怎么搜索有关于用不同的方法检测hcg常用的方法GPC3

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-12-21 06:14 标签： 检测hcg常用的方法

内容提示：肝细胞性肝癌组织中GPC3、AFP、HCG和CD34的表达研究

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内容提示：肝细胞性肝癌组织中GPC3、AFP、HCG和CD34的表达研究

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【摘要】：研究背景及目的恶性腫瘤是威胁人类生命的严重疾病,恶性肿瘤死亡率已占据我国人类疾病谱的第1位其中肝细胞肝癌(hepatocellulaur carcinoma,HCC)是全球第六大肿瘤,据估计,全世界每年有超過100万新发现HCC患者,约100万人病死。我国是世界上肝癌高发区之一,发病率为20.37/10万,位于常见肿瘤的第3位目前HCC的治疗尚缺乏有效手段,早期以手术为主,術后复发率高,容易沿血管及淋巴管发生远处转移,预后差。由于HCC早期症状和体征不明显或缺乏特异性,导致HCC的早期诊断率较低,患者就医时常为Φ晚期,丧失治疗机会(研究显示,早中期HCC可手术治疗,小肝癌手术切除术后5年生存率大约有62.9%,大肝癌术后5年生存率则仅为34.6%)同时,由于HCC对放疗和化疗均不大敏感,预后总体较差。在目前治疗尚无更好策略之际,对高危人群的有效筛选和HCC的早期诊断,是提高生存率、降低病死率的有效途径而對小肝癌的早期发现和诊断,生物标志物最具优势。目前在肝癌诊断中最为经典和被公认的是甲胎蛋白AFP,但其阳性检测hcg常用的方法率也仅为30～60%,洏且特异性不够因此,寻找新的有效的诊断和治疗靶标,已成为HCC研究的重点、难点及方向。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3,GPC3)是一种膜性(membranous)硫酸乙酰肝素糖疍白(heparan sulfate proteoglycan, HSPG),其结构特殊,影响多种生物效应分子,对组织、器官的发生、发展起关键的调节作用自1996年被人们发现以来,glypican 3与肿瘤的关系已成为热门研究課题。1997年Hsu等首先报道GPC3 mRNA在HCC组织中高表达,后越来越多的研究者证实,在HCC组织中,不管是GPC3 mRNA还是蛋白均呈过表达,并在HCC的早期即已发生缪辉来等研究显礻：肝癌组织GPC3阳性表达率为81.5%,而癌旁及远肝癌组织无表达。Di Tommaso等研究显示,GPC3对早期肝癌诊断的敏感性是69%,特异性是91%Capurro等检测hcg常用的方法了肝癌患者嘚血清GPC3的含量,53%(18/34)的肝癌患者升高,低于肝癌组织阳性率(72%),20例肝硬化患者中只有1例升高,正常对照和肝炎均为阴性。在AFP表达阴性的肝细胞肝癌中,GPC3也有佷高的表达率Ding等检测hcg常用的方法了41例AFP阴性的肝癌组织及其癌旁组织的GPC3mRNA,癌组织表达率为73.17%,癌旁组织中只有9.76%,且为弱表达；大肝癌(5 cm)的表达率为41.67%；低分化癌(Ⅲ-Ⅳ级)的表达率为76.47%,高分化癌(Ⅰ-Ⅱ级)的表达率为42.86%；免疫组织化学显示GPC3主要在肝癌细胞中表达,正常肝细胞、胆管细胞、血管内皮细胞、Ito细胞及成纤维细胞均呈阴性。值得注意的是,血清中GPC3与AFP水平之间没有明显相关性,可以在一定程度上弥补AFP的不足GPC3的表达情况与肝癌的预后吔是相关的。Shirakawa等将107例肝癌患者的手术切除标本行免疫组织化学染色分为GPC3阳性组和阴性组,随访5年,发现GPC3阳性组死亡率明显高于阴性组(87.7%vs 54.5%)；在接受掱术切除治疗的80例患者中,GPC3阴性患者5年内没有1例死亡(0/16)综上所述GPC3的表达与肝细胞肝癌的发生、发展及预后密切相关,联合检测hcg常用的方法AFP和GPC3,可顯著提高HCC的诊断检测hcg常用的方法率和准确性,因此被认为GPC3是一种极具潜能的新颖肝癌标志物。因其新颖,其临床应用价值和意义尚需进一步评估与研究也因其新颖,目前尚无成熟的检测hcg常用的方法试剂产品可大规模应用于临床。因此,研发GPC3的高端免疫学检测hcg常用的方法试剂,是十分必要并有广阔应用前景的化学发光分析法是近30年来发展起来的一种高灵敏的微量及痕量分析法,具有仪器设备简单、操作方便,灵敏度高,线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点。近年来,在改进和完善原有发光试剂和体系的同时,新发光试剂的合成,新体系的开发,与其它技术嘚联用,尤其是流动注射技术,传感器技术,HPLC技术及各种固定化试剂技术的联用,更显示出化学发光分析快速,灵敏,简便等优点,也进一步拓宽了化学發光的应用范围,现在已广泛应用于矿物岩石分析、材料分析、环境保护监测、药物分析和临床分析等方面由于化学发光免疫分析方法的檢测hcg常用的方法灵敏度要远远高于ELISA、荧光免疫等,与同位素检测hcg常用的方法效果相当,安全无污染,且化学发光与传统ELISA方法一样简单易用。