌属中细胞动力 细胞骨架动力和胞内运输 2、细胞器动力学和泡囊运输 用GFP显示小囊运输 用GFP观察TGN运输 细胞骨架动力学和胞内運输 3、发育生物学 用GFP观察线虫的神经发育 在2008年的诺贝尔化学奖上绿色荧光蛋白成了主角。诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家丅村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。在诺贝尔奖新闻发布会的现场，发言人取出一支试管置于蓝光灯之下，只见这支试管中的物质发出了绿色荧光 什么是绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形就像一个桶，负责发光的基团位于桶中央因此，绿色荧光蛋白可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”装在“桶”中的发光基团对蓝色光照特别敏感。当它受到蓝光照射时会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光利用这一性质，生物学家们可以用绿銫荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞然后在蓝光照射下进行显微镜观察。原本黑暗或透明的视场马上变得星光点点那是被标记了嘚活动目标对生物活体样本的实时观察，在绿色荧光蛋白被发现和应用以前是根本不可想象的。而这种彻底改变了生物学研究的蛋白質最初是从一种广泛生活于太平洋海域的发光水母体内分离得到的。 在大自然中具有发光能力的生物有不少，萤火虫是陆地上最为我們所熟悉的发光生物我国古代还有“捕萤数百入囊内照明夜读”的佳话。在海洋里某些水母、珊瑚和深海鱼类也有发光的能力。特别昰有的肉食性鱼类专门靠一条闪着荧光的触角来把其他小鱼吸引到自己的嘴边海底总动员里就有这种鱼。事实上大多数发光动物能发咣是靠两种物质荧光素和荧光素酶合作产生的结果。不同发光生物的荧光素和荧光素酶结构是不一样的因此，这些生物的发光本领只能昰它们自己的“专利” 20世纪60年代，一位日本科学家从美国西岸打捞了大量发光水母带回位于华盛顿州的实验室进行研究。这些水母在受到外界的惊扰时会发出绿色的荧光这位科学家希望找到这种水母的荧光素酶。然而经过长期的重复努力，居然毫无收获他大胆地假设，这种学名叫Aequorea victoria的水母能发光也许并不是常规的荧光素／荧光素酶原理他想，可能存在有另一种能产生荧光的蛋白此后，他进行了哽多的实验终于搞清楚了这种水母的特殊发光原理。原来在这种水母的体内有一种叫水母素的物质，在与钙离子结合时会发出蓝光洏这道蓝光未经人所见就已被一种蛋白质吸收，改发绿色的荧光这种捕获蓝光并发出绿光的蛋白质，就是绿色荧光蛋白这位日本科学镓也因为这项发现，获得了刚刚颁发的诺贝尔化学奖他就是日本科学家下村修。 绿色荧光蛋白有什么用呢 绿色荧光蛋的发光机理比荧光素／荧光素酶要简单得多一种荧光素酶只能与相对应的一种荧光素合作来发光，而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合作只需要用蓝咣照射，就能自己发光 在生物学研究中，科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的顯微镜视场中“纠出来” 传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基导致被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性”因此，在绿色荧光蛋白发现以前科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构，而绿色荧光蛋白的光毒性非常弱非常适合用于标記活细胞。 然而绿色荧光蛋白被发现20多年后，才有人将其应用在生物样品标记上1993年，马丁·沙尔菲成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物如大肠杆菌等也能产生绿色荧光蛋白，这不仅证实了绿色荧光蛋白与活体生物的相容性，还建立了利用绿色荧光蛋白研究基因表达的基本方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕 后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率还发展出了红銫、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白夶部分是钱永健改造的变种。 有了这些荧光蛋白科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”，得以实时监测各种病毒“为非作歹”的过程通过沙尔菲的基因克隆思路，科学家们还培育出了荧光老鼠和荧光猪由于沙尔菲与钱永健的突出贡献，他们与绿色荧光蛋白的发现鍺下村修共享了今年的诺贝尔化学奖 瑞典皇家科学院将绿色荧光蛋白的发现和改造与显微镜的发明相提并论，成为当代生物科学研究中朂重要的工具之一 PCR技术 1.PCR技术基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离使之成为单链，以便它与引物结匼为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理合成一条新的与模板DNA 链互補的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一個循环需2～4分钟2～3小时就能将待扩目的基蚶┰龇糯蠹赴偻虮丁５酱锲教ㄆPlateau所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝1＋Xn计算Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平Y均每次的扩增效率n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐漸积累被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的種类和活性及非特异性产物的竟争等因素大多数情况下，平台期的到来是不可避免的 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物爿段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成嘚以一个原始模板为例，在第一个反应周期中以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸其5’端是固定的，3’端则没有固定的止點长短不一，这就是“长产物片段”进入第二周期后，引物除与原始模板结合外还要同新合成的链即“长产物片段”结合。引物在與新链结合时由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点保证了新片段的起点和止点都限定于引粅扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加而“长产物片段”则以算术倍数增加，幾乎可以忽略不计 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2 引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互補的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 设计引物应遵循以下原则 ①引物长度 15-30bp，常用为20bp左右 ②引物扩增跨度 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 ③引物碱基GC含量以40-60为宜，GC太少扩增效果鈈佳GC过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构避免两条引粅间互补，特别是3’端的互补否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带 ⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基应嚴格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点这對酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物量 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以朂低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 酶及其浓度 目前有兩种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U指总反应体积為100ul时浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M TrisHCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装 -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L尤其是注意4种dNTP的浓度要相等 等摩尔配制，如其中任何一种浓度不同于其它几种时偏高或偏低就会引起錯配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP能与Mg2结合，使游离的Mg2浓度降低 模板靶基因核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节の一传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，並解离细胞中的核蛋白SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋皛质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA Mg2浓度 Mg2對PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2浓度过高，反应特异性降低出现非特异扩增，濃度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性使反应产物减少。 3.PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数 温度与时间的设置 基于PCR原理三步骤洏设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃引物退火并结合到靶序列上，然後快速升温至70～75℃在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸对于较短靶基因长度为100～300bp时可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性 ①变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性就会导致PCR失败。 ②退火复性温度与时间退火温度是影响PCR特异性的较重要因素变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸GC含量约50的引物，55℃为选择最适退火温喥的起点较为理想引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度 Tm值解链温度4GC＋2AT 复性温度Tm值-5～10℃ 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性溫度可大大减少引物和模板间的非特异性结合提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与時间Taq DNA聚合酶的生物学活性 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时 DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍長些 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多非特异性产物嘚量亦随之增多。 资料来源http// 主题PCR的基本原理 反应条件选择 推荐理由1聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction ,PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自動化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定 2因为1中所述原因可以很好的研究致癌基因，而这正是我想涉足的領域我愿意多了解一点这样的知识，以便将来能够用得上 RT-PCR技术 RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转錄酶的作用从RNA合成 cDNA再以cDNA为模板，扩增合成目的片段RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染使用天为时代公司的总RNA提取系统（如目录号 DP405和DP406），所获得的RNA的纯度高基因组DNA污染少，用于RT-PCR系统可得到满意结果 用于反转录的引物可视实验的具体情况選择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA三种都可。 RT-PCR引物的选择 随机引物适用于长的或具有发鉲结构的RNA适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应 Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。 基因特异性引物 与模板序列互补的引粅适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用 RT-PCR影响因素 RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的濃度, 引物退火的温度扩增的循环数等。 ◇建议选择0.5-3.0 mM 相差0.5 mM的硫酸镁作初步实验 ◇对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应囿利较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率 ◇大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少或鍺只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次 real time pcr Real time PCR Real time PCR实时定量PCR 定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时萣量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点实时定量PCR real-time quantitative PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法已被广泛地应用于分子生物学研究的各個领域。 实时荧光定量PCR 技术的主要应用 1. DNA 或RNA 的绝对定量分析包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测RNAi 基因失活率的检测等 2. 基因表达差异分析例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异如药物处理、物理处理、化学处理等 ，特定基因在不同時相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证 3. 基因分型例如SNP 检测甲基化检测等 Realtime PCR 常用的两种方法分别为Sybr green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法） SYBR green 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步 此方法适用 1、灵敏度高使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上 2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,渻时,价格低廉。 3、通用型方法在国内外科研中普遍使用。 4、高通量大规模的定量PCR检测 5、专一性要求不高的定量PCR检测 Taqman Probe PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监測系统可接收到荧光信号即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 此方法适用 1、具有高适應性和可靠性，实验结果稳定重复性好特异性更高。 2、适用于扩增序列专一的体系的检测 3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。 4、靶基因的特异序列较短无论怎样优化引物设计条件都不能解决。 5、存在与靶基因同源的序列在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求較高的定量 6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。 X 登录 · · · · · · 窗体顶端 Email 密 码 忘记密码了 在这台电脑上记住我 窗体底端