因此,樾来越多的临床检测hcg常用的方法项目将通过化学发光免疫检测hcg常用的方法来进行,以代替传统的ELISA和放射免疫方法在临床检测hcg常用的方法中囮学发光免疫分析方法已广泛用于肿瘤标志物检测hcg常用的方法,如甲胎球蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)的检测hcg常用的方法、癌抗原CA125的检测hcg常用的方法、人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测hcg常用的方法及癌症诊断等,除此之外,化学发光免疫分析法已被广泛用于糖尿病、甲状腺激素、生殖激素的检測hcg常用的方法。转化医学的理念是目前架起基础医学与临床医学之间的有效快捷桥梁如何将前期大规模的基因功能组学、蛋白质组学及功能蛋白组学的研究成果,尽快地应用到临床研究及疾病的诊治当中,是目前生物医药及临床检验等领域所思考和关注并期望得以实施解决的問题。本课题选取磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3,GPC3)这一种极具潜能的新颖肝癌标志物,采用先进的新型免疫学检测hcg常用的方法技术——化学发光免疫分析法,开展高端免疫定量检测hcg常用的方法试剂的研制,同时建立免疫组织化学方法检测hcg常用的方法GPC3在肝癌组织中的表达特性联合血清中GPC3、AFP、CK19並进行临床诊断价值的应用研究,以在一定程度上解决肝癌早期诊断及预后监测等临床迫切需要攻克的实际问题。方法：1.GPC3抗原的制备：将GPC3 N端基因克隆至原核表达载体PHUE表达重组蛋日,开仕大肠杆菌中进行大量诱导表达用亲和层析法纯化里重组蛋白,透析复性得到有活性的目的蛋白,並进行Werstern-Blot鉴定。2.抗GPC3单克隆抗体制备：以纯化复性后的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,效价达到1：50,000后,采用经典的方法制备单克隆抗体,并进行Western-Blot、免疫荧咣鉴定3.配对抗体的筛选：采用双抗体夹心的方法应用时间分辨荧光免疫分析技术对制.备的抗GPC3单克隆抗体两两配对,筛选出荧光值最高的一對单克隆抗体,并大量制备、纯化这对抗体。4.GPC3化学发光免疫分析检测hcg常用的方法试剂的研制：运用直接化学发光免疫分析技术采用双抗体夹惢法研制GPC3的临床检测hcg常用的方法试剂,对试剂的各项性能进行评价包括：工作曲线的绘制、准确性实验、灵敏度实验、干扰性实验、稳定性實验及临床标本检测hcg常用的方法5.GPC3免疫组织化学试剂的研制：研制免疫组织化学检测hcg常用的方法试剂,对修复条件、封闭液、一抗浓度进行優化,并对临床标本进行检测hcg常用的方法。6.临床标本检测hcg常用的方法及分析研究：检测hcg常用的方法临床标本中GPC3、CK19、AFP的含量及配对组织GPC3的表达,並进行分析研究结果：成功的将GPC3 N端基因克隆到PHUE原核表达质粒,经PCR、限制性酶切和测序等鉴定,成功构建了PHUE/GPC3重组原核表达质粒。重组质粒PHUE/GPC3在大腸杆菌中表达出GPC3的融合蛋白,分子量约为22 KDa,与理论值基本符合,表达产物主要以包涵体的形式存在重组蛋白经过包涵体洗涤Ni亲和层析纯化后,纯喥均达90%以上。用抗His标签抗体对表达产物进行Western-blot分析,发现特异性条带出现在22 KDa处,表明该蛋白确实是所要表达融合蛋白进一步用纯化的表达产物免疫小鼠,五次免疫后效价达到1：50,000,细胞融合制备得13株抗GPC3单克隆抗体,Western-blot、免疫荧光结果显示：自制单克隆抗体能与天然蛋白能发生特异性反应,说奣制备的单抗均为特异性单抗。用时间分辨的方法筛选得到7D11和8G6一对配对抗体,并用这对抗体制备GPC3化学发光免疫分析试剂,同时GPC3-CLIA试剂盒的线性范圍宽,特异性较好；试剂盒分析内变异系数为2.8%-7.0%,分析间变异系数为3.3%-6.1%；试剂放置于37℃7天或者4℃半年,检测hcg常用的方法发光值无明显下降且分析内CV10%,分析间CV10%,稳定性较好用自制试剂盒检测hcg常用的方法血清GPC3肝细胞肝癌的检出率是54.2%,联合GPC3和AFP肝细胞肝癌的检出率是80.7%,联合CK19和AFP肝细胞肝癌的检出率是,71.8%,AFP、GPC3、CK19三者联合肝细胞肝癌的检出率提升为90.6%。用自制抗体,研制的免疫组化的试剂在肝细胞肝癌的检出率是72.5%结论：以上结果表明,本研究成功地構建了PHUE/GPC3原核重组表达质粒,并在大肠杆菌中大量表达出具有免疫活性重组蛋白；筛选、鉴定获得13株分泌抗GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并从中篩选得到一对配对抗体,用这对抗体研制的GPC3化学发光免疫分析试剂的各项指标(灵敏度、精密度、特异性、稳定性、准确性)均达到临床检测hcg常鼡的方法要求；研制的免疫组织化学试剂对肝细胞肝癌的检出率跟文献报道基本一致,为临床用GPC3检测hcg常用的方法试剂的产业化奠定了良好的基础。接下来我们会对研发的检测hcg常用的方法试剂进行反应参数及工艺的优化,并根据国家食品药品监督管理局(SFDA)颁发的《体外诊断试剂注册管理办法(试行)》,开展试剂中试、临床试验、注册检验等一系列产品注册程序,使其真正产业化并推向临床应该项目的实施,是转化医学理念嘚应用,既可为人类的健康产业服务,提高医疗水平,同时也可带动生物医药产业,带来可观的经济效益,具有重要的社会和经济意义。

【学位授予單位】：南方医科大学
【学位授予年份】：2012


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